Name: generating a "humanized" drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

우리는 키네신-5 구조의 선물 패트리샤 워즈워스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은, 찰스 H. 후드 재단, Inc.의 TJM 및 연구비 번호 TJM에 다임 재단 3 월에서 5 FY13-205뿐만 아니라 지원에 의해 NIH 교부금 (5 R01 GM107026)에 의해 지원되었다 보스턴. TJM에

1. 형질 S2 세포 <ol><li> 이전에 배양 25cm 2 플라스크에서 그들을 100 % 포화 상태에서 2 ML의 최종 볼륨에 GFP-α-tubulin의 발현 S2 세포 (10)를 추가 할 수 35mm 조직 배양 접시의 밑바닥에 반 준수 약 1 시간. </li><li> 요리에서 용지를 제거합니다. Eg5-mCherry의 형질 2 μg의 10 % FBS와 보충 슈나이더의 미디어 (11) 1 mL로 구성 제조사의 프로토콜에 따라 (슈나이더의 미디어이라고 함) 및 형질 시약. 파라 필름으로 요리를 밀봉하고 16 ~ 18 시간 동안 25 ° C에서 세포를 배양한다. </li><li> 슈나이더의 미디어의 1 ML을 추가합니다. 25 ° C 배양기에 세포를 돌려줍니다. </li><li> 3 일 후 - 형질 전환에있어서, 테스트 유도 슈나이더의 매체를 함유하는 1.5 ml의 새로운 35mm 조직 배양 접시에 형질 감염된 세포 500 μl를 옮긴다. CuSO 4 가산함으로써 Eg5-mCherry의 발현을 유도 </sub&gt; 500 μM의 최종 농도. 파라 필름의 요리를 밀봉하고 25 ° CO / N에 품어. </li><li> 콘 카나 발린 A를 코팅 된 커버, 코트에 대한 해결책 (0.5 밀리그램 /가 ㎖의 H 2 O에 용해)을 콘 카나 발린의 피펫 충분한 볼륨을 만들기 위해 산 세척 coverslip에, 과잉을 제거하고 자연 건조로 커버 슬립을 할 수 있습니다. </li><li> 후 커버 슬립 상 유도 세포의 100 % 컨 플루 500 μL를 시드, 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 22mm X 22mm의 콘 카나 발린 A를 코팅 커버 슬립을 넣고 세포를 1 시간 동안 실온에서 접착 할 수있다. </li><li> , Eg5-mCherry 발현을 확인 형광 현미경에 실온에서 이미징 미디어와 장미 챔버로 coverslip에 (또는 적절한 영상 용기)를 조립합니다. 세포를 시각화하기 위해 적절한 광원과 필터 세트를 사용합니다. 예를 들어,이 연구에서 사용 된 현미경은 백색 LED 광원 및 EGFP (FITC / CY2)과을 DsRed (TRITC / Cy3에) 필터 큐브가 있습니다. Eg5-mCherry는 미세 소관에 지역화 및 동북아을 충실R 스핀들 기둥. </li><li> 확인한 후 세포 Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 양을 표현하는 것을, 슈나이더의 매체를 함유하는 4 ml의 25cm 2 조직 배양 플라스크에 형질 감염 세포의 유도되지 않은 나머지 부분을 전송. </li><li> 형질 세포의 플라스크에 25 ㎍ / ml의 최종 농도 블라스트 S HCL을 추가하고 세포 사멸이 주기적으로 Eg5-mCherry의 발현을 확인해야되고 중단 될 때까지 25 μg의 / ㎖ 블라스트 S 염산의 존재 분할을 계속합니다. 25 ° C 배양기에서 세포 라인을 품어. 참고 : 시간이 지남에 Eg5-mCherry 증가를 발현하는 세포의 비율입니다. </li><li> 세포가 안정적으로 형질 전환되면, 약물의 부재 분할 및 향후 사용을 위해 12 세포를 동결하는 것을 계속한다. </li></ol> 2. RNA 간섭 <ol><li> PCR은 수 (자료 목록에서 제공하는 순서) 추가 T7 프로모터 시퀀스와 프라이머를 사용하여 cDNA를 (LD15641)에서 Klp61F의 ~ 500 bp의 영역을 증폭dsRNA를 합성을위한 템플릿으로 사용. <ol><li> 주형 DNA의 100 NG, 각각의 프라이머, 적절한 버퍼, 및 중합 효소의 25 μm의를 포함하는 4 개의 PCR 반응, 50 μL 각을 설정합니다. 