Name: immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 IOS-0817658에 의해 지원되었다.

이 프로토콜의 제브라 피쉬 절차는 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시약 1. 준비 <ol><li> 4 % PFA / PBS. 흄 후드에서 파라 포름 알데히드의 8g (PFA)를 달아. 여전히 흄 후드에서, ~ 80 ml를 50 ° C로 교반 및 가열 증류수 H 2 O를 건조 PFA를 용해하는 동안. PFA 완전히 용해되어 용액이 명확 할 때까지 신선한 1N NaOH를 10 방울 - 교반하면서, 3을 추가합니다. 열에서 제거하고 100 ml의 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 증류수 H 2 O 200 ml의 부피를 가져와 실온으로 냉각하고 사용하기 전에 7.4의 산도를 확인합니다. 4 ° C에서 어둠에 보관하지만 1 주일 이내에 사용한다. </li><li> 어떤 보충없이 100 % 메탄올을 사용합니다. 어떤 보충없이 95 % 에탄올을 사용합니다. </li><li> 인산염 완충 트윈 (PBT)를 준비합니다. 0.1 % 트윈 -20으로 인산 완충 식염수 (PBS)를 보완. 0을 추가합니다.1X PBS 100 ㎖에 20 % 트윈 -20 스톡 용액 5 ㎖. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 인산염 완충 트리톤-X (PBTx)를 준비합니다. 0.1 % 트리톤 X-100으로 PBS를 보충합니다. PBS 100 ㎖에 20 % 트리톤 X-100 주식의 0.5 ML을 추가합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 10 % NGS / PBTx를 준비합니다. 정상 염소 혈청 (NGS) 블록은 비 - 특이 적 결합 부위. -20 ° C에서 분취에 보관 NGS. 사용 9 ml의 PBTx 1 ml에 추가합니다. </li><li> 50 % 글리세롤 / PBS를 준비합니다. 배 PBS 100 % 글리세롤의 완전히 동일한 부분을 섞는다. 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 배아 고정 <ol><li> . (. 예를 들어, β - 굴지 : CAAX-GFP) 사육 구하는 야생형 (AB 및 WIK) 또는 형질 전환 자연 교배를 통해 배아. 원하는 경우 설명 된대로, 구조 또는 morpholinos와 배아를 주입. (15, 16) </li><li> . 배아 증액 배아 모아서 바와 같이 염색을 차단하기 위해 0.003 %, 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)의 존재하에 28.5 ℃에서 배양한다. 17 </su<html> P&gt; </li><li> 배아가 원하는 발달 단계, 18에 도달하면. 수정, &#160; , MESAB를 이용하여 배아 마취 최대한 시스템의 물을 제거하고 신선한 3 4 % PFA / PBS를 추가 - RT에서 4 시간. 참고 : 20 시간 게시물 수정 (HPF)보다 적은 시간에, dechorionation하기 전에 수정합니다. HPF (20) 이후에 때때로, 해부 현미경 하에서 미세 점 두 쌍의 집게를 이용하여 고정하기 전에 dechorionate. </li><li> 솔루션을 변경. 넓은 구멍 피펫을 사용하여 배아로 이동 한 바와 같이.의 microcentrifuge 튜브 덮인 1.5 ml의 17 변경 솔루션, 단순히 배아가 원심 분리하지 않고 중력에 의해 정착 할 수 있도록하여. </li><li> 후 정착액 3 후 -. 4 시간, 최소 48 시간 동안 -20 ° C에서 100 % 메탄올 저장 교체, PFA / PBS를 제거합니다. 참고 : 최대 P-CaMK-II 면역를 들어, 일주일 총 메탄올 저장 시간을 제한 할 수 있습니다. </li></ol>&quot;&gt; 3. 면역 염색 항목의 태아 <ol><li> 출장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 각 실험 조건 10 배아의 최소 배치하고 레이블을 붙입니다. </li><li> 배아가 정착하도록 허용합니다. 메탄올을 제거하고 폐기하고 다음 단계에서 나타낸 바와 같이, 에탄올의 농도를 감소 0.5ml를 함유 프로그레시브 세척하여 재수. 각 단계는 락과 5 분 세척입니다. </li><li> 점진적이 5 솔루션 재수 : 66 % 에탄올 / 33 % PBTx, 33 % 에탄올 / PBTx은 100 % PBTx 100 % PBTx (이 PBTx 첫 반복이다), 100 % PBTx (이 두 번째 반복 인 66 % PBTx). </li><li> 마지막 PBTx 세척을 제거합니다. 0.5 ml의 10 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드러운 락과 실온에서 적어도 1 시간 동안 품어 후 제거 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 10 % NGS / PBTx에 희석 차 항체 솔루션을 준비합니다. 공동 면역 염색 경우, 먼저 높은 친 화성 항체를 사용합니다. 500 : 본 연구를 위해, 1 희석 마우스 항 아세틸 튜 불린 단클론 항체로 배양한다. exampl에 대한즉, 10 개의 샘플이 10 % NGS / PBTx 3 ml의 스톡 항체 용액 6 ㎕를 결합하고,이 각 튜브에 0.3 ㎖에 분산이있는 경우. </li><li> 모든 배아를 체험하기 위해 각 튜브에 희석 차 항체 0.5 ml의 - 0.2을 추가합니다. 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어. </li><li> 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 초과 일차 항체를 씻어 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 머리 위의 조명을 어둡게하고 각 조건이 적어도 0.5 ml에 포함되도록 10 % NGS / PBTx에서 적절한 형광 접합 된 이차 항체를 희석. (500) 희석 : 마우스 항 - 아세틸 화 튜 불린 차 항체로, 1에서 녹색 형광 염료 염소 항 - 마우스 IgG를 사용합니다. </li><li> 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 차 항체를 품어. 희미하게 불빛 아래 어두운 용기에 배양 또는 알루미늄 호일에 포장하여 샘플 프로세스, 지금부터. </li><li>인큐베이션의 끝에, 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx 세탁에 추가. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 공동 면역 경우 제 차 항체보다는 다른 종으로부터 제 차 항체를 얻었다. 이 연구에서 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체에 의해 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체를 따릅니다. </li><li> 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체 1:20 희석. 배아의 각 튜브를 들어, 다음, 0.3 ml의 10 % NGS / PBTx에 중단 주식 항체 용액 15 μl를 추가합니다. </li><li> 배아가 몰입과 조명이 희미하게되어 있는지 확인합니다. 어둠 속에서 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어. </li><li> 희미한 불빛 아래에서 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 희미한 간접 조명을 유지하고 적절한 형광 conju 충분히 희석문이 이차 항체 있도록 각 조건은 적어도 0.5 ml에 포함되어 있습니다. 500 10 % NGS / PBTx : 본 연구에서는 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체 (적색 채널) 1을 희석. </li><li> 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 제 2의 2 차 항체를 품어. </li><li> 이 배양 희미한 조명 아래 끝에서 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 PBTx을 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. 