이 작품은 뇌 과학에 대 한 알 렌 연구소에 의해 투자 되었다. 저자 알 렌 연구소 설립자, 폴 G. 앨런과 조디 알 렌의 비전, 격려와 지원을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 동물 보호, 축산, 유전형을 수행 하기 위한 알 렌 연구소 기술 지원 직원을 감사 합니다.

유전자 변형 쥐를 포함 하는 절차는 뇌 과학에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 알 렌 연구소에 의해 승인 되었습니다. 둘 다 남성과 여성 C57BL/6 쥐 (체중 범위 10-30 g)이이 실험에서 사용 되었다. 일부 대표적인 결과 살아있는 인간 두뇌 조각에서 수집 된 데이터를 설명 합니다. Neocortical 조직 표본은 종양 제거를 위한 neurosurgeries 동안 얻은 했다. 그것은 병에 걸리는 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 overlying neocortical 조직을 제거 하는 데 필요한 했다. 정보 환자 동의 스웨덴 의료 센터의 기관 검토 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 연구 목적에 대 한 신경외과 조직의 사용에 대 한 모든 사례에서 얻은 했다.
1. 미디어와 시 약 (표 1)의 준비
참고: 솔루션 여야 한다 하 추적 금속 및 기타 불순물의 순화 된 물에서. 사용 하지 않는 솔루션 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 주에 대 한 원하는 경우 비록 솔루션 실험의 날에 갓 만든 수 것이 좋습니다. 위의 각 배합의 1 L 1-2 조각화 절차에 대 한 충분 하다. 모든 실제 솔루션은 안정적인 pH 버퍼링 하 고 충분 한 산소를 사용 하 여 이전 carbogen (95% O2/5% CO2)와 함께 포화 상태 해야 합니다. 모든 솔루션의 pH 7.3-7.4 및 osmolality 조정 되어야 한다 측정 하 고 300-310 mOsmol/kg을 조정.
<ol><li>(MM)에 NMDG HEPES 실제 준비: 92 NMDG, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 0.5 CaCl2·2H2O, 및 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH 7.3 5m 염 산의 0.5 mL + 17 mL와 함께 –7.4. 참고:이 적정 단계 적으로 수행 해야 피하기 위해 강 수; divalent 양이온의 추가 사전 그러나, 강 수 pH의 조정에 따라 생리 적인 범위를 되돌릴 수 있습니다.</li>
	<li>HEPES (mM)에서 실제 들고 준비: 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 포도 당, 2 thiourea, 5 나 하는데, 3 Na-pyruvate, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 집중 10 N NaOH.</li>
	<li>(MM)에 녹음 실제 준비: 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 24 NaHCO3, 12.5 포도 당, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O, 그리고 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH를 7.3-7.4의 몇 방울과 10 N NaOH를 집중.</li>
	<li>솔루션 스파이크에서 Na+ (2m) 준비: NaCl의 580 mg 갓된 NMDG HEPES 실제의 5 mL에 용 해. 이것은 하나의 두뇌 슬라이스 준비에 대 한 충분 한 솔루션 이다.</li>
	<li>조직을 포함 하는 데 사용할 2 %agarose 준비 합니다. Agarose 형식 1B의 2 세대 분해 ( 재료의 표참조) 그냥 끓는 때까지 PBS와 전자 레인지 x 1의 100 ml에서. 혼합, 그리고 무 균 10 cm 배양 접시에 혼합물을 부 어 응고 허용에 소용돌이 친다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 봉인된 된 비닐 봉투에 agarose 접시를 저장 합니다.</li>
