Name: development of a backbone cyclic peptide library as potential antiparasitic therapeutics using microwave irradiation
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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우리는 도움이 토론 로렌 반 Wassenhove, Sunhee 황, 그리고 다리아 Mochly-로젠 감사합니다. 출자자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다 NQ하는 작업은 건강 그랜트 NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 장비 및 시약 준비 <ol><li> 준비 장비 <ol><li> 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 화학적 (유리 프릿 30 ㎖) 테프론 반응 용기에서 마이크로파 전력 공급을 제어하기위한 광섬유 온도 프로브가 장착 저가의 부가 모듈과 마이크로 웨이브 펩티드 합성기를 사용하여 고체 지지체 상에 또는 일회용 폴리 프로필렌의 펩티드를 합성 카트리지 (거친 프릿 12 ml의). </li><li> 적절한 혼합을 위해, 반응 용기에 질소의 공급을 연결하거나, 대안 적으로, 폴리 프로필렌 카트리지의 양단을 밀봉하고, 로터리 셰이커에 배치했다. </li><li> 반응 혼합물 또는 세척을 배출, 폐기물 트랩을 통해 집 진공에 연결합니다. </li><li> 반응 용기에 광섬유 프로브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 시약 준비 <ol><li> 링크 (Rink) 아미드 AM 수지 100-200 메시를 계량하여 수지를 제조 (0.204 mg)을제대로 팽창 2-4 시간 동안 흔들어 아래로 수지를 세척 및 배수에 대한 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지에 N의 1 혼합물, N- 디메틸 포름 아미드 (DMF) / 디클로로 메탄 (DCM), 1 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> DMF에 대응의 Fmoc- 아미노산을 용해시켜 산성 용액 0.2 M 아미노 -9- 플루 오레 (의 Fmoc)을 제조하고, 아미노산이 (표 1)에 용해 될 때까지 혼합물을 소용돌이. </li><li> (벤조 트리아 졸 -1- 일) - - N, N, N &#39;, N&#39;테트라 메틸 유로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU) 100 ㎖의 DMF 및 고체까지 혼합물을 텍싱 용해 (표 18.96 g O 용해시켜 0.45 M 활성제 용액 혼합물을 제조 1). </li><li> 65.2 ml의 1- 메틸 -2- 피 롤리 디논 (NMP) (표 1)과 34.8 ml의 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA)을 조합하여 2 M 활성제 염기 용액 혼합물을 준비한다. </li><li> 3.37 g 1- 히드 록시 벤조 트리아 졸 수화물을 용해시켜 0.1 M 탈 혼합 용액을 제조 벤조 트리아 졸 (HOBt)20 % v / v의 피 페리 딘의 DMF 용액과 고체까지 혼합물을 텍싱 250 ㎖의 (표 1)에 용해된다. </li></ol></li></ol> 2. 아미노산 커플 링의 Fmoc 보호 <ol><li> 아미노산 커플 <ol><li> 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지에 아미노산 (2.5 ㎖) / 활성화 제 (1 ㎖) / 활성제 염기 (0.5 ml)에 첨가하고, 반응이 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2)에 대해 수행하자. 솔루션을 배출합니다. </li><li> DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다. </li></ol></li><li> FMOC 탈 보호 <ol><li> 0.1 M의 HOBt에 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지로 DMF의 20 % 피 페리 딘의 7 ML을 추가하고 30 초 (45 W, 75 ° C, 표 2) 동안 품어. </li><li> 반응 혼합물을 배출. </li><li> 에 반응 용기 / 폴리 프로필렌 카트리지 0.1 M의 HOBt와 DMF의 20 % 피 페리 딘의 7 ML을 추가하고 180 초 동안 품어 (45 W75 ° C, 표 2). </li><li> 반응 혼합물을 배출. </li><li> DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 (7 ㎖의 0 W, RT) 용 수지에 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다. 참고 : 선택적으로, 여기에 절차를 일시 중지하고 나중에 다시 시작합니다. </li></ol></li><li> 아미노산의 커플 링 단계 후에, (- 20 ° C에서 장기간 저장 용 수지)를 4 ℃에서 적어도 수 일간 저장 DCM으로 수지를 세척 하였다. <ol><li> 프로필렌 카트리지 반응 용기에서 수지를 이동. </li><li> DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li><li> 상단 캡과 스톱 콕이 단단히 폴리 프로필렌 카트리지를 밀봉합니다. </li><li> 새로운 합성을 시작하기 전에 DMF에서 3-4 시간 (7 mL)을위한 수지를 팽윤. </li></ol></li><li> 합성 모니터링 <ol><li> 신속의 진행을 결정하기 위해 카이저 (닌히 드린) 시험 또는 클로 라닐 테스트를 사용합성. 선택적으로, 상기 합성 펩타이드의 순도 및 질량을 결정하기 위해 소규모의 절단 반응을 수행한다. 