Name: visualization of twitching motility and characterization of the role of the pilg in xylella fastidiosa
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
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이 연구는 미국 농무부, 농무부 농업 연구소 (Agricultural Research Service)에 의해 지원되었다. 이 책에서 무역 이름 또는 상용 제품은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 언급하고 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회 제공 및 고용주입니다.

1. 세균 콜로니의 주위 프린지 <ol><li> X를 성장 fastidiosa (Xf를) 테메 큘라 야생형 (22), pilG 삭제 돌연변이 PD2 매체 한천 플레이트 25에서 28 °에 (이전에 염색체 기반 유전자 보완 전략 (24) 기술 사용) (이전에 설명한 삭제 전략 (23)를 사용하여) Xf를 ΔpliG, 그 보완 XfΔpliG -C 5~7일에 대한 C. </li><li> 15 분 동안 121 ° C (249 ° F)에서 물에 오토 클레이브 셀로판 (1 × 1cm 2). , 셀로판의 한 조각을 들고 빈 페트리 접시에 셀로판의 한 구석을 터치하여 물기를 조심스럽게 한천 표면과 공기 건조의 15 % 이상 셀로판을 배치합니다. </li><li> 개별 X를 데리러 무균 한천 플레이트에 한천 표면의 15 %에 중첩 셀로판의 살균 장에 둥근 이쑤시개와 자리 세포 멸균와 fastidiosa 식민지. 접시를 품어2-3 일 동안은 28 ℃에서의. </li><li> 2 배 대물 렌즈와 해부 현미경 10 배 접안 렌즈를 사용하여 식민지의 가장자리의 형태를 검사합니다. 식민지 주변의 주변 프린지 사진. </li></ol> 2. 현미경과 미세 유체 흐름 챔버 <ol><li> 마찬가지의 포토 리소그래피 절차를 사용하여 제조하는 마이크로 유체 장치는 이전에 설명 5,18. 표준 리소그래피 방법을 이용하여 마스터 (26)의 실리콘 웨이퍼 상에 컴퓨터 보조 설계 소프트웨어와 4 개의 병렬 채널을 설계한다. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과 실리콘 웨이퍼 마스터에서 미세 유체 챔버를 만듭니다. 실리콘 웨이퍼 위에 마스터 비중 합 PDMS를 부어 1 시간 동안 60 ° C에서이를 경화. 웨이퍼 마스터에서 PDMS 복제를 벗겨과 유리 커버 슬립의 같은 크기로 22mm X 40mm로 블레이드와 PDMS 복제 트림. </li><li> PDMS의 복제, 유리 커버 슬립 (22 × 40 ㎜ × 2) 및 microsc 폭로2 분 27 30 W의 공기 플라즈마에 OPE 슬라이드 (51 X 76mm 2). 샌드위치 유리 커버 슬립과 마이크로 FL uidic 챔버를 구축 할 수있는 유리 현미경 사이의 PDMS의 몸. </li><li> 패터닝 된 채널의 각 단부에서 PDMS 관통 구멍 (5.5 mm 직경)을 뚫는다. 12-20cm 길이로 실리콘 고무 튜브를 잘라. PDMS의 복제본의 각 채널의 개방 단부에 실리콘 고무 튜브의 일단 (외경 5.1 mm, 내경 2.1 mm, 0.8 mm의 벽)를 넣고 1 시간 동안 60 ℃에서 비중 합 PDMS로 밀봉. </li><li> 플라스틱 루어 커넥터의 가시 끝에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 알루미늄 박으로 조립 된 미세 유체 챔버를 감싸고 20 분 동안이를 오토 클레이브. </li><li> X.의 균체를 모아서 스크래핑을 통해 fastidiosa 야생형, 돌연변이 Xf를 ΔpliG, 보완 XfΔpliG -C는 일회용 접종을 사용하여 PD2 매체 판에서 반복합니다. 