Name: generating a "humanized" drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Patricia Wadsworth per il dono della kinesin-5 costrutto. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (5 R01 GM107026) a TJM e Research Grant n ° 5-FY13-205 dal marzo di Dimes Fondazione TJM, così come il sostegno della Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. a TJM

1. Le celle trasfettando S2 <ol><li> Da 25 cm 2 beuta precedentemente coltivate, aggiungere GFP--tubulina esprimono alfa cellule S2 10 ad un volume finale di 2 ml al 100% di confluenza, e consentire loro di semi-aderire al fondo di un piatto di coltura di tessuti 35 mm per di circa 1 ora. </li><li> Rimuovere il supporto dal piatto. Transfect 2 ug del Eg5-mCherry costruire 11 con 1 ml di mezzi di Schneider integrato con il 10% FBS (di seguito indicata come mezzi di Schneider) e Transfection Reagent, seguendo il protocollo del produttore. Sigillare il piatto con Parafilm e incubare le cellule a 25 ° C per 16-18 ore. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzi di Schneider. Cellule tornare a 25 ° C incubatore. </li><li> Il giorno 3 dopo la trasfezione, trasferire 500 microlitri di cellule transfettate in un nuovo 35 mm piatto di coltura tissutale contenente 1,5 ml di mezzi di Schneider per una induzione di prova. Indurre l&#39;espressione di Eg5-mCherry aggiungendo CuSO 4 </sub&gt; ad una concentrazione finale di 500 mM. Sigillare il piatto in Parafilm e incubare a 25 ° CO / N. </li><li> Per rendere coprioggetto A rivestite concanavalin, pipetta un volume sufficiente di concanavalina Una soluzione (0,5 mg / ml sciolto in H 2 O) per rivestire un acido lavato vetrino, rimuovere l&#39;eccesso, e consentire il vetrino all&#39;aria secca. </li><li> Inserire un x 22 mm concanavalina rivestite coprioggetto 22 mm in 35 mm piatto di coltura di tessuto pulito, poi seminare 500 microlitri al 100% di confluenza delle cellule indotte sul vetrino coprioggetti e permettere alle cellule di aderire per 1 ora a RT. </li><li> Per controllare l&#39;espressione Eg5-mCherry, montare il vetrino in una camera rosa (o opportuno recipiente di imaging) con i media per l&#39;imaging a temperatura ambiente su un microscopio a fluorescenza. Utilizzare fonti di luce appropriati e set di filtri per visualizzare le cellule. Ad esempio, il microscopio utilizzato in questo studio ha una sorgente di luce bianca a LED e EGFP (FITC / Cy2) e DsRed (TRITC / Cy3) cubi filtro. Eg5-mCherry localizza ai microtubuli e si arricchisce neapoli r mandrino. </li><li> Dopo essersi assicurati che le cellule esprimono sia Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, trasferire il resto delle cellule transfettate, uninduced ad un pallone di coltura tissutale 2 25 cm contenente 4 ml di mezzi di Schneider. </li><li> Aggiungere Blasticidin S HCL ad una concentrazione finale di 25 mg / ml al pallone di cellule trasfettate e continuare la divisione in presenza di 25 mg / ml Blasticidin S HCl fino alla morte cellulare cessa di essere sicuri di controllare per l&#39;espressione di Eg5-mCherry periodicamente. Incubare linee cellulari a 25 ° C incubatore. NOTA: La percentuale di cellule che esprimono Eg5-mCherry aumenta nel tempo. </li><li> Una volta che le cellule sono trasfettate stabilmente, continuare a dividere in assenza di farmaco e congelare 12 cellule per uso futuro. </li></ol> 2. RNA Interference <ol><li> PCR amplifica una regione bp ~ 500 di Klp61F da cDNA (LD15641) con