제 9 절을 참조하십시오. 주 : 추가 문제 해결은 표 3을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 표적 펩티드를 합성하기 위해 필요에 따라 반복하여 2.1과 2.2 단계 : Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf). </li></ol> 3. 무수 / 산 커플 링 <ol><li> 무수 커플 링 <ol><li> NMP와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)를 NMP를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li><li> , NMP (5 ㎖)에 상응하는 무수물을 용해 10 당량 1 당량의 4- 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP) 및 10 당량의 용액에 DIEA (표 1)을 추가한다. </li><li> (25 / DIEA 수지에 무수 / DMAP 10 혼합물 300 초 동안 품어 : 1 : 10 추가W, 75 ° C, 표 2). 솔루션을 배출합니다. </li><li> NMP와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)를 NMP를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 산 커플 링 <ol><li> DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ㎖의 0 승, RT)을 DMF를 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li><li> DMF에 대응하는 디카 르 복실 산의 10 당량 (5 ㎖)에 녹인다. 1 당량의 DMAP 및 10 당량의 N, 솔루션 N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC) (표 1)를 추가합니다. </li><li> 30 분간 혼합하여 혼합물을 중고 활성화. </li><li> 수지 혼합물을 추가하고 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2) 부화 및 솔루션을 드레인. </li><li> DMF로 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT) 및 드레인 솔루션을 DMF를 추가합니다. 단계를 반복하여 세 번. </li></ol></li></ol> 4. N-methyltrityl (MTT) 그룹 탈 보호를 보호이온 주 : 라이신 측쇄가 N-methyltrityl (MTT) (81), 산에 불안정한 조건 하에서 82,83 선택적으로 탈 보호 될 수있는 보호기로 보호 하였다. 탈 보호는 MTT 마이크로파 에너지없이 진탕 수동 보호기. <ol><li> 캡 플러그와 스톱 콕이 구비 된 폴리 프로필렌 수지 카트리지에 옮긴다. </li><li> DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li><li> 수지 1 그램 당 폴리 프로필렌 카트리지 1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA), 5 % 트리 이소 프로필 실란 (TIS) 및 94 % DCM의 혼합물의 15-25를 가하여. 주 : TFA는 강산이고 부식성 및 피부, 눈, 및 폐 조직에 매우 자극적이다. <ol><li> 항상 후드에서 TFA의 집중 솔루션을 유지합니다. </li><li> 환기가 잘되는 후드에서 적절한 개인 보호 장비 (보안경, 실험실 코트와 장갑) 작업을 사용합니다. 즉시 변경 장갑그들은 TFA 즉시 청소 어떤 유출과 접촉합니다. 피부 나 눈이 산에 접촉하는 경우, 즉시 물로 환부를 세척하고 추가로 15 분 동안 세척한다. </li></ol></li><li> 쉐이커에 폴리 프로필렌 카트리지를 넣고 실온에서 5 분간 흔들어. </li><li> 진공을 적용하여 프로필렌 카트리지로부터 용액을 배출. </li><li> 반복 4.3-4.5, 세 번 단계를 반복합니다. </li><li> DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다. </li></ol> 선형 펩타이드 5. 고리 화 <ol><li> DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 다섯 번 반복합니다. </li><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브, 5 당량 트리아 졸 -1- LY 옥시 트리스 pyrrolidinophosphonium의 hexafluorphosphate 다이브 로모의 (에 PyBOP) (DBM, 5 ㎖) 용액에 10 당량 DIEA 추가 (표 1)을 녹인다. </li><l난&gt; 수지 혼합물을 추가하고 300 초 (25 W, 75 ° C, 표 2) 동안 품어. 솔루션을 배출합니다. </li><li> DCM와 수지를 씻으십시오. 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 세 번 반복합니다. </li></ol> 측쇄 기의 제를 이용하여 절단 및 탈 보호 한 <ol><li> DCM 및 디 에틸 에테르로 수지를 씻으십시오. <ol><li> 120 초 동안 수지 (7 ml를, 0 원, RT)을 DCM을 추가하고 솔루션을 드레인. 두 번 반복합니다. </li><li> 120 초에 수지 (7 ㎖, 0 W, RT)를 디 에틸 에테르를 첨가하고 용액을 배수. 두 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 수산화 칼륨 (KOH 1-10 G)에서 적어도 3 시간 동안 실온에서 진공 데시 케이 터에서 건조 수지. </li><li> 건조 된 수지를 달아 프로필렌 카트리지로 전송. </li><li> 미리 냉각 된 트라이 플루오로 아세트산 (TFA) 절단 칵테일 10 ㎖를 추가 (예를 들면, 90 % TFA, 2.5 % 물, 2.5 % TIS, 5 % 페놀) 수지 각자 그램. </li><li> 3 시간 동안 흔들어실온에서. </li><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 수지를 여과에 의해 TFA 절단 용액을 수집한다. 