	<li>재고 솔루션을 작동 하는 주 사용 마 취 준비. 2-메 틸-2-butanol의 5 mL와 2,2,2-Tribromoethanol의 2.5 g을 혼합 하 고 점차적으로 200 mL PBS, pH 7.0-7.3에에서 용 해. 사용 하기 전에 0.22 μ m 필터 재고 솔루션을 필터링 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 저장. 참고: 재고 솔루션을 작동 하는 마 취에 대 한 만료 및 폐기 절차를 결정 하기 위한 각 동물 사용 위원회 지침 및 규칙을 참조 하십시오.</li>
</ol>2입니다. 저 미 역의 설정
<ol><li>조직 기계 기계와 수술 도구 ( 재료의 표참조) 저 미 역을 설정 합니다. 기계 기계 보정, 지르코늄 세라믹 인젝터 블레이드를 블레이드 팔 빠른 접착제 접착제를 사용 하 여 연결한 다음 견본 홀더를 삽입 하 고 블레이드 긁어 하지 않습니다 보장 하기 위해 작은 차이 떠나 견본 홀더를 잎의 앞 가장자리를 정렬 금속입니다. 참고: 블레이드 가장자리 물리적으로 손상 되지 않은 경우 주 또는 심지어 많은 대 한 다시 사용할 수 있습니다 교체 하지 않고 달. 다양 한 조직 기계 모델은 상업적으로 사용할 수 있는, 많은 최적의 보정 때 우수한 성능을 제공할 수 있습니다. 이상적인 최소 z 축 편향, 직접 측정 하 고 조정 또는 경험적으로 관찰 해야 합니다.</li>
	<li>250 mL 비 커에 대 한 상수 carbogenation (가스 기관총 돌 미디어에 몰입을 통해 적용) NMDG-HEPES 실제와 얼음에 사전 오 200 mL와 함께 가득 설정 > 10 분. 참고:이 솔루션 사용 됩니다 transcardial 관류 및 단면 중 슬라이스 기계 저수지를 채우는.</li>
	<li>NMDG-HEPES 실제의 150 mL 가득 초기 뇌 조각 복구 챔버를 설정 (상수 carbogenation 유지) 챔버 32-34 ° c.에 유지 온수 물 욕조에 배치 참고: 디자인 후 슬라이스 챔버 에드워즈와 Konnerth (1992)의52 이 단계에 대 한는 것이 좋습니다. 이 챔버는 쉽게 사용할 수 있는 실험실 항목으로 만들어질 수 있다 (250 mL 비이 커, 나일론 메시 그물 세공, 50 mL 원뿔 튜브, 35 m m 플라스틱 원형 접시). 그 남아 공기의 무료 그물 조각 거품, 특히 그 조각을 플 로트 하 여 손상 될 발생할 수 있습니다 이러한 carbogen 가스 거품 돌에 의해 지속적으로 생산 되도록 주의 해야 합니다. 그물 액체 표면 아래 약 1 cm 침수 한다.</li>
	<li>들고 챔버; 뇌 슬라이스를 설정 큰 저수지에 여러 독립적인 웰 스와 디자인 좋습니다 ( 재료의 표참조). 사용까지 HEPES 실제와 따뜻한 일정 carbogenation에서 실내 온도에 450 mL로 저수지를 채우십시오. 참고: 두뇌 분할 영역 전송 됩니다 초기 복구 상공에서 electrophysiological 녹음 하기 전에 장기 저장에 대 한이 약 실에. 그 기포의 무료 조각 그물 남아 항상 되도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>조직 포함을 위한 녹은 agarose를 준비 합니다. 쿠키 커터 처럼 50 mL 원뿔 유리병의 오픈 엔드를 사용 하 여 이전 준비 접시에서 2 %agarose 블록을 잘라. 느슨하게 원뿔 유리병 뚜껑 다음 전자 렌지에 10-30 s는 agarose 그냥 녹아 때까지. 과열 하지 않습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 녹은 agarose를 부 어. Agarose 활기찬 동요와 42 ° C로 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 녹은 상태에서를 유지 합니다. 신중 하 게 녹은 agarose 성급 하 게 응고 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>전이 이번에 시원한 얼음에 slicer에 대 한 블록을 재미 액세서리를 놓습니다.</li>
</ol>3. Transcardial 관류