쇼핑몰 PBTx 50 % 글리세롤 / PBS 하나로 촬상 절차에 따라. </li></ol> 4. 공 촛점 이미징 및 처리 <ol><li> 마운트 이미징 배아. 유리 슬라이드에 5 배아 - 1을 배치합니다. 메인 커버 슬립 및 챔버의 각각의 측면 상에 커버 슬립 단편을 사용하여 슬라이드 사이에 챔버를 만든다. 일반적으로, 네 # 1 커버 슬립은 밀봉하지 않고 이러한 스페이서 스택을 만드는 데 사용됩니다. 참고 : 설치 매체가 필요하지 않습니다. </li><li> 100X 기름 침지를 사용하여목적은 전송 된 빛을 사용하여 초점 단일 배아를 가지고 있습니다. 빛을 끕니다. 공 초점 현미경을 켭니다. 적절한 레이저 (녹색 및 / 또는 적색) 켜져 있고 원격 포커스 악세사리가 종사을 확인합니다. </li><li> 공 초점 프로그램을 켭니다. 에서 &quot;획득 바,&quot;적절한 목표를 선택합니다. &quot;XY 기본&quot;줄에 1,024 버튼을 클릭하여 1,024에 이미지 크기를 설정합니다. </li><li> &quot;레이저 및 감지기&quot;줄에서 각 채널에 대한 레이저 및 검출기를 켭 빨간색 488 상자와 녹색 568 상자를 클릭합니다. 매체에 핀홀 설정하고 시각화하는 각 채널의 &quot;게인&quot;줄의 게인을 조정합니다. </li><li> &quot;취득 설정&quot;줄에서 이미지를 획득 시작 &quot;라이브&quot;를 클릭합니다. &quot;보기 설정&quot;줄에서 &quot;라이브&quot;창에서 가운데​​로 &quot;일체형 줌을 강제로&quot;상자를 선택 취소합니다. </li><li> &quot;설정 획득&quot;줄에서 &quot;Z&quot;탭에서, 이미지의 레이어를 통해 단계. 뉴를 선택한 후광학 섹션의 mber, 이미지에 통합 Z-평면의 &quot;중심&quot;의 어느 시점으로 이동합니다. </li><li> &quot;Z&quot;탭에서 작은 빨간 &quot;참조&quot;상자를 클릭합니다. 이 &quot;중앙&quot;으로서 선택 시점 RFA 영점 것이다. &quot;스텝 크기&quot;라고 표시된 상자에 (이상적입니다 μm의 μm의 0.25 내지 2.0) 층의 두께를 선택합니다. &quot;파일 크기&quot;상자에 주목하고 1GB로 제한하려고합니다. 주 : 일반적으로 0.5 내지 40 부까지의 광학 - 1.0 μm의 수득되지만, 섹션들의 수는 실험적으로 결정될 수있다. </li><li> 이미지의 상단 극단적 인을 찾으려면 &quot;최고&quot;옆에있는 원을 클릭하고 Z 층을 통해 이동합니다. 이제 다음 &quot;바닥&quot;에 동그라미를 누르면 컴퓨터는 중심으로 층으로 다시 이미지를 취할 것입니다. 다시 이미지의 하단 극단적 인을 찾기 위해 레이어를 통해 이동합니다. </li><li> 레이저를 중지 상자 &quot;취득 설정&quot;에서 다시 &quot;라이브&quot;를 클릭취득. 이 패널에서 빨간 평균 표시 박스와 Z-스택을 클릭합니다. 이 상자는 녹색으로 바뀝니다. </li><li> &quot;취득 설정&quot;상자에서 이미지의 전체 시리즈를 취득하는 &quot;싱글&quot;을 클릭합니다. 이 두 채널에서 전체 Z - 스택을 통해 검색과 같이 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 저장 볼륨 창을 클릭 클릭 &quot;다른 이름으로 저장&quot;및 파일 이름을 지정합니다. &quot;.ids&quot;파일로 저장합니다. 볼륨 Z-스택이 열려있는 동안, 파일을 렌더링 데이터 풀다운 메뉴에서 &quot;렌더링 볼륨&quot;을 클릭 선택합니다. TIFF 파일로 렌더링 된 파일을 저장합니다. 현재 문서는 인쇄물에 표시됩니다 투사 된 이미지입니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+during+embryonic+development.">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development.">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li><li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+at+fertilization+and+in+early+development.">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li><li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ca(2+)+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development.">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li><li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells:+anaphase+onset+is+calcium+modulated,+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient.">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li><li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II:+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function.">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li><li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2+/CaM-dependent+Protein+Kinase+(CaMK-II).">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li><li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multifunctional+Calcium/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase:+From+Form+to+Function.">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li><li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5-mediated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis.">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li><li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis.">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li><li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer's+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry.">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li><li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia.">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling.">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish.">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li><li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function.">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644 (2013).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li><li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage.">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