여과를 들어, 12 ml의 폴리 프로필렌 카트리지에 프릿을 사용한다. </li><li> 튜브 냉 디 에틸 에테르 (35 ml)에 추가한다. </li><li> 4 ° C에서 1,207 XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 에테르 층을 가만히 따르다. </li><li> 단계를 반복 6.7-6.9 5 회. </li></ol> 7. 백본 순환 펩타이드 건조 <ol><li> 동일한 튜브 내에 석출 펩티드를 유지하고, 30 분간 후드에서 건조시킨다. </li><li> 물과 아세토 니트릴 (ACN)의 1 : 1 혼합물 1 펩​​티드를 녹인다. </li><li> 액체 질소에서 최종 생성물 용액을 동결. </li><li> 최종 생성물을 동결 건조. </li></ol> 8. 백본 순환 펩타이드 특성화 <ol><li> 물 (400 μL)의 생성물의 소량의 샘플 (1 mg)을 녹인다. </li><li> 역상 고속 액체 chromatograp에 용해 펩티드 (10-200 μL)을 주입HY (RP-HPLC) 시스템은 펩타이드 순도 (34)을 테스트합니다. </li><li> 질량 분석 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI-MS) (84)를 사용하여 펩티드의 질량을 확인한다. <ol><li> 아세토 니트릴 1 (v / v)의 혼합물 : 1에서 1 μL (100 μM) 펩티드 믹스 물 매트릭스의 1 μL (5 ㎎ / ㎖, α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산)으로 1 : 1 (V 아세토 니트릴 / v)의 혼합물 : TFA (0.1 %)와 물. </li><li> 스팟 MS-MALDI 접시에 1 μL. </li><li> 샘플을 건조하고 질량 분석기에 넣습니다. </li></ol></li><li> 펩타이드를 달아 %의 수율을 계산한다. </li><li> -20 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 9. 합성 모니터링 <ol><li> 카이저 (닌히 드린) 시험 85 <ol><li> 시약 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 증류수 25 ㎖에 시안화 칼륨 (KCN) 16.5 mg을 용해시켜 용액 A를 준비한다. 피리딘 49 ㎖의 상기 용액 1 ㎖를 희석. </li><li> 용액 B를 준비에탄올 20ml에 닌히 드린의 1g를 용해. </li><li> 20 ml의 에탄올 40g 페놀을 용해하여 용액 C를 준비합니다. </li></ol></li><li> 아미노산 결합의 완료 또는 보호기의 탈 보호를 확인할 카이저 테스트를 사용. <ol><li> 테스트 튜브에 수지에서 몇 구슬을 전송합니다. </li><li> 세 방울 각 솔루션의 (~ 100 μL) (A, B 및 C)를 추가하고 혼합한다. </li><li> 5 분 동안 110 ℃에서 가열 블럭에 테스트 튜브를 가열한다. 참고 : 블루 컬러 구슬 (긍정적 인 결과) 불완전한 커플 링 반응 또는의 Fmoc 보호기의 탈 보호를 나타냅니다. </li></ol></li></ol></li><li> 클로 라닐 테스트 (86) <ol><li> 각 시험에 대한 신선한 다음과 같은 시약을 준비합니다. <ol><li> DMF 중의 2 % 클로 라닐의 용액을 제조 하였다, 용액 A. </li><li> DMF 중의 2 % 아세트 알데하이드의 용액을 제조 하였다, 용액 B. </li></ol></li><li> 아미노산 결합 또는 t의 완료를 확인하는 클로 라닐 테스트를 수행그 보호기를 탈 보호. <ol><li> 1.5 ㎖의 튜브에 용액 B 100 ㎕를 가진 용액 100 ㎕를 혼합한다. </li><li> 에 구슬을 삭제하고 부드럽게 5 분 동안 흔들어. 주 : 다크 브라운 컬러 비드 (포지티브 결과)의 Fmoc 보호기 또는 불완전 커플 링 반응의 탈 보호를 나타낸다. </li></ol></li></ol></li><li> 작은 규모의 분열 반응 <ol><li> 캡 플러그와 스톱 콕이 구비 된 3 ㎖ 폴리 프로필렌 카트리지에 소량의 수지를 제거한다. </li><li> 95 % TFA 2 mL의 혼합물을, 2.5 %의 물과 2.5 % TIS로 처리. </li><li> RT에서 30 분 동안 혼합물을 흔들어. </li><li> 폴리 프로필렌 프릿 카트리지를 사용하여 여과하여 수지를 제거하고 질소 기류에 의해 용매를 증발시켰다. </li><li> 잔류 물을 용해시키고, HPLC 및 / 또는 MS를 사용하여 생성물을 분석한다. </li></ol></li></ol> 문화 분석 10. 슈만 편모충 donovani Promastigote 생존 <ol> &lt;리&gt; 슈만 편모충 donovani (L. donovani) 성장과 치료 조건 <ol><li> 문화 L. 26 ° C에서 4.5 G / L 포도당, L- 글루타민, 나트륨 피루 베이트와 이글의 중간 (DMEM)의 둘 베코의 수정에 donovani의 promastigotes. </li><li> L. 치료 donovani는 26 ° C에서 24 시간 동안 주기적 펩티드 (100 μM)로 promastigotes. </li></ol></li><li> 슈만 편모충의 donovani (L. donovani) 생존 분석 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 알라 마르 블루 20 μL와 기생충 생존 능력을 평가합니다. </li><li> (570 nm의 여기 및 590 nm의 방출에) 형광을 측정하여 알라 마르 블루 감소를 결정합니다. 높은 형광 값보다 큰 대사 활성 및 증가 된 기생 가능성을 나타낸다. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