참고: transcardial 관류 절차 성인 동물을 작업할 때 중요 한 단계는 두뇌의 급속 한 냉각을 달성 하는 것이 중요 하다 고 낮은 나+의 뇌 주입을 통해 신진 대사를 둔화, 저 캘리포니아2 +/ Mg2 + 실제 솔루션입니다. Transcardial 관류 뇌 맥 관 구조, 시각화 및 유전자 변형 라인에 붙일 레이블된 셀 인구의 타겟팅 방해할 수 있는 autofluorescence를 감소 시키는에서 붉은 혈액 세포를 또한 제공 합니다. 그건 transcardial 관류를 생략 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>깊이 복 주입 마 취 작업 재고 솔루션의 마우스 anesthetize (1.25% 마 취의 250 mg/kg: 0.2 mL 당 10 g 몸 무게 재고 솔루션을 작업 참조 하십시오 테이블의 자료). 후 ~ 2-3 분, 발가락 핀치 반사를 평가 하 여 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다. 필요한 경우 주사 마 취 작업 재고의 볼륨을 추가 하 고 다른 2-3 분 후 발가락 핀치 반사를 재평가.</li>
	<li>미리 냉장된 250 mL 비 커 (2-4 ° C 최적입니다, 눈 녹은 냉동된 솔루션이 아닌)에서 carbogenated NMDG HEPES 실제의 25 mL로 30 mL 주사기를 로드 합니다. 25 5/8 게이지 바늘을 연결 합니다.</li>
	<li>그것의 뒤에 마우스로 forepaws 및 안정성에 대 한 뒷 발 아래로 핀. 15 cm 유리 페 트리 접시는 기본으로 잘 강화 된 실리콘 작품으로 가득합니다.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 횡 경 막의 수준에서 흉 강 측면 절 개를 확인 합니다. 좋은 위를 사용 하 여 어느 쪽 돌 심 혼 및 폐를 클리핑 방지 하기에 흉 곽을 통해 잘라.</li>
	<li>다시 핀 노출 심장 흉 곽의 중앙 부분. 좌 심 실에 30 mL 주사기의 바늘을 삽입 하 고 오른쪽 아 트리 움 마음을 종료 하려면 혈액 수 있도록 잘가 위로 잘라.</li>
	<li>수동 일정 한 압력을 사용 하 여 주사기 플런저를 우울 하 게 하 고 ~ 10 mL/min의 속도로 냉장된 NMDG HEPES 실제와 동물을 perfuse. 참고: 경우는 관류 성공적인 간 변경 됩니다 색깔 홍 색에서 옅은 노란색, 그리고 어떤 경우 명확한 종료 프로시저의 끝으로 콧구멍 체액을 관찰할 수 있다.</li>
</ol>4. 뇌의 해 부와 슬 라이 싱
<ol><li>동물을 목을 벨. 메스를 사용 하 여 머리에 피부를 열고 두개골 모자를 노출.</li>
	<li>두개골 모자를 통해 피부를 버려야 고 작은 절 개 옆에 꼬리/복 부 양쪽에는 두개골의 기본 사용 괜 찮 아 요 슈퍼 컷이 위. 기본 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 복용 등 중간까지 rostral 방향에서 이동 하는 두개골의 꼬리 등 쪽 부분에서 시작 하는 추가 얕은 상처를 확인 합니다. ' T는 최종 확인 ' 후 각 전구의 수준에는 중간에 수직을 잘라. 참고: 합니다 주의 관심의 두뇌 지구에 아무 피해를 보장 하기 위해. 특히, 한번도 거기 이어야 한다 뇌 자체에 적용 되는 어떤 압축 힘.</li>
	<li>라운드 팁 집게를 사용 하 여 파악 rostral 중간 부분에서 시작 하는 두개골과 꼬리 옆 방향으로 다시 껍질. 균열을 양쪽 모두에 대 한 반복 열고 노출 뇌 두개골 모자 등 절반을 제거. 부드럽게 미리 냉장된 NMDG HEPES 실제의 비 커에 그대로 뇌 밖으로 특 종. ~ 1 분 균일 하 게 냉각 하기 위하여 두뇌를 허용 합니다.</li>
	<li>큰 주걱을 사용 하 여 비 커 그리고 필터 종이로 덮여 페 트리 접시에 두뇌를 들어올립니다. 트림 하 고 두뇌 슬 라이 싱의 기본 각도에 따라 원하는 관심 뇌 영역을 차단 합니다. 처리 중 장기간된 산소 부족을 피하기 위하여 신속 하 게 작동 합니다. 참고: 많은 조각화 각도 수 있습니다. 정확한 차단 방법 및 슬라이스 각도 정확한 뇌 영역, 셀 유형, 그리고 회로 공부에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>두뇌 블록 접착제 접착제를 사용 하 여 견본 홀더를 부착 충분히 완벽 하 게 내부 뇌 블록을 철회 견본 홀더 내부 조각 철회. 두뇌 블록은 agarose 완전히 덮여 때까지 소유자에 직접 녹은 agarose를 붓는 다. 사전 냉각된 액세서리 재미 ~ 10 견본 홀더 주위 블록 클램프 s는 agarose는 경화 될 때까지.</li>
	<li>기계 기계에 콘센트에 견본 홀더를 삽입 하 고 적절 한 맞춤을 확인 합니다. 250 mL 비 커에서 나머지 미리 냉장, 산소 NMDG HEPES 실제와 저수지를 충분 한 산소를 되도록 자르는 동안 저수지에 거품 돌을 이동.</li>
	<li>Agarose 포함 뇌 견본 발전 하려면 마이크로 미터를 조정 합니다. 슬라이서를 시작 하 고 경험적으로 원하는 단계로 사전 속도 진동 주파수를 조정 합니다. 참고: 설정이 모두 낮은 범위에 있어야 합니다. 최상의 결과 얻으려면 단일 생산 해야 합니다 걸릴 약 20 s와 진동 한다 명백한 맴 돌아와 매우 매끄럽고 부드러운 허 밍 소음 블레이드 팔의 전달 합니다.</li>
	<li>계속 발전 하 고 300 µ m 증가 (또는 다른 원하는 두께) 뇌 영역까지 관심의 조직 부 러 뜨 리는 구분 완전히; 조각화 절차에 대 한 총 시간 15 분 미만 이어야 합니다.</li>
</ol>5. 최적화 된 NMDG 보호 복구 절차
<ol><li>초기 NMDG 복구 단계 (중요 한 단계): 단면 절차의 완료, 모든 조각을 잘라 플라스틱 파스퇴르 파이프 t를 사용 하 여 수집 하 고 150 mL 가득 미리 따뜻하게 (34 ° C) 초기 복구 챔버로 전송 NMDG-HEPES 실제입니다. 짧은 승계에서 모든 분할 영역을 전송 하 고 모든 조각 복구 상공으로 이동 됩니다 타이머를 시작.</li>
	<li>마우스의 연령에 따라 일정 스파이크에 최적의 나+ 확인 하려면 표 2 를 참조 하십시오. 참고:이 절차 뇌 조각 챔버로 나+ 의 재 소개의 제어 속도 달성 하는 실용적인 방법을 이며는 최적화는 특정 뇌 조각 챔버 형상과 저수지 볼륨 종류 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>에 제시 된 솔루션 스파이크에서 Na+ 의 지정 된 볼륨을 추가 하 여 절차 스파이크에 stepwise 나+ 를 실행 시간. 빠른 혼합을 촉진 하기 위하여 초기 복구 챔버의 bubbler 굴뚝에 직접 솔루션 스파이크에서 Na+ 를 추가 합니다.</li>
	<li>HEPES 실제 장기 보유 약 실에 실 온에서 유지 모든 분할 영역을 전송 합니다. 조각 패치 클램프 기록 실험 시작 전에 챔버를 들고 HEPES에 추가 1 시간에 대 한 복구를 허용 합니다.</li>
</ol>6. 패치 클램프 기록
참고: 다음 기본 절차 단지 제공 하는 몇 가지 실용적인 고려 사항 및 이러한 찾을 수 있습니다 다른53,54패치 클램프 기록에 대 한 상세한 프로토콜을 대표 하기 위하지 없습니다. 패치 클램프 전기 생리학 장비는이 응용 프로그램에 대 한 필요 합니다. 이것은 일반적으로 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 광학 장비 직 립 현미경의 구성 됩니다 및 형광 조명 시스템, 패치 클램프 증폭기 및 데이터 디지타이저, 동력 micromanipulator 및 현미경 플랫폼, 진동 절연, 패러데이 케이지, 테이블과 솔루션 난방 및 관류 시스템. 시료 챔버와 플랫폼 침수 슬라이스 기록을 위해 설계 되어야 한다. 다중 신경 패치 클램프 기록, 여러 앰프, 헤드 단계, 및 높은 품질 micromanipulators rig가 필요 합니다. 또한, 최상의 결과 얻으려면 rig 900 nm 적외선 대역 통과 필터를 장착 하 고 광학 구성 요소를 일치 하는 것이 좋습니다 있는 셀의 적절 한 시각화 되도록 > 50 µ m 깊은 두뇌 조각에서. Kӧhler 조명에 대 한 적절 한 정렬도 분명 시각화에 대 한 중요 하다.
<ol><li>(MM)에 세포내 피펫은 솔루션 준비: 130 K-구 루 콘, 4 KCl, 10 HEPES, 0.3 EGTA, 10 phosphocreatine 나2, 4 MgATP, 0.3 나2-GTP와 13.4 biocytin. 1 m 코 7.35에 pH 및 osmolality 285-290 mOsmol/kg 자당을 사용 하 여 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>패치 클램프 전극 두꺼운 붕 규 산 유리 모 세관;에서 준비 이상적인 패치 클램프 전극은 상대적으로 짧고 짧고 테이퍼 ~ 3-6 MOhm 가득 욕조에 팁 저항.</li>
	<li>전극 와이어 제대로 안정적인 녹음을 보장 하기 위해 chlorided 인지 확인 합니다. 이렇게 마지막 물속 여 (일반) 은색의 3-4 m m 와이어 액체 표 백제 또는 와이어 검게 될 때까지 약 30 분 동안에.</li>
	<li>솔루션 관류 오버플로가 발생 하지 않도록 유입 및 유출 일치 하도록 녹음 챔버를 통해 실제 기록 3-4 mL/분 배포 carbogenated 설정 연동 펌프를 사용 하 여 설정 합니다.</li>
	<li>단일 뇌 조각 침수 녹음 실로 전송 하 고 안전 장소 나일론 U 모양 조각 앵커를 사용 하 여 교차 문자열. 높은 전원 목표 (예를 들어, 높은 수 가늠 구멍 또는 60 X 40 X 물 침수 목표)으로 전환 하기 전에 4 X 어 목표를 사용 하 여 대상 뇌 영역을 식별 합니다.</li>
	<li>시각적으로 건강 한 목표 셀을 식별 합니다. soma에는 신경 막의 모양은 IR DIC 현미경에 의해 시각으로 패치 클램프 기록에 대 한 후보 셀의 적합성을 판단 하 사용 된다. 참고: 건강 한 신경 일반적으로 다음과 같은 기능을 전시: 수축 된도 somata, 막 가장자리, 그리고 부드러운 막 외관의 부드러운 대비를 부 어. 또한, 건강 한 세포의 대부분은 위치 > 30 µ m는 조각에 깊은 표면 신경 세포는 손상 될 가능성이 절단 수지상 프로세스. 남기고 모습을, 명확 하 게 보이는 핵 또는 '계란 튀김' 모습, 또는 매우 어둡거나 높은 대비 막 가장자리는 뉴런은 피해 야 한다.</li>
	<li>다시 채우기는 세포내 솔루션의 ~ 5 µ L로 플라스틱 패치와 전극 홀더에 그것을 로드. 피펫으로 뇌 조각 위에 녹음 목욕으로 이동 하 고 가벼운 긍정적인 압력에 있는 장애물을 제거 하. 피 펫 오프셋 0 고 막 테스트 기능을 사용 하 여 팁 저항을 모니터링 합니다.</li>
	<li>이동 대상 신경 셀 시체; 접촉 피 펫 팁 작은 보조 개는 빛 긍정적인 압력 때문에 막 표면에 형성 한다.</li>
	<li>최대한 빨리 막 보조 개 관찰 신속 하 게 긍정적인 압력을 제거 하 고 부드러운 흡입 물개 형성 촉진을 적용. 일단 피 펫 저항 증가 > 100 MOhm 예상된 휴식 막 일치 하는 수준으로 지주 명령 대상된 셀 형식에 대 한 잠재적인 설정 (-70 mV는 좋은 시작 지점).</li>
	<li>일단 팁 저항 ≥1 gigaohm에 도달, 날카로운 흡입;의 간단한 관찰을 사용 하 여 패치 피 펫 아래 막 파열 하 여 셀에 침입 하려고 '써' 기능 필요에 따라 휴식을 촉진 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 참고:-70의 지주 잠재력 mV 전압 클램프 실험 대뇌 피 질의 뉴런에 대 한 제안. 건강 한 신경 해야한다 현재 누설-100 pA 보다 더 부정적인 실험의 기간에 대 한 하지만이 부분에 셀 형식에 따라 달라 집니다. 휴식 막 잠재력은-50 보다 더 depolarized 경우 신경 분석에서 제외 될 것 이다 mV, 또는 액세스 저항 20% 이상 변경 하는 경우.</li>
	<li>
안정적인 전체 셀 패치 클램프 기록 얻은 단계 6.6-6.10을 반복 하 여 녹음에 대 한 추가 뉴런을 대상. 첫 녹음을 잃고는 기계적 장애를 피하기 위해 주의.
	<ol>
<li>100 µ m 이내 추가 뉴런 synaptically 결합 뉴런을 찾는 합리적인 가능성을 보장 하기 위해 첫 번째 신경에서 선택 합니다. 참고: 그것은 경우에 따라 여러 후보 뉴런 앞을 식별 하 고 사전 로드 하 고 미리 첫 번째 패치 클램프 기록을 수립 하기 전에 다양 한 타겟된 세포에 가까운 모든 펫 위치 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Na + 스파이크에 개선 Gigaohm 물개 형성 및 패치 클램프 기록 성공 NMDG 보호 복구 방법의 초기 버전 성인 노화 동물2,5에 대 한 특별히 설계 되었다. 일부 얼 리 어댑터는 또한 청소년 동물 뇌 조각화에이 방법론을 적용 하고자 (즉, 마우스 < 30 일). 그러나, 그것은 그 뛰어난 시각적으로 확인 신경 보존이 연령 범위에서 NMDG 보호 복구 방법으로, 달리 gigaohm 물개 형성 수 있습니다 자주 마구간, 실패 한 패치 클램프 기록 시도로 이어지는 지적 하고있다. 한 가설이 이다 NMDG 양이온 성인 뇌 조각 기준으로 청소년 뇌 조각에 갇혀 더 쉽게 인감 형성;를 방해 할 수 있습니다. 그러나, gigaohm 물개 청소년 뇌 조각 NMDG 실제 (데이터 표시 되지 않음)에 완전히 잠긴 동안에 쉽게 형성할 수 있다, 따라서 나타내는 해당 NMDG 실제 라기보다 하지 방해한 gigaohm 물개 형성.