PFA / 메탄올 방법은 제브라 피쉬 개발하는 동안 포스-T 287 -CaMK-II 에피토프의의 면역을 최적화의 주요 목적이 실험실에서 개발되었다. 이 방법은 성공적으로 제브라 피쉬의 KV, 14, 특히 KV 단계에서 신장. (13),이 기술이 필요했다 (12) 내이 등 여러 기관 섬모의 형성 동안 P-CaMK-II를 현지화. 이러한 방법의 성공으로 인해자가 형광의) 최소화, 포스 CaMK-II 에피토프 b) 보존 항체 에피토프 c) 향상된 접근성 조합 쉽다. 이 접근법의 주요 한계는 메탄올 저장 시간이다. P-CaMK-II의 면역 반응은 -20 ° C에서 메탄올 두 일 후 최대하지만,이 에피토프의 반응은 메탄올 저장 일주일 후 손실됩니다. 또한이 때 포스페이트 기가 HY인지 명확하지 않다drolyzed 또는 추가 변성은 그 면역 반응을 감소 발생합니다. -20 ° C에서 메탄올 / EGTA 초기 배아의 개발 과정에서 튜 불린이 풍부한 구조를 보존 전통적으로 빠른 정착이다. (22) 그러나, 혼자 메탄올은 액틴 세포 골격으로 형태 또는 구조를 유지하는 것이 바람직하지 않고 와야합니다 PFA. 이 방법의 추가 장점은 또한 F - 굴지 및 아세틸 화 튜 불린 다른 에피토프를 보존하고 GFP의 기본 형광을 제거하지 않는 것이 있습니다. 이러한 덴트의 정착과 같은 다른 고정 제는 다른 항원 결정기 (13)에 대한 우수 및 P-CaMK-II 염색은 PFA / 메탄올보다 덴트의 정착에 약한하지만, P-CaMK-II 염색과 호환 남아있다. 포스 포 단백질이 초기 개발 과정에서 활성 신호 전달 경로에서 유행하기 때문에, 덴트의 정착 및 PFA / 메탄올 Hogan 박사의 다른 포스 에피토프에 대한 두 개의 고정 제로서 추천rafish 배아. 다른 단백질과 항체이 기술과 애플리케이션을 개발, 면역 블롯에도 반응하는 항체를 가지고와 복제 및 항체를 검증 할 수있는 단백질을 과발현 한 것이 도움이되었습니다. (12) 그것은) 단백질 수준에서 유전자 억제를 확인할 수 있고, b) 동작 모델의 개발을 가능하게하는 기술의 면역 때문에 최적화하려는 노력 가치가있다. 이 실험에서, 이러한 분석의 결과를 통해 모델 CaMK-II 기능 제형을 허용했다. 예를 들어, 그 위치에서의 KV이 기관의 역할과 같은 일시적인 비대칭이다. 신장, pronephric 도관 세포의 정점 측의 위치는 덕트로부터의 신호에 응답하는 역할을 시사한다. 마지막으로, 귀 kinocilia의 기지에서 특정 강렬한 puncta의에서이 효소의 활성화는 지역화 된 칼슘 신호를 의미한다. 방법은 여기에 설명또한 2 형광 채널에서 임의의 배아 세포 유형의 고해상도 이미지를 획득하고자하는 연구자에게 유용 할 것이다.