세포 밀도를 조정PD2 브로스 600 nm에서 0.05의 광학 농도에 앞서 23 바와 같이. 1 ML의 기밀 주사기에 박테리아 세포 솔루션을 수집합니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 미세 유체 장치를 탑재합니다. PD2 국물을 포함하는 5 ML의 기밀 주사기에 주입 관을 연결합니다. 주사기 펌프 5 ml의 기밀 주사기를 장착한다. </li><li> 폐기물 저장 용기에 배출 튜브를 연결합니다. 0.2 μL 분의 중간 유량을 유지, 30 분 -1 시스템을 안정화시키기 위해. </li><li> 박테리아 세포 솔루션을 포함하는 1 ml의 기밀 주사기에 사이드 입구 튜브를 연결합니다. 채널에 도달 할 때까지 고무 호스를 통해 박테리아 세포 용액을 플래시. 챔버의 사전 이미지 캡처에 언 바운드 세포를 세척하기 위해 0.2 μL 분의 매체 유량 -1 또 다른 30 분 동안을 유지한다. </li><li> 빛을 제어 할 현미경 분야 조정 부분 아래 현미경 셔터를 탑재. 셔터 공동으로 셔터를 연결ntrol 시스템 및 컴퓨터 셔터 제어 시스템을 연결한다. </li><li> 현미경의 비디오 포트에 디지털 카메라를 장착하고 컴퓨터에 연결합니다. 메뉴에서 &quot;셔터&quot;기능을 선택, 시간 경과 기록 작업 소프트웨어를 실행하고 소프트웨어와 셔터에 연결을 설정하기 위해 소프트웨어에서 자동으로 기본값으로 설치 셔터를 인식하고 있습니다. </li><li> 자동 소프트웨어 기본 촬상 장치로서 디지털 카메라를 인식 소프트웨어와 디지털 카메라와의 통신을 설정하는 저속 기록 소프트웨어 메뉴에서 &quot;디지털 카메라&quot;기능을 선택한다. </li><li> 20X 위상차 광학을 사용하여 채널들 중 하나에있는 박테리아 세포를 찾은 후, 촬상 전의 40X 대물 렌즈로 전환. </li><li> 현미경에서 이미지를 수집하기 위해 메뉴에서 기본 매개 변수를 사용하여 &quot;이미지 수집&quot;기능을 선택, 시간 경과 레코딩 소프트웨어를 실행합니다.다음으로, &quot;저속 획득&quot;기능을 열고 6-24 시간은 X. 연축의 운동성을 관찰하는 실험이 필요에 따라 지속 기간 30 초 5,18,28에 시간 간격을 설정 fastidiosa 5,18,28. 시간 경과 기록 작업을 시작합니다 &quot;OK&quot;를 클릭합니다. 선택 녹음을 마친 후 컴퓨터에서 대상 폴더에 이미지를 쌓아 &quot;다른 이름으로 저장&quot;메뉴에서 &quot;스택 기능&quot;을 클릭합니다. </li><li> 여러 채널의 경우, 6 시간 동안 첫 번째 채널에서 매 30 초 시간 경과 이미지를 캡처합니다. 표적 세포를 찾기 위해 다음 채널로 현미경의 대물 렌즈를 이동. 실험은 네 개의 채널을 이용하도록 설정되어있는 경우, 네 개의 채널이 순차적으로 각각의 이미지를 캡쳐하도록 전술 한 바와 같이 저속 기능을 반복한다. 한 세 가지로 일 연속 시간 경과 이미지 캡처를 계속합니다. 모든 실험은 실온 (23 ± 2 °의 C)에서 수행 하였다. </li><li> 에 시간 경과 이미지를 컴파일시간 경과 기록 영상 소프트웨어를 사용하여 비디오 파일. 실행 시간 경과 레코딩 소프트웨어, 메뉴에서 &quot;스택 기능&quot;을 클릭하고 컴퓨터에서 누적 된 파일을 열 &quot;오픈 스택 기능&quot;을 선택합니다. </li><li> 모든 이미지를 선택하고 &quot;AVI&quot;출력 형식을 선택, 스택 모듈에서 &quot;영화 만들기&quot;기능을 시작합니다. 컴퓨터의 대상 폴더에있는 동영상 파일을 저장하기 위해 &quot;다른 이름으로 저장&quot;을 클릭합니다. </li><li> 컴퓨터에 대상 폴더에서 컴파일 된 영화를 선택하고 재생합니다. 그리고, 상기 생성 된 영상 파일에 박테리아 세포의 운동성 경련 활성의 결과 시각화를 통해 단일 ​​세포의 운동성을 관찰한다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

