Name: quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
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This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

모든 동물 프로토콜을 검토하고 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호 : A3049-01)에 의해 승인되었다. 1. 저밀도 배아 신경 문화 <ol><li> 기본 대뇌 피질의 신경 세포 배양을위한 준비 <ol><li> 솔루션 : <ol><li> 10 ml의 보레이트 완충액에 폴리 -L- 리신 5mg을 용해시켜 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 49 ml의 붕산염 완충액 1 ml의 폴리 - L - 라이신 주식을 희석하여 솔루션을 작동 준비합니다. </li><li> 395 ml의 DH 2 O로 시작하고 모든 재료 (붕사의 1.24 g의 붕산 + 1.9 g)을 추가하여 붕산 완충액, pH가 8.4을 준비합니다. 1 M의 NaOH로 pH를 8.4로 조정합니다. 400 ml의 조정 및 후드 아래에 0.2 μm의 나일론 멤브레인 필터로 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 445 ml의 DH 2 O로 시작하는 다른 모든 성분을 추가하여 HBSS 용액의 pH 7.2을 준비합니다 (50 ㎖ 10X HBSS 재고 + 1.2 g HEPES). 1 N 염산, 브리에 의해 7.2의 pH를 조정NG 500 ㎖의 후드 아래에 0.2 ㎛의 나일론 멤브레인 필터로 필터링. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 DMEM / F12 : 도금 매체를 준비합니다. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 필터링. </li><li> 전체 성장 매체를 준비 : 50 ㎖로 Neurobasal 매체에, 보충 교재를 추가 (500 μL 루타 (100X) + 500 μL 포도당 항생제 - 안티 곰팡이 솔루션 (100X의 + 1 ML의 B-27 (50X) + 500 μL) + 100 ㎕의 7.5 % 중탄산 나트륨. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 여과. </li></ol></li><li> 이틀 문화 전 : <ol><li> 2 폴리 - L - 라이신 작업 용액 ㎖의, 그리고 후드 O / N에서 유지와 코트 열두 35mm의 유리 바닥 요리. </li></ol></li><li> 문화 전 어느 날 : <ol><li> DDH 2 O와 빈 코팅 요리에서 에이전트와 린스 요리 후드 아래 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (총 용액의 10 %)와 도금 배지 (DMEM은 / F12를 준비한다. 피펫 2ml의 배지 내로각각의 요리는, 37 O를 C, 5 % CO 2에서 O / N을 품어. 참고 : 배양 할 때 플라스틱 문화 요리를 방지하는 것이 중요하다. 유리 바닥 (반전 현미경) 요리 또는 (직립 현미경) 커버 글라스의 사용은 샤프하고 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 플라스틱 바닥 접시에 비해 유리 바닥 접시 형광 현미경 동안 원치 않는 색상이나 눈부심을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 배양 프로토콜 : <ol><li> HBSS 버퍼 (100 ~ 150 ㎖), 냉장 넣어 100mm 배양 접시, 집게, 가위, 50 ㎖ 튜브 및 후드 UV 빛 아래 15 ml의 튜브. </li><li> 문화 실의 외부 후드 5 % 세보의 치명적인 흡입 임신 쥐를 안락사. </li><li> 70 %의 EtOH 텐트 복부 cavity.Open 태반을 노출 가위를 이용하여 자궁 중간 꼬리로부터 절단하면서 집게를 사용하여 복부의 피부를 소독. </li><li> 8-10 E18 태아를 제거합니다. 놀이터HBSS 솔루션을 포함하는 배양 접시에 8-10 태아를 CE. </li><li> 집게로 태아의 머리 뒤쪽을 잡고, 다음 몸에서 머리를 절단 가위를 사용합니다. HBSS의 5-7 ml를 가득 다른 배양 접시에 넣습니다. 후드에 접시를 전송합니다. </li><li> 차가운 HBSS와 두 개의 추가 100mm 페트리 접시를 입력합니다. </li><li> 껍질 옆으로 두개골, 그리고 HBSS로 가득 찬 새로운 배양 접시에 머리를 특종. </li><li> 다음에 차가운 HBSS로 새로운 배양 접시에 두뇌를 전송, 뇌에서 날카로운 곡선 집게, 별도의 소뇌와 뇌간을 사용합니다. </li><li> 곡선 집게와 반구를 분리, 고정 핀셋을 사용합니다. 수막을 제거; 표시 15 ML의 원심 분리기 튜브에 정면 피질 및 전송 조각을 격리 할 것. </li><li> 신선한 2 ml의 HBSS로 15 ML 튜브를 입력하고 각 15 ML 튜브에 20 μL 트립신 EDTA (0.5 % 트립신 및 5.3 mM의 EDTA.와 10 배 농축 혼합물)를 추가합니다. </li><li> RT에서 10 ~ 15 분을 품어. 