fondo con l&#39;aggiunta di sequenza del promotore T7 (nell&#39;ordine indicato in Materiali List) di essereutilizzato come modello per la sintesi dsRNA. <ol><li> Impostare quattro reazioni PCR, 50 ml ciascuno, contenenti 100 ng di DNA stampo, 25 micron di ciascun primer, tampone appropriato, e polimerasi. Impostare il protocollo di PCR sul termociclatore secondo il protocollo del produttore della polimerasi. </li><li> Piscina e pulite quattro reazioni PCR utilizzando una PCR pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Conservare il modello pulito a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparare RNA a doppio filamento (dsRNA) dal modello utilizzando un kit di trascrizione dell&#39;RNA T7, seguendo le istruzioni del produttore. Aspettatevi ~ concentrazione 5-15 mg / ml di dsRNA. Conservare dsRNA a -20 ° C. </li><li> Per Knockdown Klp61F con dsRNA, consentono alle cellule esprimenti Eg5 S2-mCherry a 25% di confluenza semi-aderire al fondo di un piatto di coltura di tessuti 35 mm per 1 ora. </li><li> Rimuovere la carta dai piatti e aggiungere 5 mg di dsRNA contro Klp61F (Drosophila kinesin-5) diluito in 1 ml di Schneider senza siero &#39;s media. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, poi aggiungere 1 ml di mezzi di Schneider con il 10% FBS. Incubare le cellule a 25 ° C. </li><li> 24 ore dopo il trattamento dsRNA, indurre l&#39;espressione di Eg5-mCherry aggiungendo CuSO 4 ad una concentrazione finale di 500 mM. Incubare le cellule a 25 ° C per un altro 24 ore. </li></ol> 3. Imaging Live Cell <ol><li> Posizionare un 22 mm x 22 millimetri concanavalina vetrino rivestito in una piastra da 35 mm di coltura tissutale pulito. </li><li> Seed 500 ml di cellule che sono stati trattati con dsRNA e indotti O / N sul vetrino rivestito concanavalina A e consentire loro di aderire per circa 1 ora. </li><li> Montare il vetrino in una camera rosa (o opportuno recipiente) per l&#39;imaging. </li><li> Trova cellule mitotiche che esprimono sia Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. NOTA: Le cellule mitotiche esprimono solo GFP-α-tubulina dovrebbe avere mandrini monopolare da Klp61F, che è richiesto per il bipolarismo del mandrino, viene abbattuto 10,13. </li><li> Raccogliere time-lapse immagini di fusi bipolari (ad esempio, 1 fotogramma al minuto) in cellule che esprimono entrambi Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. </li><li> Mentre l&#39;imaging, rimuovere il supporto dalla camera rosa, e sostituirlo con i media di Schneider contenente 1 mM STLC su 3 scambi multimediali consecutivi (~ 5 ml totale) nella camera di visualizzare crollo del mandrino. </li><li> Al dilavamento del farmaco e invertire il crollo del mandrino, rimuovere con attenzione il supporto-STLC contenente dalla camera rosa, e lavare in mezzi di Schneider 4x (totale 6-8 ml) prima di riempire la camera di rosa per l&#39;ultima volta con mezzi freschi. Continuare imaging. </li></ol> 4. Errore Assay correzione <ol><li> Posizionare un 22 mm x 22 millimetri concanavalina A coprioggetto rivestiti in clean 35 mm piatti di coltura dei tessuti. </li><li> Seed 500 ml di cellule che sono stati trattati con Klp61F dsRNA sul vetrino rivestito concanavalina A e permettere loro di aderire. </li><li> Dopo che le cellule sono adhered, aggiungere 1,5 ml di mezzi di Schneider per ogni piatto per portare il volume finale fino a 2 ml. </li><li> Per arrestare le cellule in mitosi, aggiungere MG132 ad