본 연구에서는 X의 모션 동작을 특징으로하는 fastidiosa PilG 돌연변이 Xf를 ΔpilG와 새롭게 디자인 된 다수의 병렬 나노 채널 마이크로 FL uidic 챔버에서의 보완 XfΔpilG- C 균주. 새롭게 디자인 된 마이크로 FL uidic 챔버는 하나의 50 μm의 넓은 채널 (18)과 이전 디자인에 비해 폭이 100 μm의 나노 채널과 최대 4 개의 병렬 챔버를 가질 수 있습니다. 개선 된 넓은 나노 채널은 미디어 흐르는 균체의 도입을 용이하게한다. 또한,이 마이크로 유체 챔버 구축하고 조립) 간단한 일이고; 2) 상대적으로 저렴; 3) 실험 요구 사항 변화에 쉽게 적용. 그 결과,이 챔버 설계 품종 하의 박테리아 세포의 움직임의 장기간 관찰 실험 미세 환경을 허용한다. 전류 throu의 흐름 FL 안정화GH 마이크로 FL 채널 uidic 실험 다양한 환​​경 하에서 박테리아 세포의 운동성의 관찰 온전한 흐르는 마​​이크로 FL uidic 미세 환경을 만드는 중요한 단계이다. 종래 균체의 도입 매체와 마이크로 FL uidic 챔버 플러싱 및 연결 튜브는 상기 챔버에서의 유동을 안정화시키는 중요한 단계이다. 그러나, 플로우의 높은 속도는 상기 챔버의 과정에서 세포를 유지하지 않고 챔버로부터 균체를 세척한다. 마이크로 FL uidic 경로를 통하여 흐르는 매체의 적절한 속도로 시린지 펌프를 사용하여 조절 될 필요가있다. 이 연구에서의 실험 동안 흐르는 설정하고 -1 분, 적어도 30 분 전에 채널로 균체를 도입 0.2 내지 1 μL로 펌프에 의해 안정화. 세포를 마이크로 uidic FL 채널로 도입 된 후, 배지 FL 흐름 0.2 μL의 m로 유지-1 30 ~ 60 분 시스템을 안정시키고 nonattached 세포를 제거하기 위해. 이 흐름을 안정화하고, 박테리아 세포의 움직임을 관찰하기 위해 투명한 배경을 유지하는 것이 매우 중요하다. 이미지는 과학 RM에게 0.2 μL 분 -1 일정한 흐름 속도를 유지 도입 된 세포의 꿈틀 운동성 활동을 사기 위해 매 30 초를 붙 잡았다. 실험 챔버의 균체의 수집을 필요로하는 경우, 세포는 점차 주사기 펌프 속도를 조정하여 0.2 μL 분 110 -1에서 미디어의 FL 흐름 속도를 증가시킴으로써 플러시 될 수있다. 마이크로 FL uidic 챔버에 박테리아 세포 활동은 40X 위상차 광학 이미징 소프트웨어에 의해 제어 된 디지털 카메라로 촬영 경과 이미지를 사용 도립 현미경을 통해 평가되었다. 유속 및 촬상을위한 시간 간격은 experim에 따라 조정될 수있다ental 요구 사항. 중간 유량을 0.2 μL로 설정 분 -1 시간 경과 화상이 pilus 매개 세균 세포 매 30 초에 기록하지만, 대부분의 경우에는 속도가 흐른다. 매체 FL 흐름 율이 0.1 μL 분으로 증가되는 경우, 다른 경우에 -1의 실험 과정에서, 균체의 동작을 매 10-15 초 따라서 촬영 이미지가 기록 될 것이다. 시간 경과 이미지는 6-24 시간의 기간 동안 매 30 초를 찍은 각 시험 균주에 대한 소스 이미지 파일로 저장 하였다. 동영상은 다음 돌연변이 및 야생형 사이 motilities을 꿈틀에 대비 표현형을 나타낸 각 변형에서 6-8 시간에서 촬영 한 이미지에서 준수하고 / 균주 (기업 V1, V2, V3)을 보완합니다. 거시적 평행 판 FL 흐름 챔버를 통해 나노 마이크로 FL uidic 챔버 장치의 중요성은 움직임의 직접 검사와 노래의 집계를 포함박테리아의 제작 세포. 저렴한 비용으로 5 낮은 시약 및 샘플 볼륨 요구 사항 외에도, 마이크로 FL uidic 챔버의 장점은 세균의 문화와 플로리다 UID FL 흐름 속도를 통해 정확한 제어를위한 FL 흐름 미세 건설의 용이성이다. 다중 병렬 채널 분석을 위해 호환 가능한 데이터를 제공하는 하나의 실험 설정에서 차동 균주의 관찰을 허용합니다. 극 필리와 박테리아의 편모 독립적 꿈틀 운동성이 나노 마이크로 FL uidic 챔버의 분석에 특히 적합하다. 그러나,이 마이크로 FL uidic 챔버 박테리아의 이동은 일반적으로 너무 빠르게 임의의 방향을 나타내고있는 편모 의존 세균 운동 덜 적합하다. 이 제한은 때때로 analy 위해 1 시간 동안 1 초 내지 2 시간의 경과 촬상 레이트 0.05 μL 분에 매체의 유량을 조정 -1 변화에 의해 손상 될 수있다나노 규모의 환경에서 편모 매개 세균의 움직임을 ZE. 여기에서 사용 된 미세 유체 챔버 장치는 체외에서 모션 행동에 대한 책임 PilG의 기능 평가를위한 직접 시각적 인 증거를 제공합니다. 또한이 연구는 또한 꿈틀 운동을 통해 세포 응집에 셀 X에서 신호 및 병원성, biofilm 형성에 필수적인 것을 알 수 fastidiosa. 미세 유체 장치에 의해 운동성을 꿈틀 박테리아의 시각화는 쉽게 다른 분석 방법에 의해 측정되지 박테리아의 행동과 관련된 유전자 기능을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 다른 세균 시스템에 적용될 수있다. 마이크로 유체 챔버 장치는 세포 - 세포 부착, 세포 집합체, 동작 패턴 및 생물막 형성과 연관된 박테리아 세포의 생리 학적 거동을 특성화하기위한 플로우 시스템을 제공한다.