부드럽게 관에게 몇 분마다 소용돌이, 정착 허용하지 않습니다. </li><li> AF터 10 ~ 15 분 사용 유리 피펫 오래된 HBSS를 제거하고 새로운 HBSS로 두 번 씻어합니다. </li><li> (2 ml의 HBSS 1 ㎎ / ㎖, 2 mg을 트립신 억제제) 트립신 억제제에 빠져, 잘 혼합하고 5 분 앉아 보자. 신선한 HBSS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 다시 보정 피펫 매우 균질해질 때까지 서서히 감소 팁 직경 멸균 팁을 사용 bubbles.Triturate을 피하기 위해 매우 천천히 씹다 뇌 피스 고무 전구 10-15 번 유리 피펫을 사용. </li><li> 전송 원하는 농도에서 세포를 해리에 코팅 된 배양 접시 (50 셀 / mm2 인) 준비된 사전. 37 O C, 5 % CO2에서 O / N을 품어. </li><li> 24 시간 후, 갓 만든 완전한 성장 혈청 무료로 Neurobasal 매체 DMEM / F12 매체를 교체합니다. </li><li> 실험 전에 적어도 12~14일 대해 5 % CO 2 / 95 %의 실내 공기의 가습 인큐베이터에서 항상 세포를 유지한다. 신선한 배지로 Neurobasal 이전 매체의 약 50 %를 교체하는 모든 5-6일 세포를 보완. </li></ol></li></ol> 2. 형광 라벨링 및 면역 세포 화학 주 : 일차 대뇌 피질 세포 배양의 면역 라벨 1 ㎖가 작동 부피 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 행했다. <ol><li> 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)로 두 번 유리 바닥 접시를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 수정. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 Permeabilize 하시려면. </li><li> F - 굴지 특정 얼룩 실온에서 20 분 동안 세포 치료, AlexaFluor 488 Phalloidin의 (1시 40분, 1 ml의 PBS에서 Phalloidin의 25 μL). </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단합니다. </li><li> 2 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 4 O ℃에서 O / N을 부화 : 닭 항 MAP2 클론 항체 (2500 1) 희석 </li><li> 배양 한 다음, 두 번 PBS에 헹군다. </li><li> 이차 항체 (알렉사 R 희석ED 594 - 복합 염소 항 - 닭 IgG를 (1 : 500) 2 % 정상 염소 혈청와 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> PBS로 헹구고 10 μL / Hoescht 염료의 요리를 추가합니다. </li><li> RT에서 3 분을 품어 PBS로 2 회 씻는다. 참고 : 3 단계 (F - 굴지 puncta의 계산) 이제 표지 세포가 준비. </li><li> coverslipping 제로 antifade 시약 100 ㎕로 세포 샘플을 보존 및 장기 저장을 위해 어둠 속에서 4 ℃로 유지한다. 참고 : Phalloidin의이 antifade coverslipping 시약으로 보존 할 수 일주 형광까지의 어둠 속에서 4 ℃에서 PBS에서 상대적으로 안정적이다. Phalloidin의 확장 된 스토리지 밖으로 확산 시작할 수 있기 때문에, 최적의 이미지는 염색 후 1-3일를 얻을 수있다. </li></ol> 3. F - 굴지 puncta의 카운팅 <ol><li> 형광 현미경의 전원을 켜고 20 × 목표로 전환합니다. 오픈 현미경 소프트웨어, 1280 × 960 화소의 화상 사이즈에 프로그램을 설정하고, 0.11 배 줌에 7 μm의 / 픽셀 이미지 해상도. </li><li> 빨강, 녹색 (495 ㎚) / (613 ㎚) 형광 채널에서 공동 표지 F - 굴지 / MAP2 뉴런의 이미지를 획득. </li><li> 5 그린 (F - 굴지) / 레드 (MAP2) immunolabeled / 블루 (Hoescht) 명확하게 정의 된 수지상 아버 개별 신경 세포의 형광 이미지를 선택합니다. </li><li> 연속 MAP2의 면역와 두 번째 순서 수지상 세그먼트 (길이 범위 25 ~ 75 μm의)에서 F - 굴지 풍부한 구조를 확인합니다. </li><li> 수평 수준으로 이미지의 선택 영역을 돌립니다. 새로운 이미지로 복사 및 붙여 넣기. </li><li> 각 접시에 대한 일관성을 조정하여, 이미지의 배경을 뺀다. </li><li> 밝은 녹색 F - 굴지 puncta의 카운트 수동으로 훈련 된 독립적 인 관찰자에 의해 선택 수지상 세그먼트의 길이를 추적. 스프레드 시트 파일에 데이터를 보냅니다. </li><li> MAP2는 수상 돌기 레이블의 길이 (L)에 의해 총 F - 굴지 라벨 puncta에 (N)을 나누어 밀도를 계산합니다. F-교류의 수와 같은 고속 데​​이터수상 돌기의 10 μm의 당 주석 puncta의 참고 puncta의 수지상 샤프트 염색의 평균 강도보다 최소한 50 %의 피크 강도 F 액틴 형광 (크기 ≤1.5 것이 μm의) 각각의 선택된 수지상 세그먼트에 포함되었다. </li></ol>