The techniques described here are the outcome of studies that have sought to define downstream targets of Ca2+ signals during events that occur during early development, including fertilization, gastrulation, somitogenesis and trunk, eye, brain and organ formation.1-3 The original discoveries of embryonic Ca2+ signaling were dependent on the use of natural and engineered Ca2+ indicators, such as aequorin4 and fura-2.5 Even with current technology, the detection of transient elevations of Ca2+ requires cumbersome analytical tools and does not reveal the targets of such Ca2+ signals. 
This laboratory investigates Ca2+ signals that act through the Ca2+/calmodulin-dependent (multifunctional) protein kinase known as CaMK-II, an enzyme that is enriched in the central nervous system and originally identified as a regulator of long-term potentiation.6 CaMK-II is not brain-specific, is widely expressed and highly conserved throughout the entire lifespan and bodies of species throughout the animal kingdom, including invertebrates.7,8 CaMK-II has the unique capability of sustaining its own activity even after Ca2+ levels have diminished due to its ability to autophosphorylate at Thr287. In this autophosphorylated state, CaMK-II remains active in a Ca2+/CaM-independent manner, until dephosphorylated.6 Thus, the localization of phosphorylated CaMK-II (Thr287) can identify cells in which natural, relevant Ca2+ elevations have occurred. 
An antibody against autophosphorylated (P-Thr287) mammalian CaMK-II has been well-characterized and was initially used to localize activated CaMK-II in brain tissue.9 Zebrafish (Danio rerio) have seven CaMK-II genes10,11 whose protein products contain a sequence of MHRQE[pT287]VECLK in this region.10,11 This sequence is very similar to the phosphopeptide antigen used to create this rabbit polyclonal antibody (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) and therefore it was not a complete surprise that this antibody cross-reacted with zebrafish CaMK-II. This laboratory showed that this antibody reacts with zebrafish CaMK-II in proportion to autophosphorylation and Ca2+/CaM-independent activity.12 Additional pan-specific CaMK-II antibodies have also been shown to cross-react with zebrafish CaMK-II.13
This antibody has been used to demonstrate that zebrafish CaMK-II is preferentially activated in cells on one side of the zebrafish Kupffer's Vesicle (KV), the ciliated organ necessary for establishment of left/right asymmetry.12 This antibody was used to demonstrate that CaMK-II is transiently activated in four adjacent cells on the left side of the KV during the exact same developmental phase that organ positioning is determined.12 In addition to the Kupffer's Vesicle (KV), autophosphorylated (P-T287) was also located in specific intracellular sites in other ciliated tissues including the kidney, neuromasts, and inner ear.12,13 In the zebrafish kidney, P-T287-CaMK-II is enriched along the apical border of ciliated ductal cells and within cloacal cilia where it influences their assembly.13 Finally, in the developing inner ear, P-T287-CaMK-II is intensely concentrated at the base of cilia and influences cell differentiation through the Delta-Notch signal pathway.14 In summary, the detection of activated CaMK-II has pinpointed sites of intracellular Ca2+ release and illuminated potential new signaling pathways.
These discoveries were completely dependent on developing a sensitive and accurate method to localize activated (P-T287-autophosphorylated) CaMK-II. The methods to fix and immunostain the zebrafish KV, kidney and inner ear are described. The limitations of this technique are also described. These techniques should be useful to any investigator who seeks to obtain high-resolution images in two fluorescent channels of not just phospho-epitopes, but any epitope, during early vertebrate development.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P-7629</td><td>0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water</td></tr><tr><td>Alexa488 anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Preferentially binds to F-actin</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Goat polyclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>anti-acetylated &amp;#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>Mouse monoclonal, use at 1:500</td></tr><tr><td>anti-phospho-T&lt;sup&gt;287&lt;/sup&gt; CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>Rabbit polyclonal, use at 1:20</td></tr><tr><td>anti-total CaMK-II</td><td>BD Biosciences</td><td>611292</td><td>Mouse monoclonal, use at 1:20</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>S96857</td><td>Lab grade, 95% denatured</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&amp;nbsp; thickness</td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>Standard glass slides</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A411</td><td>Store in freezer</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>capped tubes, not sterile</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>Aliquot 1 ml tubes, store in freezer</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>Reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-131</td><td>10x stock solution or made in lab</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>10% solution in water, store at RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>10% solution in water, store at RT</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>E-600</td><td>Mount on vibration-free table</td></tr><tr><td>C1 Plus two-laser scanning confocal</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td><td>Run by EZ-C1 program, but upgrades use &quot;Elements&quot;</td></tr></tbody></table>

immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos

세포의 급속한 확산, 유전자의 조직 - 특이 적 발현 및 시그널링 네트워크의 출현은 모든 척추 동물의 초기 배아 발달의 특성. 심지어 하나의 셀 내에서 - - 반응 속도 및 신호의 위치 배아의 중요한 발달 유전자의 식별을 보완합니다. 면역 염색 기술이 차 섬모 작게 구조의 세포 내 및 전체 동물 신호의 동역학을 정의하기 위해 도시되었다는 것을 설명한다. 레이저 스캐닝 공 초점 복합 현미경을 사용하여 정착, 영상 및 이미지 처리 기술은 적은 36 시간 내에 완료 될 수있다. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오)는 저렴하고 인간의 질병에 관련된 척추 동물 종에서 연구를 수행하고자 연구자를위한 바람직한 유기체이다. 유전자 녹아웃 또는 knockdowns는 실제 단백질 제품의 손실에 의해 확인되어야한다. 단백질 손실 이러한 확인여기에 설명 된 기술을 사용하여 달성 될 수있다. 신호 전달 경로에 대한 단서는 번역 후 인산화에 의해 변형 된 단백질과 반응하는 항체를 사용하여 해독 할 수 있습니다. 보존 및 에피토프의 인산화 상태를 최적화하는 것은이 결정하는 것이 중요하며,이 프로토콜에 의해 달성된다. 이 연구는 개발의 첫 72 시간 동안 배아를 해결하기 위해 기술을 설명 쿠퍼의 소포 (KV)의 섬모와 관련 항원의 다양한 신장과 내이 공동 현지화. 이러한 기술은 절개하지 않아도, 간단하고 비교적 짧은 시간에 완료 될 수있다. 하나의 이미지로 공 초점 이미지 스택을 투사하는 것은 이러한 데이터를 제시하는 유용한 수단이다.