Xylella의 fastidiosa가 포도에서 피어스 질환 (비 티스 VINIFERA L.) 1, 2, 3을 포함하여 경제적으로 중요한 작물 질환들을 유발하는 그람 - 음성 비 flagellated 병원성 박테리아이다. 이는 박테리아 물 전도성 목부에 한한다 선박. 소문의 감염은 목부의 선박과 물 부족의 결과와 영양 결핍 (3)의 막힘이 발생합니다. 성공적인 정착 식물 (3)의 나머지 감염의 초기 위치에서 이동하는 박테리아의 능력에 달려있다. X. 특징으로 한 극성 타입 IV의 필리 (4)의 연장, 첨부 한 후퇴 통해 편모 독립적 박테리아 이동 수단이되어 운동성 경련 fastidiosa 5,6,7. 경련 운동성 레이저 핀셋 및 원자 힘 현미경 (AFM) 8,9,10에 의해 관찰되었다. 이러한 기술을 이용하여 t매혹적인의 motilities는 N.의 유형 IV의 pilus에 의해 생성 임질과 P. 녹농균은 플로리다 uorescently 라벨 필리 현미경으로 그들의 움직임을 포착 특징으로했다. 두 방법은 개별 박테리아의 접착력 상술되었지만, 절차는 복잡하고 시간 소모적 9,10이다. 마이크로 FL uidic 챔버 장거리 개별 셀의 이동뿐만 아니라 박테리아 세포 5,6- 작은 응집체를 관찰 하였다. 이 챔버는 시간 경과 영상 녹화 시스템 11,12,13,14 통합 접시에 미세 나노 채널로 설계되었다. 마이크로 uidic 챔버 장치 박테리아의 이동 동작 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구 몇 가지 장점을 제공 FL : (ⅰ)는 다중 채널 기능이 통합 된 플랫폼을 제공한다; (ⅱ)는 모션 및 박테리아의 나노 크기 특성의 단셀의 집합체를 검사 할 수있다; (ⅲ)이 직접 m 가능박테리아 세포 및 시간 경과 분석 icroscopic 영상 기록은, (ⅳ)는 마이크로 환경에서 박테리아의 개인 및 / 또는 인구의 장기 공간 및 시간 관찰을 제공한다 (V) 채널에서 배양액의 유량을 정확하게 제어 할 수 있으며, 배양액 (VI)의 매우 작은 양 (1 ml)을 각각의 실험에 대해 요구된다. 최근 마이크로 FL uidic FL 흐름 시스템은 다양한 미세 환경 14,15,16에서 박테리아 세포의 행동을 조사하기 위해 사용되어왔다. 접착 및 E.의 표면에 부착 대장균 (15), X. fastidiosa 16 및 Acidovorax 유리 표면에 14 마이크로 FL uidic 챔버를 이용하여 평가 하였다 citrulli. Acidovorax의 citrulli의 유형 IV의 필리에 의해 매개 집계 및 바이오 Fi를 필름 형성 (14)를 분석 하였다. A.의 또한, 움직임 citrulli는 플로리다 흐름 C 관찰onditions는 타입 IV의 필리가 식민지에서 중요한 역할을 할 수 있음을 입증하고 A.의 확산 수액 FL 흐름 조건에서 목부 선박에 citrulli. 녹농균 및 X의 꿈틀 motilities fastidiosa 세포가 성공적으로 미세 유동 챔버 5,6,17에 유체 전류에 대해 관찰되었다. 타입 IV pilus는 X의 pilB 및 pilQ 돌연변이 결핍 fastidiosa는 깊이 마이크로 FL uidic 장치 5,6,18에서 플로리다 유동 조건에서 운동성을 꿈틀의 속도를 변경하는 것으로 밝혀졌다. 마이크로 FL uidic 장치 세균 부착 및 운동성 실시 연구 마이크로 FL uidic 챔버들은 시험 관내에서 필리 매개 세균의 경련 운동성 및 이동 분석에 특히 적합한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세포 - 세포 부착, 응집 집락 내를 용이 경련 매개 이동기구를 설명호스트는 결국 전신 감염으로 이어질. X의 필 - 열병합 오페론 fastidiosa는 인코딩 신호 전달 (20) 경로 pilG, PILI, pilJ, 알약, chpB 및 chpC이 포함되어 있습니다. 횡단 chemoreceptors는 주변 세포질 도메인에 화학적 자극을 결합하여 궁극적으로 세균 꿈틀 운동성을 제어하기 위해 자신의 세포질 부분에 신호 캐스케이드를 활성화합니다. X의 필 - 열병합 오페론에서 fastidiosa하는 포스 포 셔틀 단백질 PilG는 최 회장에 동족체이다. E.에서 대장균 및 P. 녹농균은 최은 편모 단백질 모터 (19), (21)와 상호 작용 화성 시스템에서 응답 레귤레이터이다. X의 독성을 향해 필 - 열병합 오페론의 기여 있지만 fastidiosa는 환경 신호에 응답하고 X의 규제 / 모터 유형 IV의 필리에, 최근에 화성 오페론에 pilG의 역할을 (20)을 조사 하였다 fastidiosa는 UNC입니다리어. X의 꿈틀 운동의 활동에 화성 레귤레이터 pilG의 통찰력을 규명하려면 fastidiosa, 마이크로 FL uidic 챔버는 X의 꿈틀 운동성을 평가하는 데 사용됩니다 fastidiosa. X.의 fastidiosa의 pilG은 삭제 돌연변이 Xf를 ΔpliG, 보완 변형 XfΔpliG -C 및 시험 관내에서의 야생형의 표현형을 비교하는 것을 특징으로한다. 결과는 X의 경련 운동성 pilG의 역할을 강조 fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biology materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;X. fastidiosa (Xf)&lt;/em&gt; Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2004 &lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; deletion mutant &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007 &lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; complementary strain &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;-C&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 1998 &lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Physical materials and equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable inoculating loops</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>quantitative procedures such as bacterial collection</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 digital camera</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Image, video recording and measurement&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tubes line</td><td>Edgewood, NY</td><td>#T4300</td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Plastic luer connectors</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Syringe pumps</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>The flow rate can be adjusted while the pump is running.</td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>Provide the flowing broth</td></tr><tr><td>Inverted Olympus IMT-2 microscope</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Image observation and recording</td></tr><tr><td>SPOT-RT digital camera</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Image, video recording and measurement</td></tr><tr><td>Microscope Shutter</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>#LS2T2</td><td>Control camera&amp;rsquo;s exposure time</td></tr><tr><td>Microscope Shutter Control system</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver</td></tr><tr><td>MetaMorph Image software</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Real-time super-resolution image processing&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