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None of the authors have conflicts of interest to declare.

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F - 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다. F - 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네트워크가 명확하게 볼 수 있어야 변화를 확인하려면,이 하나의 신경 세포에서 적절한 번째 순서 수지상 세그먼트를 선택할 수 있습니다. 저밀도 도금 개별 뉴런을 시각화뿐 아니라 아교 세포의 존재를 최소화하기 위해 모두 중요하다. 성상 세포는 F - 굴지을 포함하고 신경 세포 마커없이, F - 굴지 긍정적 인 puncta의 분석을 혼동 할 수있다. 저밀도 문화로 Neurobasal 배지의 사용은 세포 배양에서 성상 세포의 증식을 감소 시키는데 도움이된다. 그러나, F-액틴 단백질임을주의 주어진뉴런 등 MAP2 같은 특정 신경 단백질 마커에 특이하지 Phalloidin의 병용한다. 기타 단백질 항체는 배양 신경 세포 집단의 특정 식별 이러한 TH 등 Phalloidin의 (티로신 히드 록 실라 제)와 함께 사용될 수있다. 시냅스와 시냅스 형태를 연구하기위한 하나의 일반적인 기술은 면역 세포 (ICC)입니다. 시냅스 단백질에 대한 많은 항체가 PSD (95)을 포함하여 쉽게 사용할 수 있기 때문에 ICC가 인기가있다, (포스트 시냅스)과 synaptophysin에, 바순과 I (사전 시냅스) synapsin NMDAR은 그러나 일부 구조는 ICC (예 : 감지 할 수 없습니다 (11) 얇은 filopodia), 그러나 항체 검출 (또는 두 개의 서로 다른 항체를 두 번 표시와 F - 굴지 Phalloidin의 라벨의 조합) 시냅스 소집단 실험 치료에 차동 응답의 특정 복잡한 조사를 허용 할 수있다. F - 굴지 puncta에이 partic 수있다실험적인 치료에 ularly 민감한. 우리는 최근 HIV-1 문신 단백질 치료가 명백한 신경 세포의 죽음 (48 시간) 10 증거 이전에 F - 굴지 puncta에 (24 시간)의 감소를 생산 보도했다. 그것은 참고 그 실험 처리 할 수​​있다 하나 증가 (메만 틴) 또는 감소 (필로폰 + HIV-1 문신) F - 굴지 puncta에이다. 우리는 또한 F - 굴지 puncta의 손실이 특정 실험 치료 (10) 다음 가역 반응 것으로 나타났습니다. 따라서, F - 굴지 puncta의 정량 급성 synaptopathy뿐만 아니라, 시냅스 복구 및 실험 신경 복원 과정을 공부뿐만 아니라 모니터링하는 유용한 도구입니다.