una concentrazione finale di 10 mM a ciascuno dei piatti, e incubare per 1 ora. </li><li> Aggiungere 1 micron STLC e incubare per 1 ora per permettere monopoli di formare. </li><li> Lavare la STLC risciacquando coprioggetto 3x con 2 ml di mezzi di Schneider fresca ogni volta. </li><li> Incubare coprioggetto con i media di Schneider in aggiunta a tutte le droghe farmacologiche (per esempio, inibitori di chinasi Aurora) o DMSO come controllo. Nota: le concentrazioni variano Inhibitor e proprie concentrazioni finali devono essere determinati dallo sperimentatore. Le soluzioni madre sono tipicamente costituiti in modo tale che l&#39;inibitore è diluito 1: 1000 in media. In questo caso una diluizione 1: 1000 di DMSO (o opportuno solvente) serve come controllo del veicolo. Usiamo l&#39;inibitore Aurora B Binucleine 2 ad una concentrazione finale di 40 mM. </li><li> Fissare le cellule in diversi momenti to osservare la progressione della formazione del fuso bipolare e per valutare gli stati di attaccamento cinetocore. Aggiustare: <ol><li> Lavare rapidamente i coprioggetti con 2 ml di 1x BRB-80. </li><li> Fissare cellule aggiungendo 2 ml di 10% paraformaldeide diluiti in 1x BRB-80 per 10 min. Pipettare paraformaldeide accuratamente in una cappa chimica. </li><li> Permeabilize cellule con 2 ml di PBS 1x + 1% Triton-X per 8 min. </li><li> Lavare i vetrini 3x con 2 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X. </li><li> Trasferimento coprioggetto cella sul lato rivolto verso l&#39;alto su un foglio di Parafilm (utilizzare un pennarello per etichettare Parafilm appropriato per tenere traccia delle diapositive) in una capsula di Petri 150 millimetri. </li><li> Coprire i coprioggetti con 150 microlitri bollito siero asino (BDS) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora per bloccare un legame di anticorpi non specifico. Nota: Qui, il protocollo di fissaggio può essere fermato per essere continuata in un momento successivo. I vetrini possono essere memorizzati in una camera umida a 4 ° C fino a 24 ore. Per rendere la camera umida, allineare il bordo di un piatto 150 mmcon un laboratorio bagnato pulire e coprire con il coperchio piastra di Petri. </li><li> Rimuovere blocco, e incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente con 150 ml di anticorpi primari diluiti in modo adeguato in BDS colorare per cinetocori e microtubuli a concentrazioni finali di 2 mg / ml (o secondo le indicazioni del produttore) e 1 mcg / ml, rispettivamente, . Nota: Qui, il protocollo di fissaggio può essere fermato per essere continuata in un momento successivo. I vetrini possono essere memorizzati in una camera umida a 4 ° C fino a 24 ore. </li><li> Lavare coprioggetto 3x con 500 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X. </li><li> Incubare vetrini per 30-60 minuti a temperatura ambiente con gli opportuni anticorpi secondari fluoroforo coniugato diluiti in BDS. </li><li> Lavare coprioggetto 3x con 500 ml di PBS 1x + 0,1% Triton-X. </li><li> Incubare coprioggetto con 150 ml di BDS contenenti 1 mg / ml DAPI concentrazione finale per 5 minuti. </li><li> Lavare coprioggetto 2x con PBS 1x + 0,1% Triton-X, e montare coverslips lato della cella verso il basso su una diapositiva 3x1 &quot;con 8 ml di mezzo di montaggio. dipingere le curve con smalto per immobilizzare i coprioggetti su vetrini. </li></ol></li><li> Celle di immagine con mandrini bipolari che esprimono Eg5-mCherry. Prendete una serie Z composto da 30 piani a 0.2 micron intervalli in tutti i canali con un obiettivo 100X. Analizzare attentamente i cinetocori e microtubuli per determinare gli stati di attacco (biorientato o allegati syntelic). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Visualizzare la correzione degli errori è una tecnica preziosa per studiare le fasi di questo processo cellulare importante e complesso. Per farlo, gli allegati erronei vengono generati utilizzando inibitori reversibili, e la correzione degli errori, si osserva su washout del farmaco. Questo test è stato originariamente sviluppato utilizzando cellule di coltura dei tessuti dei mammiferi 5. Tuttavia la presenza di un gran numero di cinetocori in molti tipi di cellule di mammifero modello rappresenta una sfida nell&#39;osservare singoli eventi di correzione di errore. Cellule di Drosophila S2 possiedono come pochi come 4 paia di cinetocori, rendendoli una linea cellulare più preferibile per osservare la correzione degli errori. Tuttavia, un grave inconveniente è che molti inibitori sono inefficaci in cellule di Drosophila S2. Così, la capacità di generare una linea di cellule di Drosophila S2 umanizzato esprimendo umana kinesin-5 offre un valido strumento per studiare la correzione degli errori. Sebbene le cellule di Drosophila S2 possono esseremeglio linea cellulare di studiare la correzione degli errori, i diversi passaggi necessari per ottenere la linea cellulare e abbattendo geni essenziali pone alcune sfide a questa tecnica. Per esempio, l&#39;efficienza di trasfezione può essere molto bassa. Se meno del 20% delle cellule sono esprimendo il Eg5-mCherry, la trasfezione deve essere ripetuto il processo di selezione richiederà più. Inoltre, la percentuale di cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti entrambi può diminuire nel tempo. Questo può essere superata suddividendo cellule in presenza di HCl Blasticidin S e Hygromycin B per selezionare cellule esprimenti Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, rispettivamente. E &#39;anche importante notare che le cellule di Drosophila S2 hanno ortologhi a molte proteine ​​umane e; Pertanto, è fondamentale per ottimizzare le condizioni smontabili per le proteine ​​endogene. Condizioni ottimali possono variare abbattibili nella quantità di dsRNA e la durata del trattamento. Considerando la nascita e rapido miglioramento di CRISPR-Cas9 technologies 15-17, generazione di una linea di cellule di Drosophila con il gene Klp61F sostituito da Eg5 umana presenta una potente alternativa che superare i limiti della trasfezione e approccio knockdown. Il nostro lavoro dimostra che volare a uomo sostituzione del gene dovrebbe essere una valida opzione in questo caso, anche se i reagenti necessari per farlo in cellule di Drosophila S2 sono attualmente in fase di sviluppo. Questa procedura non è limitato a Eg5, ma può essere applicato per studiare la funzione di altre proteine ​​di interesse. Se si utilizza inibitori che sono stati stabiliti in precedenza per essere inefficace in cellule di Drosophila S2, questo protocollo può essere modificato per studiare l&#39;effetto diretto degli inibitori in cellule vive senza preoccupazioni circa gli effetti di destinazione off. La linea cellulare prodotta usando questo protocollo potrebbe essere utilizzato anche in screening ad alto rendimento analisi per identificare potenziali farmaci destinati proteine ​​coinvolte nella correzione degli errori.