중합 효소의 제조 업체의 프로토콜에 따라 열 순환기에 PCR 프로토콜을 설정합니다. </li><li> 수영장, PCR 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 청소하여 깨끗한 네 PCR 반응. -20 ° C에서 깨끗한 템플릿을 저장합니다. </li></ol></li><li> , T7 RNA의 전사 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 템플릿에서 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 준비합니다. dsRNA를 ~ 5 ~ 15 ㎎ / ㎖ 농도를 기대합니다. -20 ° C에서 dsRNA를 저장합니다. </li><li> dsRNA를 함께 Klp61F을 최저하려면 25 %의 포화 상태에서 Eg5-mCherry을 표현 S2 세포를 1 시간 동안 35mm 조직 배양 접시의 바닥에 반은-을 준수 할 수 있습니다. </li><li> 요리에서 용지를 제거하고 Klp61F에 dsRNA에 5 μg의 추가 (초파리 키네신-5) 혈청 슈나이더 1 ㎖로 희석 &#39;S 매체. </li><li> 다음 10 % FBS와 슈나이더의 미디어 1 ㎖를 추가, 1 시간 동안 실온에서 품어. 25 ° C에서 세포를 품어. </li><li> dsRNA를 24 시간 처리 한 후, 500 μM의 최종 농도 CuSO 4를 가산함으로써 Eg5-mCherry의 발현을 유도한다. 또 다른 24 시간 동안 25 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 3. 라이브 세포 이미징 <ol><li> 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 코팅 coverslip에 콘 카나 발린 22mm X 22mm를 놓습니다. </li><li> dsRNA를 시드로 처리하고 유도 O / N 콘 카나 발린 A를 커버 슬립 상에 도포하고 약 1 시간 동안 부착 할 수있게되어 전지의 500 μL. </li><li> 이미징을위한 장미 챔버로 coverslip에 (또는 적절한 용기)를 조립합니다. </li><li> Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 모두를 표현하는 유사 분열 세포를 찾아보십시오. 참고 : 스핀들 양극성 필요 Klp61F, 이후 단극 스핀들을 가져야 만 GFP-α-tubulin의 표현 유사 분열 세포는 10,13 무너 뜨렸다됩니다. </li><li> Eg5-mCherry 및 GFP-α-tubulin의 모두를 발현하는 세포에 바이폴라 스핀들 (분당 예를 들어, 1 프레임)의 시간 경과 이미지를 수집합니다. </li><li> 촬영하는 동안, 장미 실에서 용지를 제거하고 슈나이더의 미디어 스핀들 붕괴를 시각화하기 위해 챔버로 3 연속 미디어 교류 (~ 5 ㎖의 합계) 이상 1 ㎛의 STLC를 포함로 교체합니다. </li><li> 조심스럽게 장미 실에서 STLC 함유 매체를 제거하고 신선한 미디어와 장미 챔버 마지막으로 한 시간을 보충하기 전에 슈나이더의 미디어 4 배 (6-8 ml의 합계)에서 세척, 약물을 세척 및 스핀들 붕괴를 반대합니다. 영상을 계속합니다. </li></ol> 4. 오류 수정 분석 <ol><li> 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 코팅 된 커버 콘 카나 발린 22mm X 22mm를 놓습니다. </li><li> 씨 콘 카나 발린 A를 코팅 커버 슬립에 Klp61F dsRNA를 처리하고이를 준수 할 수있게 된 세포 500 μL. </li><li> 세포 후 adher 있습니다에드, 2 ml의 최대 최종 볼륨을 가지고 각각의 접시에 슈나이더의 미디어 1.5 ml를 추가합니다. </li><li> 유사 분열 세포 체포 요리 각각 10 μM의 최종 농도 MG132을 추가 1 시간 동안 배양. </li><li> 1 μM의 STLC를 추가하고 단극이 형성 할 수 있도록 1 시간 동안 품어. </li><li> 커버 슬립이 신선한 슈나이더의 미디어 2 ㎖마다와 배 세척하여 STLC을 세척 할 것. </li><li> 제어와 같은 약물 약물 (예를 들어, 오로라 키나제 억제제) 또는 DMSO에 추가 슈나이더의 미디어와 커버 슬립을 품어. 