완전 자동화 된 마이크로파 합성기를 사용하여 리 슈만 편모충 기생충의 부족 단백질로부터 유도 된 펩티드의 고리 골격 집중 라이브러리의 합성을 설명한다. 순환 펩티드의 초점을 맞춘 도서관은 보존 약물 조제와 다양한 링커로 개발되었다. 예컨대 글루 타르 산 무수물, 숙신산 무수물, 아 디프 산, 피 멜산, 리신, 오르니 틴, 및 다른 빌딩 블록과 같은 다양한 링커 첨가 환상 펩티드의 형?...

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 세포 내 신호 전달에서 세포사 1, 가장 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다. 따라서, 프로톤 펌프 억제제를 대상으로하는 기초 연구 및 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 중요하다. 프로톤 펌프 억제제는 구체적이고 안정적​​인 항체에 의해 규제하지만, 항체 제조 및 가난한 생체 이용률을 가지고 비싸고 어려운 할 수 있습니다. 또한, 프로톤 펌프 억제제는 작은 분자의 대상이 될 수있다. 소분자는 항체에 비해 합성 쉽고 저렴; 그러나, 이들은 상대적으로 유연성이 큰 단백질 - 단백질 인터페이스 2,3-보다 작은 공동에 잘 맞게. 다양한 연구는 간단하고 저렴 항체보다 작은 분자보다 더 유연 펩타이드, 단백질 인터페이스를 결합하고 프로톤 펌프 억제제 4,5 조절할 수 있음을 증명하고있다. 글로벌 치료 펩타이드 시장은 2013 년 백오십억 달러의 주위에 평가하고, 10.5 %의 annua 성장하고있다에서야 6. 또한, 50 개 이상의 판매 펩티드, 임상 시험의 다른 단계에서 약 270 펩티드, 고급 전임상 단계 7에서 약 400 펩티드가있다. 많은 펩타이드 약물로 사용되고 있지만, 펩티드가 여전히 불량한 생체 이용률 및 안정성 횡단 세포막에서 비효율과 구조적 유연성 8,9 포함한 광범위한 적용을 제한 여러 과제를 제기. 이러한 단점을 극복하기위한 하나의 대안은 로컬 (D- 아미노산 및 N- 알킬화) 및 글로벌 (고리) 제약 8,10-12로 다른 수정 사항을 적용하는 것입니다. 이러한 수정은 자연적으로 발생합니다. 예를 들어, 시클로 스포린 A는 면역 억제제 환상 천연 펩티드는 단일 D- 아미노산을 포함하고, N-알킬화 변형 13,14 겪는다. 천연 아미노산의 변형은 종종 영향을 펩티드, 예컨대 D- 및 N- 알킬화 같은 로컬 제약을 유도9;의 생물학적 활성. 그러나, 관심있는 서열이 동일하게 유지 될 수있는 고리 화 반응은 생물학적 활성을 유지하기 쉽다. 환화 다른 배좌 사이의 평형을 줄여 펩타이드 구조적 공간을 제한하는 매우 매력적인 방법이다. 그것은 일반적으로 하나의 기능을 매개 활성 형태에 펩타이드를 제한하여 생물학적 활성과 선택도를 증가시킨다. 환화는 덜 분해 효소에 의해 인식되는 펩티드의 형태를 유지함으로써 펩티드의 안정성을 향상시킨다. 실제로, 순환 펩티드들은 선형 대응 15 ~ 17에 비해 대사 안정성, 생체 이용률 및 선택성을 향상 것으로 나타났다. 그러나, 고리는 경우에 따라 제한을 달성 생체 활성 형태로 펩티드를 방지 할 수 있기 때문에 양날의 검이 될 수있다. 이 장애물을 극복하기 위해 초점을 맞춘 도서관은 모든 펩티드는 동일한 기본 sequenc이즉 결과적으로 일정한 약물 조제를 합성 할 수있다. 펩티드 라이브러리의 순서이어서 대부분 생리 활성 형태 9,18 스크리닝하는 이러한 링의 크기와 위치로서 그 구조에 영향을 미치는 매개 변수에서 다르다. 펩티드 용액 이제 더 널리 펩티드 합성 방법이며 더 논의 될 것이다 고상 펩티드 합성 (SPPS) 접근법에 의해 양으로 합성 할 수있다. SPPS 화학적 변형은 화합물의 합성 (19)의 넓은 범위를 준비하는 링커를 통해 고체 지지체에 의해 수행되는 프로세스이다. SPPS는 N 말단에, 고체 지지체에 부착 된 C 말단으로부터 단계적으로 아미노산의 연속 펩티드 결합에 의해 조립을 가능하게한다. N-α 아미노산 측쇄는 세인트 당 하나의 아미노산의 첨가를 위해 펩타이드 신장 동안 사용 된 반응 조건에 안정한 보호기로 마스킹되어야EP. 마지막 단계에서, 펩티드는 수지로부터 방출되고 보호기 측쇄는 병용 제거된다. 펩타이드를 합성하는 동안, 모든 수용성 시약을 여과에 의해 펩티드 - 고체 지지체 매트릭스로부터 제거하고 각각의 커플 링 단계의 끝에서 씻겨 수있다. 이러한 방식으로, 높은 농도에서 시약의 과량 완료 커플 링 반응을 구동 할 수 있으며 모든 합성 단계는 재료 (20)의 임의의 이동없이 동일한 용기 내에서 수행 될 수있다. SPPS은 반응 21 모니터링 불완전 반응, 부반응, 불순한 시약뿐만 아니라 문제의 생산과 같은 어떤 한계가 있지만, SPPS의 장점은 펩티드 합성 &quot;금 표준&quot;만들었다. 이러한 장점에 기인하는 비 천연 아미노산, 자동화, 간편한 정제를 통합하는 옵션, 물리적 손실을 최소화하고, 과량의 시약의 사용을 포함높은 수율. SPPS는 곤란 서열 21, 22, 23의 형광 변형, 펩타이드 라이브러리 (24, 25)의 합성에 매우 유용한 것으로 밝혀졌다. SPPS 또한 올리고 뉴클레오티드 (26, 27), 올리고당 28, 29, 펩티드 핵산 (30, 31)와 같은 다른 폴리 체인 어셈블리를위한 매우 유용합니다. 흥미롭게도, 어떤 경우에는, SPPS 전통적 용액 32,33에서 만들어진 작은 분자를 합성하기위한 유리한 것으로 나타났다. SPPS 업계 36-38에서 연구 및 교육 (34, 35)에 대한 소규모뿐만 아니라 대규모에 모두 사용된다. 주로 펩티드 합성 SPPS 방법에 사용되는 두 개의 합성 전략 옥시 카르 보닐 (BOC) 9- 플루 오레 닐메 톡시 카보 닐 (Fmoc)이다. SPPS 도입 원래 전략은 R로부터 펩티드 보호기 측쇄를 제거하고 절단하는 강산성 조건이 필요 BOC이었다esin. FMOC 계 펩티드 합성은, 그러나, 적당한 염기 조건을 이용하고, 산 - 불안정성 BOC 프로토콜 39에 경한 대안이다. 및 Fmoc 전략은 산성 조건 하에서 수지로부터 펩티드를 절단하면서 합성의 마지막 단계에서 제거된다 직교 t- 부틸 (tBu 중에서) 측쇄 보호를 이용한다. 고체 지지체상의 펩티드 합성을위한 일반적인 원리는도 1에 제시된다. N-α 말단의 임시 보호기에 의해 마스크 초기 아미노산은 C- 말단에서 수지 상에 로딩된다. (도 1, 단계 1) 필요에 따라 측쇄를 마스크하기 반영구 보호기 또한 사용된다. 대상 펩티드의 합성 N-α-임시 보호기의 탈 보호의 반복적 인 사이클의 다음 보호 된 아미노산 (도 1, 단계 2) 및 커플 링 (도 1의 N 말단에 C 말단으로부터 조립 </str<html> 옹&gt; 단계 3). 마지막 아미노산 (도 1, 단계 4)을로드 한 후, 펩티드를 수지 지지체로부터 절단하고 반영구 보호기는 (도 1, 단계 5)을 제거한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" /> 고상 펩티드 합성의도 1은 일반적인 방식. N-α 보호 된 아미노산은 수지 (단계 1)에 링커를 통해 카르복실기를 사용하여 고정된다. 바람직한 펩티드는 N-α (단계 2) 및 아미노산 커플 링 (단계 3)로부터의 임시 보호기 (TPG)의 탈 보호의 반복 사이클에 의해 N 말단에 C 말단에서 선형 방식으로 조립된다. 합성 (공정 4)를 달성 한 후에, 반영구 보호기 (SPG)를 펩티드의 절단 (단계 5) 중 탈 보호된다.= &quot;_ 빈&quot;을 얻을&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 환화 (도 2A)에 대한 하나의 옵션, (B) 고리를 제공하기 때문에이 편리한 방법이지만 한정 - (A) 머리 - 꼬리 환화는 : 완전한 펩티드 사슬의 조립 후, 환화는 몇 가지 대안에 의해 달성 될 수있다 생활 성 관능기를 함유 관심 서열에서 아미노산을 사용하여 - 그러나, 이들 아미노산의 사용을 방해하지 않고 아미노산 (또는 다른 빌딩 블록)을 첨가하여 생물학적 활성 (도 2B), 및 (C) 고리 화에 영향을 미칠 수있다 생리 활성 순서. 그것이 관심 서열 (도 2C)를 수정하지 않고 집중 라이브러리의 제조를 허용하는 이들 분자를 도입하여 광범위하다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" /> 에프2. 