본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F - 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다. 레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 ​​가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F - 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F - 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을. Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F - 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의 다양한 표현 이산 &quot;핫스팟&quot;또는 밝은 &quot;puncta에&quot;를 생성합니다. 미성숙 등뼈 얇은 filopodia 패치 형태의 일부 형태를 포함하고 spinogenesis 3의 개시를 나타낼 수있다. 미성숙 가시 및 비 - 가시 패치 PSD95 4 부족하다. 뿐만 아니라 등뼈의 후속 변경뿐만 아니라 추가 수지상 구조에 F - 굴지의 납 생산의 변화, 따라서 synaptodendritic 무결성 5-7을 조사하기위한 중요한 도구 Phalloidin의 제작. 일반적으로, Phalloidin의 양성 (F - 굴지) puncta의의 수는 활성 시냅스 사이의 균형 (흥분성과 억제), 굴지 역학과 시냅스 안정성 (8)을 반영한다. 특정 t을 연구하는 중요하지만치료의 대상이 알려지지 않은 경우에 시냅스 (즉, 흥분성 등뼈)의 씨네마 스테이션 먼저 수지상 구조의 다양한 일반 무결성을 추정 할 필요가있다. F - 굴지는 억제 시냅스, synaptopathy을 나타낼 수 F - 굴지 puncta에의 변경 번호를 포함 돌기 쪽과 다른 구조의 주요 구성 요소이기 때문에. 이 synaptopathy는보다 구체적인 변경에 대한 추가 조사를 할 수있다. 여러 시냅스 유형 / 구조를 검출하기위한 우리의 정량화 방법은 다양한 실험적인 치료 다음과 같은 돌기 시냅스 변화 (증가 및 감소)의 전체 추정치를 산출한다.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic solution</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Chicken polyclonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software package</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Nalgene nylon membrane filter</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of filamentous actin (f-actin) puncta in rat cortical neurons

(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F - 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F - 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 - 관련 단백질 2 (수지상 F - 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &amp;에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.