visualization of twitching motility and characterization of the role of the pilg in xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa의 식물의 경제적으로 중요한 질환들을 유발하는 그람 - 음성 박테리아 이외 flagellated이다. 꿈틀 운동성은 X를 제공합니다 fastidiosa 장거리 내 공장 이동 및 정착을위한 수단이 X에서 병원성으로 기여 X의 fastidiosa. 꿈틀 운동 fastidiosa는 타입 IV의 필리 운영하고 있습니다. Xylella의 fastidiosa의 유형 IV의 필리는 pilG, 신호 전달 경로에 관여하는 필-순찰대 오페론 인코딩 단백질의 화성 조절기에 의해 조절된다. X의 꿈틀 운동에 pilG의 역할을 규명하려면 fastidiosa하는 pilG 결핍 돌연변이 Xf를 ΔpilG 및 기본 pilG을 포함하는 그것의 보완 변형 XfΔpilG- C가 개발되었다. 타임 랩스 영상 녹화 시스템과 통합 마이크로 유체 챔버 XfΔp 경련 운동성을 관찰하는 데 사용ILG, XfΔpilG- C와 야생형 균주. 이 기록 장치를 사용하여, 장기 시공간 응집 관측 각 셀 및 경련 운동성 통해 박테리아 집단의 이동을 허용한다. X. 돌연변이 XfΔpliG는 연축 결핍 표현형을 나타내 fastidiosa 반면 야생형과 상보 XfΔpilG- C 균주 직접 미세 유동 챔버 관찰 전형적인 경련 운동성 특성을 보였다. 이 연구는 pilG는 X의 꿈틀 운동성에 기여하고 있음을 보여줍니다 fastidiosa. 마이크로 유체 유동 챔버 경련 운동성을 관찰하는 수단으로 사용된다.