대안 igure 펩티드 고리 화 전략 C- 말단 및 N- 말단 사이의 펩티드 결합을 통해 꼬리 환화에 (A) 헤드.; 관능기 사이의 (B) 고리 등 / 글루탐산 (2), 또는 측쇄을 N- 또는 C- 말단 (3 아스파르트하는 시스테인 잔기 (1), 또는 라이신 측쇄 사이의 아미드 결합 사이의 이황화 결합로서 -4); (R0) 전 (R7) 생리 활성 순서 후에 예를 들어, 여분의 아미노산 또는 아미노산 유도체 또는 작은 분자를 추가하여 (C) 고리 화. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 따라서 마이크로파를 이용한 유기 화학 촉진, 합성 반응을 가열하는 마이크로파 조사 사용은 40, 41을 변형. 마이크로파 화학은 흡수 용매 시약 능력 /에 기초전자 레인지 에너지 변환 (42)를 가열한다. 기술이 널리되기 전에, 주요 단점은, 제어 및 합성 프로토콜의 재현성과 충분한 온도 및 압력 제어 시스템 (43, 44)로 사용할 수의 부족을 포함 극복되어야했다. 마이크로파를 이용한 펩티드 합성의 첫 번째보고는 커플 링 효율 및 순도 (45)의 현저한 개선과 함께 여러 짧은 펩티드를 합성 주방 마이크로파 (7-10 아미노산)를 사용하여 수행 하였다. 또한, 마이크로파 에너지는, 연쇄 응집을 감소 부반응을 감소, 라세 미화를 제한하고, 모든 어렵고 긴 시퀀스 46에서 53 사이에 중요한 결합 율을 개선하기 위해 도시 하였다. 현재 고체 지지체상의 펩티드 또는 관련 화합물의 합성을위한 마이크로파 조사를 사용하는 유기 용매 (54)의 대신에 물 (A)의 합성을 포함하여 광범위하다; (B)의 합성 펩티드와이러한 합성에 의한 입체 장애 아미노산 유도체의 낮은 커플 링 효율로 일반적으로 곤란 또는 포스 포 글리코 펩티드 55-58 59-61, 일반적인 번역 후 변형; (C) 그 측쇄에 연결되어 질소 원자 (62), 또는 펩 토이 드와 아미노산 잔기의 C (α)의 대체에 의해 형성 될 수 azapeptides 같은 백본 변형 펩타이드의 합성 오히려 Cα 원자 63, 64보다 아미드 질소; (D) 순환 펩티드 65-71을 합성; 조합 라이브러리 51,72의 및 (E) 합성. 수많은 경우에서, 저자는 높은 효율을 종래보고 된 프로토콜에 비하여 마이크로파를 이용하는 제조 시간을 감소시켰다. 합리적인 디자인 73-75을 사용하여, 우리는 fo를 발판 패 eishmania의 수용체에서 파생 된 구충제 펩티드 개발R은 C-키나제 (부족) 활성화. 부족 슈만 편모충 감염 (76)의 초기 단계에서 중요한 역할을한다. 부족 낮은 수준을 표현하는 기생충이 부족하니이 필수 기생충 신호 프로세스와 단백질 합성 (78)에 관여으로도 면역 손상 쥐에게 77 기생하지 못한다. 따라서 부족은 키 비계 단백질 79 귀중한 약물 표적입니다. 하지만 호스트 포유류의 동체 랙에, 기생충에 보존되어 부족 시퀀스를 중심으로, 우리는 8 아미노산 펩타이드 문화 슈만 편모충 SP. 가능성을 감소 (RNGQCQRK)를 확인했다. 여기서는 상술 LACK 단백질 서열로부터 유래 된 골격 환상 펩티드 합성을위한 프로토콜을 기술한다. 펩티드의 Fmoc / tBu 중에서 프로토콜 SPPS 방법론에 의해 마이크로 웨이브 가열을 사용하여 고체 지지체 상에 합성했다. 펩티드는 아미드 결합 등을 통해 TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) 담체 펩티드에 접합 된SPPS의 일부입니다. 세포 내로화물의 다양한 TAT 기반 전송은 15 년 이상 사용되어왔다 및 세포 내 소기관으로 전달화물 80을 확인 하였다. 네 개의 다른 링커, 숙신산 및 글루 타르 산 무수물뿐만 아니라 디프 및 피 멜산는 4시 58분 탄소수 카르복시산 링커를 생성하는 고리 화 반응을 수행하는 데 사용 하였다. 고리 화 반응은 마이크로파 에너지를 사용하여 수행하고, 최종 절단 및 측쇄 탈 보호 단계는 마이크로파 에너지없이 수동으로 수행되었다. 자동화 된 마이크로파 합성기를 사용하면, 제품 순도를 향상 생성물 수율을 증가하고, 합성의 지속 기간을 감소시켰다. 이러한 일반적인 프로토콜은 시험 관내 및 생체 내에서 중요한 분자 메커니즘을 이해하고 상기 인간의 질병에 대한 잠재적 인 약물을 개발하는 펩티드를 이용하는 다른 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid support, Rink Amide AM resin ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>loading: 0.49 mmol/g</td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asn(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Asp(OBut)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(But)-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Advanced Chemtech</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP)</td><td>Sigma</td><td>328634</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Highly flammable/Irritant.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide (DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43465</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic.&lt;br /&gt;
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.</td></tr><tr><td>Dichloromethane (DCM)</td><td>Sigma</td><td>D65100</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Harmful</td></tr><tr><td>Dibromomethane (DBM)</td><td>Sigma</td><td>D41868</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Harmful</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigma</td><td>T62200</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Corrosive/Toxic</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA)</td><td>Sigma</td><td>91707</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Corrosive/Toxic</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>31690</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Highly flammable/Harmful</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane (TIS)</td><td>Sigma</td><td>233781</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Irritant/Flammable</td></tr><tr><td>Water, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitroile, HPLC grade (ACN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Flammable/Irritant/Harmful</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Diisopropylethylamine (DIEA)</td><td>Sigma</td><td>3440</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Corrosive/Highly flammable</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma</td><td>W290807</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Highly