포스 에피토프를 시각화하기위한 최적의 조건 제브라 피쉬 배아에서 단백질 항원 결정기의의 면역을 설명하는 방법은 현장 하이브리드의 mRNA를 통해 현지화에 대한에 비해 상대적으로 드문 드문 있었다. 제브라 피쉬 배아의 섬모 세포에서 단백질 에피토프를 로컬 라이즈에 사용되는 고정 제 4 % PFA / PBS 및 메탄올과 현장 하이브리드의 전체 마운트에 의해 RNA의 DMSO. 19 현지화 (WISH)의 혼합물이다 덴트의 정착을 포함했다 일반적으로 PFA를 사용하여 달성 100 % 메탄올에 저장 하였다. 20,21 우리의 연구는 두 내지 7 일 메탄올 시간을 제한 할 때 WISH 정착액 조합, P-CaMK-II 항체의 면역을위한 다른 정착에 크게 우수한 것을 알았다 . 이 PFA / 메탄올의 조합으로 달성 신호였다 ALSO 덴트의 고착성 4 % PFA / PBS 또는 메탄올 내 태아 발육 시간과 위치에 따라, 단독으로 사용한 경우보다 상당히 크다. 여기 사용 된 각 정착액 발달 시간에 대해 기재된 방법을 최적화 할 때, 대조 샘플은 일차 항체를 생략하는 것을 제외하는 모든 단계를 관찰 하였다 제조 하였다. 상술 한 바와 같은 조건으로 촬상 할 때 이러한 제어 샘플의 형광 신호가 부족. 이 컨트롤은 모든 항체이 방법을 복제하는 다른 연구자에게 추천합니다. PFA / 메탄올 정착 조합은 강력한 P-CaMK-II 신호를 산출하고 또한 섬모의 표준 마커 아세틸 화 튜 불린에 대한 면역 염색과 호환이었다. 나온다 이러한 연구에서 이미지화 된 발달, 최초의 섬모 기관은 쿠퍼의 소포 (KV)입니다. 12 체절 (15 HPF) 단계 (그림 1)에서와 같이 KV는 척색의 후방 단부에 위치한다. KV 일시적인 기관이며, 좌우 비대칭 담당한다. 그것은 2 체절 단계 (12 HPF)에서 나오고 18 체절 무대 주위에 사라집니다. 잔 차 섬모는 KV 및 이산 위치에 CaMK-II의 활성화 (그림 1) 안감 섬모 세포에서 칼슘의 높이에 이르게 유체의 순환 흐름을 생성합니다. P-CaMK-II 반응성은 총 배아 CaMK-II 수준은 여전히 반 24 HPF에서 같은 레벨 및 레벨 1/10이다 나타나고이 초기 긴 섬모 박동 같다. 12 KV의 일측에 사라진다 총 CaMK-II 발현은 HPF (15)에서 상대적으로 낮아 발전 3 일째. 11 아마도,이 단계에서 면역 기술에있는 향상에 특히 중요하다. Betwe개발의 24, 72 HPF 욕실, P-CaMK-II는 pronephric 덕트 (그림 2,3)의 특정 지역에 선을 긋고있는 섬 모세포의 혀끝의 표면에 나타납니다. (그림 2) 전체 pronephric 덕트를 따라 인접 somites에 걸쳐 총 CaMK-II의 면역 배아 CaMK-II의 서브 세트 만 (P-CaMK-II)를 활성화되어 있음을 보여줍니다. 고정 조건은 GFP 형광 보존과 호환 이러한 고정 기술도 향상없이 (그림 3) 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광을 유지와 호환됩니다. GFP 태그가 CaMK-II에서 즉이 그림에 사용되는 구성, GFP는 충분한 형광 PFA / 메탄올 고정 및 후속 면역 염색 비록을 유지합니다. pronephric 덕트 라이닝 세포의 높은 배율의 뷰에서 (그림 3), 일GFP-CaMK-II의 전자 모자이크 표현은 P-CaMK-II에 대한 면역 염색 된 세포에서 볼 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 귀는 칼슘의 상승은, CaMK-II를 통해 행동, 개발에 영향을하는 다른 조직이다. 14 Zebrafish의 귀는 일반적으로 개발의 약 일일 나타납니다. 이 때, CaMK-II는 강렬 kinocilia의 기지에와 kinocilium (그림 4)을 따라 낮은 수준에서 활성화됩니다. 이미지 세트가이 고정 및 기술의 면역 염색 섬모 내에 감지 할 수있는 표시, 그 단면 구조는 1 ㎛ 미만이다. 이 섬모이 고정 및 면역 염색 과정을 통해 자신의 구조를 유지합니다. 개발 나중에 내이 2 색으로 대조의 추가적인 예는 모두 알렉사 488 염색에 의해 달성되었다팔로이 딘과 알렉사 568 다음 항 아세틸 화 튜 불린 이차 항체 (그림 5) 태그. PFA / 메탄올 고정 방법은 모든 고정 제의 사실이 아니다 모두 F - 굴지 및 튜 불린를 유지하는 것이 주목할 만하다. 이 예제는 전체 귀에 병합 된 컬러 이미지로 다음 ​​하위 영역에 대해 표시됩니다. (14) 2 색으로 대조 최종 대표적인 막 타겟 GFP (도 6)와 배아를 생산 물고기 변형에 의해 달성 하였다. 막 대상 GFP는 다른 단백질에 부착되지 않고, 따라서이 이미지가 혼자 PFA 고정 된 물고기로부터 얻은 메탄올로 추출 할 때 손실됩니다. 