초기 뇌 조각 복구 단계 완료에 로우 하이 나+ 솔루션에서 신속한 전환을 신경 세포 막에 손상을 원인과 perturbs 인감 형성 과정. 이것은 직관적인 주어진 Mg2 + 비율 낮은 높은 Na+, 감기-따뜻한 온도, 및 캘리포니아2 + 의 극적인 상승 전환 총칭 자발적 시 냅 스 활동의 대규모 부활 이어질. 이 금지 리바운드 단계 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌에서 reperfusion 상해 다음 허 혈 성 모욕을 거울 것입니다. 따라서, 추가 Na+ 농도 NMDG 보호 복구 보육 실에서의 고도 천천히 점진적 절차 나+ 스파이크에 통합 되어 초기 복구 단계에서 신경 막 손상 완화 그리고 reproducibly 정확한 타이밍으로 상승. 원래 보호 복구 절차에서 온도 나+ 상승 및 캘리포니아2 +/Mg2 + 비율 상승의 임시 분리 도움이 됩니다. 하지만 또한, 절차 나+ 스파이크에 extracellular 나+ 농도 작은 증분 증가 초기 시간 포인트 및 그로 인하여 뇌 조직 affording 늦은 시간 포인트 향해 큰 증가 더 나은 상승 없음+ 수준에 맞게 기회. 이 절차는 점진적 솔루션 exchange 대신 제어 관류 펌프 또는 중력에 의해 물방울 라인 나+ 수준에 일정 한 증가에 지도 하 고 유입 및 유출 슬라이스 챔버의 오버플로가 발생 하지 않도록 주의 해야. 특히,이 나+ 에서 스파이크에 절차 슬라이스 챔버에 솔루션의 osmolality 점차적으로 상승 조각 정상 osmolality 솔루션, 반환 됩니다 있지만이 부정적인 슬라이스 상태를 영향을 받지 않았다 하기 전에 몇 분 동안 또는 패치 클램프 기록 성공. 높은 osmolality 절단 솔루션 이전 midbrain 슬라이스 준비에 대 한 더 나은 것이 임시 패치 클램프 기록57,58, 따라서 시연에 대 한 도파민 뉴런을 보존 하기 위해 사용 되었습니다. hyperosmolality는 어떤 상황에 도움이 될 수 있습니다.
NMDG 보호 복구 방법 및 점진적 나+ 를 결합 하 여 최적화 된 절차를 구현 하 여 스파이크에 단계가 뇌 조각 방법론의 유틸리티 성숙한 성인 동물 나가를 통해 청소년을 충당 하기 위해 확장 되었습니다. 이 업데이트 된 프로토콜은 이제 단일 최적의 NMDG 실제 수립 및 절차를 사용 하 여 동물의 넓은 범위에 적합. 필요한 경우, 절차 나+ 스파이크에 점차적으로 더 이상 지연 또는 느린 시간 과정 오래 된 동물에서 뇌 조각의 생존 능력을 향상 시키기 위해 적용 될 수 있으며 권장된은 스파이크에 따라 일정의 기본적인 가이드를 제공 하는 우리 동물의 나이 ( 표 2참조). 우리가 다양 한 응용 프로그램에 대 한 적절 한 기본 프레임 워크를 제공 하는 동안 더 생존 및 성인 및 노화 동물에서 뇌 조각의 수명 향상을 위한 추가적인 고급 단계를 탐험 수 있습니다. 예를 들어 티 복원이 점에서 특히 효과적 전략과2,6설명 되어 있는 대로 실행 될 수 있다.
도전 하는 실험에 대 한 처리량을 개선 패치 클램프 기록에 의해 시 냅 스 연결의 분석은 성공의 높은 신뢰성을 달성 하기 위해 신경 구조와 기능 둘 다의 우수한 보존을 필요로 하는 까다로운 응용 이다. 동시에 기록 하는 뉴런의 숫자로 올라간다 선형, 기술 난이도 위에 선형 올라간다. 실패의 가장 빈번한 원인 중 하나는 하나 이상의 대상된 셀에 양식 적절 한 gigaohm 물개를 및 수많은 실패 모드, 있다. 이 극적으로 진행, 3 때 특히 속도가 느려질 수 또는 더 많은 뉴런을 동시에 기록 합니다. 빠른 찾기와 일치 gigaohm 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법으로 형성 시간 인감, 유전자 변형 두 성인 성공률 및 다중 신경 패치 클램프 기록 실험의 처리량 표시 개선 했다 마우스 뇌 조각 고 인간의 신경외과 뇌 조각. 향상 된 효율은 거의 확실히 더 신속 하 고 신뢰할 수 있는 gigaohm 물개 형성 및 조각이 프로토콜의 향상 된 신경 보존에 기인. 이 프로토콜은 명시적으로 패치 클램프 기록 응용 프로그램에 대 한 혜택에 초점을 맞추고, 비록 유사한 이득은 뇌 조각 생존 능력은 최고 이다 다른 도전적인 실험 응용 프로그램 예상 됩니다.