flammable</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma</td><td>270970</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Highly flammable/Harmful</td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Highly flammable/Irritant</td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)</td><td>Sigma</td><td>157260</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Highly flammable/Irritant/Harmful</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(Benzotriazol-1-yl)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Irritant/Harmful</td></tr><tr><td>Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)</td><td>Advanced Chemtech</td><td>RC8602</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Irritant</td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Sigma</td><td>454044</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Harmful</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P3653</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Corrosive/Toxic</td></tr><tr><td>Potassium cyanide (KCN)</td><td>Sigma</td><td>11813</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Very Toxic</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide (DIC)</td><td>Sigma</td><td>38370</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Flammable/ Toxic</td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine (DMAP)</td><td>Sigma</td><td>522805</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Glutaric anhydride</td><td>Sigma</td><td>G3806</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Flammable/Irritant/Harmful</td></tr><tr><td>Succinic anhydride</td><td>Sigma</td><td>239690</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Irritant/Harmful</td></tr><tr><td>Adipic acid</td><td>Sigma</td><td>A26357</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Pimelic acid</td><td>Sigma</td><td>P45001</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Chloranil</td><td>Sigma</td><td>23290</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Toxic/Irritant</td></tr><tr><td>Acetaldehyde</td><td>Sigma</td><td>402788</td><td>&lt;strong&gt;Caution&lt;/strong&gt; Flammable/ Toxic</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>freezone 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Franklin Electric</td><td>model 1101101416 with 3/4 HP</td><td>Alcatel pump with Franklin Motor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polypropylene cartridge 12 ml</td><td>Applied Separation</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge</td><td>Applied Separation</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene cartridge 3 ml</td><td>Applied Separation</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge</td><td>Applied Separation</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>Stop cocks PTFE</td><td>Applied Separation</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>Tubes flat, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Shaker, BD adams nutator mixer</td><td>Fisher scientific</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125&amp;nbsp;ml</td><td>Fisher scientific</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-501, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Thermolyne</td><td>1760 dri bath</td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes with plain end</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes and tips Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&amp;ndash;200 and 100&amp;ndash;1,000 &amp;mu;l</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials - micro vl pp 400 &amp;micro;l PK100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vial- Blue Snap-It Cap</td><td>VWR</td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>Analytical HPLC column</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 &amp;micro;m C18Q, 4.6 mm ID 150 mm</td></tr><tr><td>Prep HPLC column, XBridge&amp;nbsp;</td><td>Waters</td><td>OBD C18 5 &amp;micro;m column</td><td>19 mm &amp;times; 150 mm</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager DE-RP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen cylinder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).</td></tr><tr><td>Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).</td></tr></tbody></table>