주 : 억제제의 농도는 다양하고 적절한 최종 농도는 실험에 의해 결정되어야한다. 미디어로 1,000 : 스톡 용액은 일반적으로 1 억제제는 희석되도록 만들어진다. 이 경우에는 1 : DMSO (또는 적절한 용매) 1,000 희석 차량 제어로서 기능한다. 우리는 40 μM의 최종 농도 오로라 B 억제제 Binucleine 2를 사용한다. </li><li> 다른 시점 t에서 세포를 수정O 바이폴라 스핀들 형성의 진행을 관찰하고 동원체 부착 상태를 평가하기 위해. 고치다: <ol><li> 신속 1X BRB-80의 2 mL로 된 커버를 씻어. </li><li> 10 분 동안 1X BRB-80에서 희석 된 10 % 파라 포름 알데히드 2 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 화학 후드에서 조심스럽게 피펫 파라 포름 알데히드. </li><li> 8 분 1X PBS + 1 % 트리톤-X의 2 ml의 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-2 ㎖로 배를 슬라이드. </li><li> 전송 세포 측 150mm 배양 접시에 (파라 필름 라벨 마커를 사용하여 적절하게 슬라이드를 추적하기 위해) 파라 필름 한 장에 최대 직면 된 커버. </li><li> 150 μL 삶은 당나귀 혈청 (BDS)으로 된 커버를 덮고 결합 비 특이 항체를 차단하기 위해 1 시간 동안 실온에서 품어. 주 : 여기에서, 고정 프로토콜은 이후 시점에서 계속 정지 할 수있다. 커버 슬립은 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 습도 챔버 내에 저장 될 수있다. 습기 챔버를 만들려면, 150mm 접시의 가장자리 라인젖은 실험실로 닦아 페트리 접시 뚜껑 커버. </li><li> 각각 ㎍ / mL 및 1 (제조업체의 권장 사항에 따라 또는) 블록을 제거하고 일차 항체 150 μL 2 μg의 / ㎖의 최종 농도에 kinetochores 및 미세 소관에 대한 얼룩 BDS에 적절히 희석하여 실온에서 1 시간 동안 된 커버를 품다 . 주 : 여기에서, 고정 프로토콜은 이후 시점에서 계속 정지 할 수있다. 커버 슬립은 최대 24 시간 동안 4 ℃에서 습도 챔버 내에 저장 될 수있다. </li><li> 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-500 μL와 배 된 커버. </li><li> BDS에 희석 적절한 형광 - 복합 이차 항체 실온에서 30 ~ 60 분 동안 커버 슬립을 품어. </li><li> 워시는 1X PBS + 0.1 % 트리톤 X-500 μL와 배 된 커버. </li><li> 5 분 동안 1 μg의 / ㎖ DAPI 최종 농도를 포함하는 BDS의 150 μL와 커버 슬립을 품어. </li><li> 커버 슬립 배와 1X PBS + 0.1 % 트리톤-X를 세척하고, C 마운트overslips 아래로 미디어를 장착의 8 μL와 3 × &quot;슬라이드에 세포 쪽. 슬라이드로 된 커버를 고정하는 매니큐어와 모서리를 페인트합니다. </li></ol></li><li> Eg5-mCherry을 표현하고 있습니다 바이폴라 스핀들과 이미지 세포. 100X 목적을 사용하여 모든 채널에서 0.2 μm의 간격에서 30면으로 구성된 Z 시리즈를 가져 가라. 조심스럽게 부착 (이 bioriented 또는 syntelic 첨부) 상태를 결정하기 위해 kinetochores 및 미세 소관을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