이 결과는 메탄올 처리가 세포막을 추출 제안, 그래서 독점적으로 결합 막을 수있다 단백질을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 도면에서 P-CaMK-II 신호는 달성 메테 경우에 상대적으로 줄어든다올이 사용될 되었으나 이는 배아이 단계 및 위치 (신장)에서, 신호는 메탄올 처리없이 검출 할 수있을만큼 강한 것을 보여준다. 즉, KV 단계에서 사실이 아니다,. 즉, 메탄올 P-CaMK-II의 면역 염색을 시각화하는 데 필요합니다. 이 예는 단지 신장의 pronephric 덕트 트렁크 근육에 인접한 합성 화상으로 표시된다. 요약하면, 여기에 설명 된 PFA / 메탄올 고정 방법은 GFP의 보전와 F - 굴지에 대한 염색, 아세틸 화 튜 불린, 총 CaMK-II와 P-CaMK-II와 호환됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig1.jpg" /> Zebrafish의 KV에서 아세틸 튜 불린 (섬모) 그림 1. P-CaMK-II 대조. 하나의 라이브 12 체절 단계의 뷰 (12 SS)은 배아는 아칸소에 의해 KV의 후방 위치를 알 수rowhead (측면보기, A) 및 박스 내에서 원 (ventral보기, B). 이 단계에서 배아 PFA / 메탄올로 고정시켰다. 배아는 알렉사 488 -labelled 차 항체 (녹색 채널) 다음 아세틸 화 튜 불린에 대한 면역 염색 하였다. 다음으로, P-CaMK-II에 대한 토끼 폴리 클로 날 항체는 알렉사 잘 듣지 표지 이차 항체 (적색 채널)으로 이어졌습니다. 점진적으로 높은 배율 (C, D)에 설명 된대로 2 채널 형광 이미지 예측 취득 하였다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 수치는 이전의 출판물에서 수정됩니다. (12)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig2.jpg" /> 그림 2.에 대한 P-CaMK-II 대조Zebrafish의 신장에 따라 총 CaMK-II. 30 HPF에서 하나의 dechorionated 배아는 PFA / 메탄올을 사용하여 수정되었습니다. 배아는 다음 알렉사 488 레이블 차 항체 (녹색) 다음 총 CaMK-II에 대한 염색 하였다. 다음으로, P-CaMK-II 차 항체는 알렉사 568 레이블 차 항체 (적색)으로 이어졌습니다. 염색은 총 CaMK-II 반면 pronephric 제브라 피쉬 신장의 덕트 인접한 근육 조직과 근섬유 분절에 걸쳐 체절 경계에 충실 라인 셀의 혀끝의 표면을 따라 (빨간색) 활성화 CaMK-II의 농축을 알 수있다. 스케일 바는 50 μm의 =. 이러한 이미지는 전체 신장을 시각화하기 위해 텍스트에 기재되어보다 낮은 배율에서 획득 하였다. 이 수치는 이전의 출판물에서 수정됩니다. (13)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> GFP 그림 3. P-CaMK-II 카운터 군데는 Zebrafish의 신장 세포에.이 30 HPF의 배아 cDNA를 지배적 인 부정적인 GFP-CaMK-II. (13) 이러한 주사는 일반적으로 모자이크 식을 보여 인코딩으로 주입 하였다. 배아는 PFA / 메탄올을 사용하여 고정하고 알렉사 568 레이블 차 항체를 사용하여 P-CaMK-II에 대한 면역 염색 하였다. 이미지는 GFP가 PFA / 메탄올 고정, 수분 보충, 차단 및 면역 염색을 통해 지속 것을 알 수있다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 수치는 이전의 출판물에서 수정됩니다. (13)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig4.jpg" /> 그림 4 </strongZebrafish의 내부 귀에서 아세틸 튜 불린와&gt;. P-CaMK-II 대조.이 30 HPF의 배아는 PFA / 메탄올을 사용하여 수정되었습니다. 항 아세틸 화 튜 불린 항체는 알렉사 488 라벨이 지정된 차 항체, P-CaMK-II 항체와 알렉사 568 레이블 차 항체 순서로 이어졌습니다. 염색은 P-CaMK-II는 내이 섬모를 따라 존재하고 아세틸 화 튜 불린와 공동 지역화 있음을 알 수있다. 스케일 바 = 5 μm의. 이 수치는 이전의 출판물에서 수정됩니다. (14)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig5.jpg" /> Zebrafish의 내부 귀 그림 5. 액틴과 아세틸 튜 불린. 삼일 세 (72 HPF) 제브라 피쉬 배아는 고정 아세틸 t에 대한 면역 염색했다알렉사 568 라벨이 지정된 이차 항체를 사용하여 ubulin, 알렉사 488 팔로이 딘을 사용하여 굴지의 시각화 하였다. 