IV 형 pilus 매개 경련 운동성을 나타내는 콜로니 주변 무늬의 존재는, X의 콜로니가 관찰되었다 fastidiosa 야생형 및 보완 Xf를 ΔpliG -C 변형 (그림 1). 돌연변이 XfΔpliG 그러나, 콜로니 주변부 프린지를 (도 1)을 나타내지 않았다. 나노 미세 유체 흐름 챔버에 박테리아 세포의 시간 경과 영상은 꿈틀 운동이 모두 야생형 X에서 관찰되었다 것으로 나타났다 fastidiosa 및 보완 XfΔpliG -C (기업 V1, V3)는 XfΔpilG 돌연변이 세포 반면 실험 (기업 V2)를 통해 운동성을 꿈틀 나타내지 않았다. 돌연변이 XfΔpilG의 세포 PD2 국물 (기업 V2)에 상대적으로 작은 느슨한 집합체를 형성했다. X.의 반대로, 셀 fastidiosa 야생형 및 보완 XfΔpilG- C d를<html> PD2 국물에 eveloped 큰 집계 (그림 2 (기업 V1, V3). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53816/53816fig1.jpg" /> 그림 1 :. X의 세균성 식민지의 주변 프린지 식민지 마진 특성 야생형, 돌연변이 Xf를 ΔpilG, 보완 XfΔpilG- C에서 fastidiosa는 셀로판의 멸균 시트로 덮여 PD2 한천에 성장. 돌연변이 XfΔpilG 제외한 모든 콜로니 타입 IV의 pilus 매개 운동성 경련을 나타내는 주변 프린지 나타냈다. 사진은 문화 매체에 성장 5 일 후 촬영 하였다. 배율 바, 0.5 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/53816fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> _upload / 53816 / 53816fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2 : X의 꿈틀 운동 나노 미세 유체 유량 용기에 fastidiosa 세포. 모든 시험 균주 세포의 꿈틀 운동성 관찰 6 일 동안 기록되었다. 평가는 3 개의 독립적 인 비디오 세그먼트에서 수행 하였다. 확대 바, 20 μm의. 참고 : X.의 꿈틀 운동을 fastidiosa 세포 극성 타입 IV의 필리의 연장, 첨부 한 후퇴 통해 유리 표면에 걸쳐 단일 세포의 움직임을 특징으로한다. 단일 세포는 미세 유량 용기에 유체의 현재에 대해 우선적으로 마이그레이션에서 관찰되었다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/53816fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 6 / 53816supfig1.jpg &quot;/&gt; 보충 그림 1 : 4 채널 미세 유체 흐름 챔버. 각 끝에서 용지 및 용지 출력 커넥터를 가진 각 채널은. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/53816supfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="보충 영화 1" src="/files/ftp_upload/53816/WT-xylella_fastidiosa.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/WT-xylella_fastidiosa.avi" target="_blank">기업 영화 1 : 운동성을 꿈틀. (오른쪽 다운로드 클릭).</a> 야생형 X를 fastidiosa의 경련을 미세 유체 유량 용기에. <img alt="보충 영화 2" src="/files/ftp_upload/53816/pilG-mutant.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/pilG-mutant.avi" target="_blank">보충 영화 2 : 장애인 twitchin</a>g 운동성. (오른쪽 다운로드 클릭). 운동성 Xf를 돌연변이의. XfΔpilG는 amicrofluidic 유량 용기에서 관찰. <img alt="보충 영화 3" src="/files/ftp_upload/53816/pilG-complement.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53816/pilG-complement.avi" target="_blank">보충 영화 3 : 꿈틀 운동성을 복원. (오른쪽 다운로드 클릭).</a> Xf를 보완 변형의 운동성을 꿈틀. XfΔpilG-C는 미세 유동 챔버에서 관찰했다.