급성 뇌 슬라이스 준비 신경 과학에 필수적인 실험 모델 시스템입니다. 대략 세기의 절반,이 플랫폼은 다양 한 해부학 적 뇌 영역 및 동물 종 살아있는 뇌의 동적 기능 연구 활성화. 인지 의도 한 응용 프로그램이 생화학, 기능적인 화상 진 찰, 형태학, 생리학, 최적의 무결성과 슬라이스 조직의 생존을 보장 하기 위해 매우 중요입니다. 그것은 따라서 탁월한 청소년 설치류 두뇌 슬라이스 준비 (즉, 마우스에 대 한 출생 후 하루 30 미만) 날짜를 가장 선호 되었습니다. 충분히 건강 한 뇌를 얻기에 있는 어려움 성숙한 어른에서 조각 하 고 동물 노화 대부분에 대 한 강력한 도전을 입증 성숙 뇌의 기능적인 건축을 공부에 대 한 심각한 한계를 부과 했다. 이것은 특히 패치 클램프 기록, 우수한 형태학 및 기능 보존을 요구 하 고 확인 된 단일 뉴런의 상세한 본질적인 속성과 시 냅 스 특성화를 위한 불가결 한 기술에 대 한 사실. 지난 몇 십년에 대 한 패치 클램프 electrophysiologists의 대다수는 건강 한 두뇌 조각에서 청소년, 그리고 훨씬 덜을 준비 하기 위한 낮은 나+ 실제 자당 대체1 을 사용 하 여 '보호 절단' 방법에 의존 해야 범위, 젊은 성인 동물입니다. 이 방법은 수동 나+ 유입 및 후속 물 항목 및 셀 슬라이스 절단 단계 동안 붓기는 주된 모욕 뉴런의 가난한 생존에는 특히 그 신경에 위치한 대 한 전제에 기반으로 합니다 표면 층 블레이드 운동에서 직접 외상을 유지할 가능성이 높습니다. 그러나, 보호 절단 방법 아직도 구현 특정 실제 배합에 성숙한 성인 동물에서 뇌 슬라이스 준비에 대 한 원하는 수 많은 나뭇잎.
이 문제에 대 한 간단 하지만 효과적인 솔루션 되었습니다2,,34,,56 을 설명 하 고 '보호 복구' 뇌 조각 방법 되 나. 이 메서드의 원래 버전 사용 NMDG 대체 실제 NMDG가 가장 다양 하 고 효과적인 다양 한 다른 후보 나트륨 이온 대체 (자당, 글리세롤, 콜린, 트리 스 포함) 들로 식별 합니다. 미디어 배합 HEPES 뇌 조각 부 종에 저항 하 여 강한 pH7, 버퍼링를 제공의 추가 산화 스트레스 (표 1)의 해로운 효과 중화 하는 보충의 추가 의해 더 강화 되었다. 그것은 경험적으로 초기 복구 인큐베이션 낮은 나+, 낮은 캘리포니아2 +에 그리고 높은 Mg2 + NMDG 실제 필요 하 고 충분 했다 성인 뇌 조직을 자르는 직후 신경 향상을 결정 했다 뇌 영역, 세포 유형, 및 동물 연령대3,,56의 넓은 범위에 보전.
특히, 무엇 지금 보호 복구 방법 별명의 이전 화신은 문학1,,89,10,11,12, 에서 찾을 수 있습니다. 13비록 완전 한 잠재력에 대 한 성숙한 성인 아니었다 노화 동물 뇌 조각과 패치 클램프 기록 인식 또는이 이전 작품에서. 또한, nuanced 절차 유사 계속 특정 실험적인 응용 프로그램4,14,,1516지원 등장 하. 이러한 수많은 연구 그룹의 작품의 집단 시체는 향상 된 조직 보존의 보호 복구 방법의 견고성에 높은 자신감을 부여. NMDG 보호 복구 방법은 이제 널리 채택 되었고 동물 뇌 슬라이스 준비를 이용 하 여 수많은 출판된 연구 연구에서 구현. 이러한 급성 슬라이스 연구 스팬 neocortical3,,1718, hippocampal15,,1920,21, striatal22 , 23 , 24, midbrain25,26,27,,2829, 그리고 hindbrain30,,3132, 33 , 34 지역, 그리고 다양 한 신경 전달 물질 neuromodulator 형식과 glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 포함 하 여 ,36, dopaminergic24,29,,3738, 해14,,3738, 39, noradrenergic40및28 neurotransmission serotonergic27,. 방법은 또한 유전자 변형 동물3,39 에서 또는 vivo에서 바이러스 주사17,27, 다음 파생 된 조각에 신경 활동의 optogenetic 제어에 적합 28,40,41,,4243, 잘 기능 캘리포니아2 + 신경 활동2,44의 영상으로 ,,4546. 단기적인이 소성4,,4748 및 다양 한 형태의 장기 소성16,,3548 의 분석 되었습니다. 보고. 최근 연구에서 성숙한 성인 마우스 두뇌 분할 구성49 를 기록 하는 octopatch를 사용 하 여 시각 피 질에서 시 냅 스 연결의 광범위 하 고 체계적인 검색을 촉진 하기 위하여 NMDG 보호 복구 방법을 적용-강력한 유틸리티 및이 방법의 견고성의 데모. 보호 복구 방법 있다도 등, 맥 관 구조 및 대뇌 피 질의 뇌 조각50, 패치 클램프에서 기록에 pericytes의 향상 된 보존 이전 뜻하지 않은 실험적인 문맥에서 성공적으로 적용 된 1-1.5 년 오래 된 Alzheimer의 질병 마우스 모델20에는 성인 뇌 조각 수용 체 밀매 분석 결과51interneuron 인구를 이식.