본 발명의 방법에서, 우리는 첫 번째 문화 쥐 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 대뇌 피질의 뉴런. 도 1에있어서, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 일 4, 6, 10, 시험관 내에서 14, 21 및 27에서 태아 래트 피질 뉴런 개발 형태 변화를 나타낸다. 길이와 수상 돌기의 수는 배양 된 쥐 주 신경 세포의 성숙에 따라 증가합니다. 뉴런은 단지 14 일 숙성 한 후 실험에 사용된다. 수상 및 시냅스 변화를 감지하기 위해, 우리는 수상 돌기의 MAP2 항체 검출을 Phalloidin의 F - 굴지 라벨을 결합한다. F 액틴의 Phalloidin의 라벨링 (20-30 분)이 매우 빠르게되기 때문에 시각적 ICC 항체 표지 (도 2를 계속하기 전에 synaptodendritic 네트워크의 무결성을 추정하는 것이 가능하다 </strong&gt;). MAP2는 그대로 돌기를 나타내고 Phalloidin의 얼룩 위에 놓인다. 이것은 F - 굴지 puncta에이 신경 돌기에있는 및 성상 세포 등 다른 세포로 지역화되지 않습니다 확인 할 수 있습니다. 다음으로, 공동 - 표지 Phalloidin의 (F 액틴) / MAP2 뉴런의 높은 해상도 이미지를 획득하고 임의로 선택 뉴런을 분석 하였다. 파인 filopodia, 척추 돌기, 및 F - 굴지 패치는 F - 굴지 풍부한 구조를 고려하고, 우리의 연구 (그림 3)에 포함되었다. (MAP2 양수) 2 차 덴 드라이트의 세그먼트 F 액틴 puncta의 밀도 분석을 위해 선별 하였다. MAP2 긍정적 인 염색은 F - 굴지 puncta에의 신경 현지화를 확인하는 데 사용됩니다. 컴퓨터를 이용한 감지 및 Phalloidin의 (F - 굴지) 표시 (녹색 형광 채널)의 계산은 시냅스 puncta의는 전문 소프트웨어의 사용을 통해 수행되었다. 그림 4의 단계 자세한 프로토콜에 의해 단계가있다 </stroNG&gt; 소프트웨어 패키지의 사용을 설명. 우리는 컴퓨터를 이용한 F-굴지의 계산은 F - 굴지의 수동 계산과 아주 잘 상관 관계가 있고 두 훈련 관찰자 사이의 F - 굴지 puncta의 카운트에 간 관찰자의 상관 관계 (R 2 = 0.97) 매우 높은 것으로보고있다. 이전에, 우리는 HIV-1 문신 유도 synaptopathy (10)로부터 HIV-1 문신 9 및 복구에 의해 유도 synaptodendritic 부상을 평가하기 위해 F - 굴지 puncta에의 정량을 사용했다. 그림 5에서, 쥐의 대뇌 피질의 뉴런은 공동 표시했다 HIV-1 문신 치료의 50 nM의 후 Phalloidin의 및 MAP2 항체. MAP2 염색 적은 수지상 가지를 공개하고 HIV-1 문신 처리 다음 F - 굴지을 감소. 우리는 발견 F - 굴지 puncta의 실험적 치료에 응답하여 증가 또는 감소하거나 할 수있다. 도 6에서 배양 된 뉴런 번째로 처리E 경쟁력 NMDA 수용체 길항제 메만 틴은 크게 F 액틴 양성 puncta의 증가. 대조적으로, 암페타민 + HIV-1 타트의 조합 치료는 F 액틴 puncta에 상당한 손실을 초래. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig1.jpg" /> 그림 세포 배양 1. 태아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 (4) 사이의 태아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 -. 체외에서 27 일 (20 배). 신경 세포는 시험관 14 일째 성숙 나타납니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig2.jpg" /> 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 그림 2. Phalloidin의 / MAP2 공동 라벨. MAP으로 표시 배양 된 뉴런2 항체 (적색)과 Phalloidin의 (녹색). 병합 된 이미지는 Phalloidin의 얼룩은 신경 세포의 수상 돌기 (20 배)에 지역화 결정. 허용 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig3.jpg" /> 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 그림 3. F - 굴지 시냅스 구조. (A) 왼쪽 - Phalloidin의 (60X)로 표시된 F - 굴지 긍정적 인 구조. 화살촉은 F - 굴지 라벨 구조 버섯 쪽이 (보라색), 패치와 같은 형태 (파란색)과 긴 filopodia (오렌지)를 포함 나타냅니다. 중동 -이 F - 굴지 구조를 보여 병합 된 이미지는 수상 돌기 (20 배)로 현지화되어있다. 마우스 오른쪽 - 오른쪽 아래에있는 박스 분석 (20X) 선택 2 차 수지상 분기를 나타냅니다 (B) Phalloidin의 (F-액틴) (녹색) / MAP2의 수지상 세그먼트.<html> (레드) 공동 표지 대뇌 피질의 뉴런 (20X)는 F - 굴지 puncta에의 신경 출처를 확인하는 데 사용됩니다. 녹색 전용 이미지 (Phalloidin의 / F - 굴지)을 추가로 처리됩니다. puncta의 계산으로 선택 세 수지상 세그먼트 (C) Phalloidin의 / F - 굴지 (녹색) 이미지. 밀도는 N / L 분할에 의해 결정됩니다. N = puncta에, L = 수지상 세그먼트의 길이의 수입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig4.jpg" /> 소프트웨어 패키지의 4 데모도 :. 단계별 지침을 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /53697fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. HIV-1 문신은 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에 synaptodendritic 부상을 매개. 세포 배양은 HIV-1 문신 단백질 처리 (50 나노) 후 F - 굴지 및 MAP2에 대한 공동 염색 하였다. 위는 강력한 F - 굴지 복잡한 분기 패턴 및 광범위한 미세 신경 처리를 나타내는 치료 신경을 panels-. 낮은 패널 - F - 굴지 감소 및 감소 수지상 분기와 HIV-1 문신 단백질 처리 신경. (20X)는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53697/53697fig6.jpg" /> 그림 6. F - 굴지 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에서 puncta의 :. 메스 암페타민 + 문신 처리 대 메만 틴에 의해 생성 된 다양한 효과 처리되지 않은 배양 된 신경 세포의 이미지 (20 배), 메만 틴 (10 μM)로 처리 뉴런과 뉴런 Methamph 처리etamine (20 μM) 문신 (10 ㎚)의 10 nM의. 메스 암페타민 + HIV-1 문신 처리가 F - 굴지 염색을 감소 수지상 분기 감소하는 반면 메만 틴 치​​료, F - 굴지 염색 증가했다. 메만 틴 치​​료 크게되지 않은 대조군 배양액에 대하여 F-액틴 puncta의 밀도를 증가. 반면, 메스 암페타민 + HIV-1 문신의 치료는 크게 치료 컨트롤 문화에 대해 F - 굴지 puncta의 밀도를 감소. + SEM 평균, * P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53697/53697fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