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Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

본 연구에서는 나노 미세 유체 흐름 챔버는 시각화 기능 Xylella fastidiosa, 포도 나무에 피어스의 질병을 일으키는 세균의 꿈틀 운동의 특성을 사용 하였다.

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em&gt; PilG</em&gt;에서<em&gt; Xylella의 fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

10.7K 조회수.  University of California, Davis.  본 연구에서는 나노 미세 유체 흐름 챔버는 시각화 기능 Xylella fastidiosa, 포도 나무에 피어스의 질병을 일으키는 세균의 꿈틀 운동의 특성을 사용 하였다. 

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Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

연구

생화학

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

발생학

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

면역학 및 감염병학

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of signals to create complex, dynamic patterns as a response to environmental cues. These patterns are self-organizing and emergent; they cannot be predicted by observing the behavior of the individual cells. Using a time-lapse microcinematography tracking assay, we identified a distinct emergent pattern in M. xanthus called chemotaxis, defined as the directed movement of a swarm up a nutrient gradient toward its source 1.
In order to efficiently characterize chemotaxis via time-lapse microcinematography, we developed a highly modifiable plate complex (Figure 1) and constructed a cluster of 8 microscopes (Figure 2), each capable of capturing time-lapse videos. The assay is rigorous enough to allow consistent replication of quantifiable data, and the resulting videos allow us to observe and track subtle changes in swarm behavior. Once captured, the videos are transferred to an analysis/storage computer with enough memory to process and store thousands of videos. The flexibility of this setup has proven useful to several members of the M. xanthus community.

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

To study Myxococcus xanthus swarm behavior, we have designed a time-lapse microcinematography protocol that can be modified for different assays. It employs standard growth conditions adapted for microscopy, and yields reproducible results by the use of inexpensive, reusable silicone gaskets. We have used this method to quantify multicellular chemotaxis.

에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스</em시간 저속 Microcinematography를 사용하여> Biofilms

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

생물학

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

주름 식민지 개발을 사용하여 Biofilm 형성을 평가하기 위해 세미 양적 접근

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성

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