다음 프로토콜 뇌 슬라이스 준비 급성 뇌 조각의 생존 능력을 개선 하는 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법 구현에 대 한 단계별 절차를 설명 합니다. 복잡 한 다중 신경 패치 클램프 실험 젊은 성인 유전자 변형 마우스 뇌 조각에 성숙한 성인 기록에 대 한이 방법론의 명확한 혜택의 데모 뿐만 아니라 향상 된 신경 보존에 대 한 원리는 설명 신경외과 뇌 조각입니다. 다음 프로토콜 성인 환자에서 파생 된 인간 신경외과 표본에 관해서는 더 이상의 세 일에서 마우스 뿐만 검증 않았습니다.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Vibrating tissue slicer (recommended)</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anesthetic component 1</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Anesthetic component 2</td></tr><tr><td>Curved blunt forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Fine dissecting scissors (supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Large heavy duty scissors 7&#039;&#039;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Metal spatula</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>brain slice holding chamber</td></tr><tr><td>nylon netting&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>Pyrex glass beakers (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>35 mm plastic dish, round</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>Gas diffuser stones (10 &amp;micro;m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>For constant carbogenation (fine bubbles)</td></tr><tr><td>Agarose Type I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>For embedding brain specimens</td></tr><tr><td>Micro loader tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>For filling patch clamp electrodes</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>For making a custom dissecting platform</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipets 3 mL graduated</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>For slice transfer</td></tr><tr><td>Zirconium ceramic injector blades</td><td>Cadence Specialty Blades</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr><tr><td>KG-33 borosilicate glass capillary w/filament</td><td>King Glass Company</td><td>custom quote</td><td>ID: 0.87mm, OD 1.50mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Phosphocreatine disodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Heated water bath (2.5L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Filter paper rounds</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>10X Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>25 5/8 gauge needles</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Thermomixer (w/1.5 mL tube block)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>To keep agarose molten&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparation of acute brain slices using an optimized n-methyl-d-glucamine protective recovery method

이 프로토콜은 N에 실용적인 가이드-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 많은 최근의 연구 신경 보존 및 전반적인 뇌 조각 생존 능력 강화를 위한이 방법의 유틸리티를 확인 했습니다. 얼으로이 기술의 구현 동물, 뇌 영역, 세 종류의 넓은 범위에 걸친 다양 한 실험적인 응용 프로그램을 사용 하 여 뇌 기능에 대 한 자세한 조사를 촉진가. 단계는 패치 클램프 전기 생리학에 대 한 건강 한 뇌 슬라이스를 안정적으로 최적화 된 NMDG 인공 척수 (실제) 미디어 수립 및 향상 된 절차를 사용 하 여 보호 복구 뇌 조각 기술 수행에 대 한 설명. 이 업데이트 방법에서는 속도에 상당한 개선을 관찰 하 고 gigaohm의 신뢰성 밀봉 대상된 패치 클램프 실험 도전 촉진 함으로써 우수한 신경 보존을 유지 하면서 녹음 하는 동안 형성 실험적인 응용 프로그램입니다. 대표 결과 neocortical 두뇌 조각에서 시 냅 스 연결 젊은 성인 유전자 변형 생쥐와 성숙한 성인 인간의 신경외과 표본에서 준비 하는 여러 신경 패치 클램프 실험 분석 결과를 기록에서 제공 합니다. 또한, 뇌 조각화의 최적화 된 NMDG 보호 복구 방법 모두 청소년 및 성인 동물, 따라서 원래 방법론의 한계를 해결와 호환 됩니다. 요약 하자면, 다양 한 수 종과 우수한 생존 능력 및 조직 보존을 달성 하는 연령대에 걸쳐 단일 미디어 수립 및 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌를 구현할 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method at JoVE.com

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

45.8K 조회수.  Allen Institute for Brain Science. 이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

비디오: Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

연구

신경과학

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

뇌 회로의 비 침습적 단절에 대한 표적 신경 부상

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

경미한 외상성 뇌 손상의 깨어 있는 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 시냅스 가소성의 변화 평가

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...