12.0K 조회수.  University of South Carolina. Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

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Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become imperative to develop objective approaches to quantify changes in synaptic connectivity. Starting from sample fixation, this protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers. The number of these colocalizations is quantified using a plug in Puncta Analyzer (written by Bary Wark, available upon request, c.eroglu@cellbio.duke.edu) under the ImageJ analysis software platform. The synapse assay described in this protocol can be applied to any neural tissue or culture preparation for which you have selective pre- and postsynaptic markers. This synapse assay is a valuable tool that can be widely utilized in the study of synaptic development.

This protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

연구

신경과학

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is characteristic of disease states like major depressive disorder (MDD) and Alzheimer's disease. Traditional techniques to investigate synapse numbers include genetic expression of fluorescent markers (e.g., green fluorescent protein (GFP)), dyes that fill a neuron (e.g., carbocyanine dye, DiI), and immunofluorescent detection of spine markers (e.g., postsynaptic density 95 (PSD95)). A major caveat to these proxy techniques is that they only identify postsynaptic changes. Yet, a synapse is a connection between a presynaptic terminal and a postsynaptic spine. The gold standard for measuring synapse formation/elimination requires time-consuming electron microscopy or array tomography techniques. These techniques require specialized training and costly equipment. Further, only a limited number of neurons can be assessed and are used to represent changes to an entire brain region. DetectSyn is a rapid fluorescent technique that identifies changes to synapse formation or elimination due to a disease state or drug activity. DetectSyn utilizes a rapid proximity ligation assay to detect juxtaposed pre- and postsynaptic proteins and standard fluorescent microscopy, a technique readily available to most laboratories. Fluorescent detection of the resulting puncta allows for quick and unbiased analysis of experiments. DetectSyn provides more representative results than electron microscopy because larger areas can be analyzed than a limited number of fluorescent neurons. Moreover, DetectSyn works for in vitro cultured neurons and fixed tissue slices. Finally, a method is provided to analyze the data collected from this technique. Overall, DetectSyn offers a procedure for detecting relative changes in synapse density across treatments or disease states and is more accessible than traditional techniques.

DetectSyn is an unbiased, rapid fluorescent assay that measures changes in relative synapse (pre- and postsynaptic engagement) number across treatments or disease states. This technique utilizes a proximity ligation technique that can be used both in cultured neurons and fixed tissue.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

생화학

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of their normal in vivo interactions. Slices obtained from a variety of transgenic mouse lines or use of viral vectors for expression of fluorescently tagged proteins or reporters in wild type brain slices allow for high-resolution imaging by fluorescence microscopy. Although several methods have been developed for imaging brain slices, combining slice culture with the ability to perform repetitive high-resolution imaging of specific cells in live slices over long time periods has posed problems. This is especially true when viral vectors are used for expression of exogenous proteins since this is best done in a closed system to protect users and prevent cross contamination. Simple modifications made to the roller tube brain slice culture method that allow for repetitive high-resolution imaging of slices over many weeks in an enclosed system are reported. Culturing slices on photoetched coverslips permits the use of fiducial marks to rapidly and precisely reposition the stage to image the identical field over time before and after different treatments. Examples are shown for the use of this method combined with specific neuronal staining and expression to observe changes in hippocampal slice architecture, viral-mediated neuronal expression of fluorescent proteins, and the development of cofilin pathology, which was previously observed in the hippocampus of Alzheimer's disease (AD) in response to slice treatment with oligomers of amyloid-&#946; (A&#946;) peptide.

Presented here is a modified roller tube method for culturing and intermittent high-resolution imaging of rodent brain slices over many weeks with precise repositioning on photoetched coverslips. Neuronal viability and slice morphology are well maintained. Applications of this fully enclosed system using viruses for cell-type specific expression are provided.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

생물학

Quantification of Filamentous Actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Source: Li, H., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53697">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the procedure for fluorescently staining rat cortical neurons for microscopy. It targets F-actin and dendritic proteins to analyze structural integrity and calculate F-actin density, which is crucial for studying neuronal function and health.

쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

1. Fluorescent Labeling and Immunocytochemistry
Note: The immunofluorescent labeling of primary cortical cell cultures was carried out in glass bottom 35 ...