development of a backbone cyclic peptide library as potential antiparasitic therapeutics using microwave irradiation

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 ​​거의 모든 생물학적 과정에 밀접하게 관여하고 많은 인간의 질병에 연결됩니다. 따라서, 기초 연구 및 제약 산업에서 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 주요 노력이있다. 단백질 - 단백질 인터페이스 플랫 보통 대형이고, 종종 표적 부위 작은 분자의 발견을 복잡 포켓이 부족하다. 항체를 사용하여 대체 타겟팅 방식은 가난한 경구 생체 이용률, 낮은 세포 투과성 및 생산의 비 효율성으로 인해 제한이 있습니다. PPI 인터페이스를 타겟팅 펩타이드를 사용하는 것은 몇 가지 장점을 갖는다. 펩티드는 높은 구조적 유연성 증가 선택성을 가지며, 일반적으로 저렴하다. 그러나, 펩티드는 가난한 안정성과 효율성 건너 세포막을 포함하여 자신의 한계를 가지고있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 펩티드 고리 화 반응이 수행 될 수있다. 환화 펩티드 선택성을 향상시키기 위해 설명되었다, 대사 안정성 및 생체 이용율. 그러나, 고리 형 펩티드의 생체 활성 입체 형태를 예측하는 것은 단순하지 않다. 이 문제를 극복하기 위해, 하나의 매력적인 접근 모든 백본 순환 펩티드가 동일한 기본 순서를 가지고 있지만, 이러한 링 크기와 위치 등 자신의 형태에 영향을 미치는 매개 변수에 차이가있는 화면에 초점을 맞춘 라이브러리를 화면으로 이동합니다. 우리는 특정 기생충 프로톤 펌프 억제제를 표적 백본 환상 펩티드 라이브러리를 합성하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 합리적인 설계 방식을 사용하여, 우리는 활성화 된 C-키나제 (LACK)의 골격 단백질 패 eishmania 수용체에서 유래 펩티드를 개발했다. 우리는하지만 포유류의 호스트 상 동체에, 기생충에 보존되어 부족 시퀀스, 기생충 &#39;생존에 중요한 단백질 상호 작용 사이트를 나타낼 수 있다는 가설을 세웠다. 환형 펩티드는 반응 시간을 감소시키고 증가시키는 마이크로파 조사를 이용하여 합성했다능률. 다른 크기의 환 골격 환상 펩티드 라이브러리를 개발하는 것은 대부분의 생물학적 활성에 대한 체계적인 형태 화면을 용이하게한다. 이 방법은 고리 형 펩티드를 합성, 일반 신속하고 용이 한 방법을 제공한다.