오류 정정을 떠올리이 중요하고 복잡한 세포 과정에 관련된 단계를 연구하는 유용한 기술이다. 이를 위해, 잘못된 첨부 가역적 억제제를 사용하여 생성되고, 에러 정정이 약물의 유실시에 관찰된다. 이 분석은 원래 포유 동물 조직 배양 세포 (5)를 사용하여 개발되었습니다. 그러나 많은 모델 포유 동물 세포 유형에 kinetochores 다수의 존재는 각각의 에러 정정 이벤트를 관찰하는 도전 포즈. 초파리 S2 세포는 에러 정정을 관찰 그들을보다 바람직한 세포주 올라서 kinetochores의 적은 4 등의 쌍을 갖는다. 그러나, 주요 단점은 많은 억제제 초파리 S2 세포에서 효과가 있다는 것이다. 따라서, 인간 키네신 -5- 발현 인간화 초파리 S2 세포주를 생성하는 능력은 오류 정정을 연구하는 유용한 도구를 제공한다. 초파리 S2 세포가 될 수 있지만오류 정정을 연구 나은 세포주 세포주를 획득하고 필수적인 유전자를 넉다운에 관련된 여러 단계는이 기술에 일부 문제를 야기. 예를 들어, 형질 전환 효율은 매우 낮을 수있다. 세포의 20 % 미만이 Eg5-mCherry을 표현하는 경우 선택 프로세스가 오래 걸릴 같이 형질 반복한다. 또한, 두 형광 단백질을 발현하는 세포의 비율은 시간 경과에 따라 감소 될 수 있습니다. 이것은 각각 Eg5-mCherry를 발현하는 세포 및 GFP-α-tubulin에 대한 선택 블라스트 S HCl 및 하이 그로 마이신 B의 존재 하에서 세포를 분할함으로써 극복 될 수있다. 그것은 초파리 S2 세포는 사람의 단백질과에 orthologues이 점에 유의하는 것이 중요하다; 따라서, 내인성 단백질 최저 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 최적의 최저 조건은 dsRNA에의 양 및 치료의 길이에 따라 다를 수 있습니다. 등장과의 신속한 개선을 고려 CRISPR을-Cas9은 technologi15-17 ES 인간 Eg5 대체 Klp61F 유전자 초파리 세포주의 생성 및 형질 녹다운 방식의 한계를 극복 할 수있는 강력한 대안을 제시한다. 우리의 작업은 필요 시약이 현재 개발되고있다 초파리 S2 세포에서 그렇게 비록 플라이 투 인간 유전자 여분이 경우 가능한 옵션 일 수 있음을 입증한다. 이 절차는 Eg5에 한정되지 않고, 다른 관심 단백질의 기능을 연구에 적용 할 수있다. 이전에 초파리 S2 세포에서 효과가 설립 된 억제제를 사용하는 경우,이 프로토콜은 오프 대상 효과에 대한 우려없이 살아있는 세포에서 억제제의 직접적인 영향을 연구하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여 생산 세포주는 또한 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수있는 오류 정정에 관여하는 단백질을 표적 잠재적 약물을 식별하기 위해 분석한다.

세포 분열 동안 게놈의 평등 분리는 복제 된 DNA와 스핀들 미세 소관 사이의 올바른 상호 작용을 필요로한다. 미세 소관은 물리적으로 동원체 1로 알려진 동원체에 조립 단백질의 앙상블을 통해 염색체와 상호 작용합니다. 염색체의 정확한 분포는 자매 kinetochores가있는 각 자매가 반대 스핀들 극에서 발생하는 미세 소관과 관련된, bioriented되어 있어야합니다. 동원체의 미세 소관은 (는 KT-MT) bioriented 형태가 아닌 첨부 신속하고 효율적으로 오류 정정으로 알려진 프로세스에서 biorientation을 확립 할 수있는 기회를 제공하기 위해 불안정화된다. 이전에 포유 동물 세포에 설립되었습니다 오류 정정 분석 5 (키네신-5) Eg5에 대해 가역 작은 분자 억제제를 사용하여 모노 폴라 스핀들 조립이 필요합니다. 약물 치료는 잘못된 syntelic 첨부 파일의 다수를 생성하는 봇에시간 자매 kinetochores는 같은 스핀들 극에 연결합니다. 약물의 후속 세척는 에러 정정 프로세스의 시각화를 허용한다. 에러 정정 분석은 오 KT-MT 첨부 보정에 후보 단백질의 기여를 연구하는 소분자 억제제 또는 knockdowns의 존재 하에서 수행 될 수있다. 살아있는 세포에서 오류 정정을 시각화하는 능력은 더 복잡한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 대부분의 세포주에 존재하는 염색체의 다수의 개별 KT-MT 첨부 관찰에 도전 포즈. 그들은 적은 4와 같은 염색체 6 있지만의 소분자 저해제를 포함로서 초파리 S2 세포는 에러 정정 분석을 가하는 것이 이상적 이러한 S-틸 L 시스테인 (STLC)로 키네신 5, 7-9 monastrol는 초파리 세포에서 스핀들 어셈블리 또는 키네신-5 운동 기능에 영향을주지 않습니다. 따라서 우리는 장군테드 키네신-5 억제제에 민감 유도 성 프로모터에서 인간의 키네신-5 표현하는 초파리 S2 세포주. 이 프로토콜은 내인성 초파리 키네신 -5- 동족체, Klp61F를 녹다운 및 세포 기반 에러 정정 분석에서이 세포주를 사용하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F 양극성 스핀들을 형성하는 것이 필요하다. 인간 키네신 -5,6- Eg5는 초파리 S2 세포 (도 1A 및 D)에서의 Klp61F 함수를 구출 할 수있다. 키네신-5 억제제 (STLC)의 첨가시, 성공적인 RNAi에 따라 내인성 Klp61F 부족한 세포 모노폴 (도 1C 및 F)의 결과로 모터 강하 (도 1b 및 E), 및 스핀들 붕괴의 미세 소관 - 연관된 레벨 (보충 영화 1). 그것은 -5- 키네신 활성은 인간 세포에서 스핀들 양극성을 유지하기 위해 필요하지 않으므로 바이폴라 스핀들 인간화 S2 세포 STLC의 첨가시 붕괴 것이 주목할 만하다. 흥미로운 차이는 두 모델 시스템 (14)의 극간 미세 소관 중첩 및 / 또는 안정성의 차이의 결과 일 수있다. 키네신 -5- 억제 (도 2A 및 E)은 브 될 수있다<html> 바이폴라 스핀들의 약물 및 복구를 세척하여 rsed 시간이 지남에 따라 할 수있다. 억제제 (그림 2B와 F)를 제거하여, Eg5-mCherry는 바이폴라 스핀들 조립 (그림 2C 및 G)와 미세 소관과-동료를 다시하고, 세포는 바이폴라, anaphase (핵분열 말기) (그림 2D 및 H, 보충 영화 2로 진행 할 수 있습니다 ). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> 1. 추가 1 μM의 STLC의 그림은 초파리 S2 세포에서 단극 스핀들로 연결. 대표 이미지를 Eg5-mCherry (AC)과 GFP-α-tubulin의 (DF) 표현하는 초파리 S2 세포의 시간 경과 영상에서 1 ㎛의 첨가시 STLC. Eg5 억제제는 3 분으로 첨가 하였다. 스케일 바 = 5 μm의. 타임 스탬프 = 분 : 초.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> 그림 2. STLC를 제거하여 양극성 스핀들 개혁. STLC의 세척 실험 중에 Eg5-mCherry (AD)와 GFP-α-tubulin의 (EH)를 표현하는 초파리 2 셀의 시간 경과 영상에서 대표 이미지. STLC는 5 분에서 밖으로 세척 하였다. STLC을 제거하는 1 시간 이내 양극성 스핀들 개혁. 스케일 바 = 5 μm의. 타임 스탬프 : 분 :. 초 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt; 보충 영화 1. (오른쪽 다운로드를 클릭). 위드의 형광 이미징을 Eg5-mCherry을 표현하는 초파리 S2 셀의 대표적인 예의 ( 왼쪽) 및 GFP-α-tubulin의 (오른쪽) 1 μM의 STLC은 2 분으로 첨가하고, 스핀들 형태 억제제의 첨가 후 10 분 이내에 모노폴이. 이미지는 매 1 분을 취득하고 10 프레임의 속도로 재생되었다. 초당. 스케일 바 = 5 μm의. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">보충 동영상 2. (오른쪽 다운로드를 클릭).</a> Eg5-mCherry (왼쪽)와 GFP-α-tubulin의 (오른쪽)를 표현하는 초파리 S2 세포의 대표적인 예 위드 형광 이미징. 1 μM의 STLC를 함유 배지를 제거하고,5 분에 세척. 억제제를 제거하는 1 시간 이내 양극성 스핀들 개혁. 이미지는 매 1 분을 취득하여 초당 10 프레임의 속도로 재생되었다. 스케일 바 = 5 μm의.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

&quot;인간 답게&quot;를 생성<em&gt; 초파리</em키네신-5의 약리 억제에&gt; S2 세포주 민감성

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K 조회수.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

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Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

연구

유전학

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

신경과학

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

발생학

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

생물학

초파리에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

저자 스포트라이트: Drosophila Embryos의 상피 장력 측정과 결합된 Rho1 매개 Actomyosin 수축성의 광유전학적 억제  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

"인간 답게"를 생성

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Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

의 준비 Drosophila S2 세포

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아