섬모뿐만 아니라 귀 축삭 신경 분포는 (빨간색) 아세틸 화 튜 불린에 의해 밝혀과 F-액틴 구조 (녹색) 근육 섬유를 포함한다. 제브라 피쉬 귀 두 섬모 감각 영역은보다 상세하게 나와 있습니다 전방 황반 (오전) 및 후방 crista (PC)를. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 수치는 이전의 출판물에서 수정됩니다. (14)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig6.jpg" /> . Zebrafish의 신장에서 막 GFP 그림 6 P-CaMK-II 카운터 군데 β - 굴지하는이 하나의 통합 된 이미지 : CAAX-GFP 배아 (30 HPF)를 고정 및 P-CaMK- 위해 염색했다.II는 알렉사 568 표지 이차 항체 하였다. 염색은 pronephric 제브라 피쉬 신장의 덕트 라인 셀의 혀끝의 표면을 따라 (빨간색) 활성화 CaMK-II의 농축을 알 수있다. 이러한 신장 도관 세포는 단지 근육 조직 아래에 자리 잡고 있으며 모두가 (녹색) 막 대상 GFP의 발현에 의해 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53747/53747fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K 조회수.  Virginia Commonwealth University.  기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다. 

비디오: Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn and 70Zn) which are naturally fractionated between mouse organs. We first show how to dissolve the different organs in order to free the Zn atoms; this step is realized by a mixture of HNO3 and H2O2. We then purify the zinc atoms from all the other elements, in particular from isobaric interferences (e.g., Ni), by anion-exchange chromatography in a dilute HBr/HNO3 medium. These first two steps are performed in a clean laboratory using high purity chemicals. Finally, the isotope ratios are measured by using a multi-collector inductively-coupled-plasma mass-spectrometer, in low resolution. The samples are injected using a spray chamber and the isotopic fractionation induced by the mass-spectrometer is corrected by comparing the ratio of the samples to the ratio of a standard (standard bracketing technique).&#160;This full typical&#160;procedure produces an isotope ratio with a 50 ppm (2 s.d.) reproducibility.

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

마우스 기관에 적용 높은 정밀도 아연 동위 원소 측정

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

연구

화학

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

발생학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

생물학

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

생화학

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

현장 Cryosectioned Zebrafish 배아에서 면역조직화학과 결합된 혼성화

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

신경과학

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...