여기에서 우리는 특히 슈만 편모충 기생충의 생명 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 (기생충 제 87 프로톤 펌프 억제제를 대상으로 펩타이드에 대한 검토를 위해) 항 기생충 제 역할을 백본 순환 펩티드의 초점을 맞춘 작은 도서관의 발전을 설명합니다. 새로운 백본 순환 펩타이드의 합성을 통해 약물 조제는 확장 크기의 골격에 보존되어있다. 여기에 제안 된 초점을 맞춘 도서관의 ?...

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Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

마이크로 웨이브 조사를 사용하여 잠재적 인 기생충 치료제로 백본 순환 펩타이드 라이브러리 개발

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

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An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

연구

생화학

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

화학

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

면역학 및 감염병학

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

생체공학

Microwave-Assisted Preparation of 1-Aryl-1H-pyrazole-5-amines

A synthetic process for the preparation of a variety of 1-aryl-1H-pyrazole-5-amines was developed. The microwave-mediated nature of this method makes it efficient in both time and resources and utilizes water as the solvent. 3-Aminocrotononitrile or an appropriate &#945;-cyanoketone is combined with an aryl hydrazine and dissolved in 1 M HCl. The mixture is then heated in a microwave reactor at 150 &#176;C, typically for 10-15 min. The product can be readily obtained by basifying the solution with 10% NaOH and isolating the desired compound with a simple vacuum filtration. The use of water as a solvent in this reaction lends to its ease and utility in production, and this method is easily reproducible with a variety of functional groups. Typical isolated yields range from 70-90%, and reactions can be performed on the milligram to gram scale with little to no change in observed yields. Some of the applications of these molecules and their derivatives include pesticides, anti-malarials, and chemotherapeutics, among many others.

Microwave-Assisted Preparation of 1-Aryl-1H-pyrazole-5-amines

1-Aryl-1H-pyrazole-5-amines are prepared from aryl hydrazines combined with either 3-aminocrotononitrile or an &#945;-cyanoketone in a 1 M HCl solution using a microwave reactor. Most reactions are done in 10-15 minutes and pure product can be obtained via vacuum filtration with typical isolated yields of 70-90%.

1-아릴-1 H-피라졸-5-아민의 전자레인지 보조 제제

A synthetic process for the preparation of a variety of 1-aryl-1H-pyrazole-5-amines was developed. The microwave-mediated nature of this method makes it ...

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

온테더 설포늄 중심을 사용한 순환 펩타이드 구성

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Versatile Home-Built Microwave-Assisted System for Peptide Synthesis

An Inexpensive Adaptation of a Commercial Microwave Reactor for Solid Phase Peptide Synthesis

A home-built apparatus to perform solid phase peptide synthesis (SPPS), assisted by microwave irradiation and heating, is presented. In contrast to conventional SPPS reaction vessels, which drain solvent and byproducts via a frit located at the bottom of the vessel, the presented apparatus employs a gas dispersion tube under vacuum to remove solvent, byproducts, and excess reagents. The same gas dispersion tube supplies nitrogen gas agitation of the SPPS beads during the reaction steps of coupling and deprotection. Microwave heating is beneficial for SPPS couplings of sterically hindered residues, such as alpha-aminoisobutyric acid (Aib), an alpha,alpha-dialkylated amino acid residue. This home-built apparatus has been used to prepare, via manual Fmoc SPPS methods, heptameric and octameric peptides dominated by the Aib residue, which is notoriously difficult to couple under standard room temperature conditions and reagents. Further, typical commercial microwave SPPS reactors are dedicated exclusively to SPPS synthesis rendering them inaccessible to non-SPPS users. In contrast, the presented apparatus preserves the versatility of the microwave reactor for conventional microwave acceleration of chemical reactions, as the apparatus is trivially removed from the commercial microwave reactor.

A simple, inexpensive, and novel apparatus for performing solid phase peptide syntheses in a commercial microwave reactor is presented.

A home-built apparatus to perform solid phase peptide synthesis (SPPS), assisted by microwave irradiation and heating, is presented. In contrast to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Dual Reporters를 사용한 Mycobacterium abscessus 에 대한 High-Throughput Screening Assay

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: M. abscessus 치료법의 효율적인 발견을 위한 확장 가능한 약물 스크리닝 프로토콜

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...