Uguale la segregazione del genoma durante la divisione cellulare richiede corrette interazioni tra il DNA e mandrino microtubuli replicati. I microtubuli interagiscono fisicamente con cromosomi attraverso un insieme di proteine ​​che si raduna a centromeri conosciuto come il cinetocore 1. Corretta distribuzione dei cromosomi che richiede cinetocori sorella sono biorientato, in cui ogni sorella è associata microtubuli provenienti da opposti poli del fuso. Cinetocore microtubuli (KT-MT) gli allegati che non sono nella conformazione biorientato stanno rapidamente ed efficientemente destabilizzata per fornire l&#39;opportunità di stabilire biorientazione in un processo noto come la correzione degli errori. Un saggio di correzione di errore che è stato precedentemente stabilito in cellule di mammifero 5 richiede il montaggio mandrini monopolare utilizzando inibitori molecolari reversibili piccoli contro Eg5 (kinesin-5). Il trattamento farmacologico genera una moltitudine di accessori syntelic erronee in cui botcinetocori h sorella attribuiscono alla stesso polo del mandrino. Una successiva washout del farmaco permette la visualizzazione del processo di correzione degli errori. Il dosaggio di correzione di errore può essere effettuata in presenza di piccole molecole inibitrici o abbattimenti di studiare il contributo delle proteine ​​candidate per correggere errati allegati kt-MT. La possibilità di visualizzare la correzione degli errori nelle cellule viventi è un potente strumento per capire meglio il meccanismo molecolare coinvolto in questo processo complesso. Tuttavia, il numero di cromosomi presenti nella maggior parte delle linee cellulari rappresenta una sfida nell&#39;osservare singoli allegati kt-MT. Cellule di Drosophila S2 sarebbe ideale per applicare il saggio correzione di errore in quanto contengono come pochi come 4 cromosomi 6, ma piccole molecole inibitrici di kinesin 5 come S-tritil-L-cisteina (STLC) e monastrol 7-9 non influenzano l&#39;assemblaggio del fuso o la funzione kinesin-5 motore in cellule di Drosophila. Pertanto generita una linea cellulare che esprime Drosophila S2 chinesina-5 umana sotto un promotore inducibile che è sensibile alla chinesina-5 inibitori. Questo protocollo descrive come knockdown endogeno Drosophila kinesin-5 omologo, Klp61F, e utilizzare questa linea cellulare nel dosaggio di correzione degli errori cell-based.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F è tenuto a formare fusi bipolari. Il kinesin-5 umano, Eg5, può salvare la funzione di Klp61F nelle cellule di Drosophila S2 (Figura 1A e D). Dopo aggiunta dell&#39;inibitore chinesina-5 (STLC), livelli associate ai microtubuli del calo motore (Figura 1B e E), e crolli mandrino, risultando in un monopolo (Figura 1C e F) in cellule privo endogena Klp61F su RNAi successo (movie supplementare 1). È interessante notare che fusi bipolari crollo dopo l&#39;aggiunta di STLC nelle cellule S2 umanizzati perché kinesin-5 attività non è necessaria per mantenere bipolarismo fuso nelle cellule umane. Questa discrepanza interessante potrebbe essere il risultato di differenze nella interpolar sovrapposizione e / o la stabilità dei microtubuli nei due sistemi modello 14. Kinesin-5 inibizione (Figura 2A e E) possono essere reve<html> rsed lavando il farmaco e il recupero di un fuso bipolare può essere seguita nel tempo. Alla rimozione dell&#39;inibitore (Figura 2B e F), Eg5-mCherry ri-soci con i microtubuli come un bipolare assembla mandrino (Figura 2C e G), e le cellule in grado di progredire in un anaphase bipolare (Figura 2D e H, film supplementare 2 ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;aggiunta di 1 micron STLC porta a mandrini monopolare nelle cellule di Drosophila S2. Immagini rappresentative da time-lapse immagini di una cella Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry (AC) e GFP-α-tubulina (DF) durante l&#39;aggiunta di 1 micron STLC. L&#39;inibitore Eg5 è stato aggiunto a 3 min. Barra di scala = 5 micron. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figura 2. Un riforme fuso bipolare su rimozione di STLC. Immagini rappresentative di time-lapse imaging di una cella 2 Drosophila che esprimono Eg5-mCherry (AD) e GFP-α-tubulina (EH) nel corso di un esperimento STLC washout. STLC è stato lavato fuori a 5 min. A riforme fuso bipolare entro 1 ora di rimuovere il STLC. Barra di scala = 5 micron. Timestamp: min. Sec <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Movie supplementare 1. (clic destro per il download). Widefield imaging di fluorescenza di un esempio rappresentativo di una cella di Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry ( sinistra) e GFP-α-tubulina (destra). 1 mM STLC stato aggiunto a 2 min, e le forme mandrino un monopolo entro 10 min dopo l&#39;aggiunta dell&#39;inibitore. immagini sono state acquisite ogni 1 min e riprodotto ad una velocità di 10 fotogrammi al secondo. Barra di scala = 5 micron. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Movie supplementare 2. (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> Widefield imaging di fluorescenza di un esempio rappresentativo di una cella di Drosophila S2 esprimere Eg5-mCherry (a sinistra) e GFP-α-tubulina (a destra). Supporti contenenti 1 micron STLC è stato rimosso erisciacquato a 5 min. A riforme fuso bipolare entro 1 ora di rimuovere l&#39;inibitore. Le immagini sono state acquisite ogni 1 minuto e giocato ad una velocità di 10 fotogrammi al secondo. Barra di scala = 5 micron.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generazione di un &quot;umanizzato&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Cell Line Sensibile alla farmacologica L&#39;inibizione di Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Views.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

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Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Ricerca

Genetica

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Neuroscienze

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Un'analisi Cell-based per indagare Non muscolo-miosina II contrattilità tramite la gastrulazione piegato la via di segnalazione in cellule di Drosophila S2R +

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Biologia dello sviluppo

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Biologia

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 in Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Autore in primo piano: Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Generazione di un "umanizzato"

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

Un'analisi Cell-based per indagare Non muscolo-miosina II contrattilità tramite la gastrulazione piegato la via di segnalazione in cellule di Drosophila S2R +

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni