저자는 트레이시 J. 어린 양에게 수여 면역학 및 면역 주사와 NIH 새로운 혁신 상 (1DP2AI112242-01)에 대한 아동 센터를 통해 자금을 인정합니다. 저자는 또한 rad1 S.의 관대 한 기여 나탈리아 P. Degtyareva 감사합니다 cerevisiae의.

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저자는 공개 아무것도 없어.

함께, 프로토콜은 여기에 장에 이종 치료 단백질의 전달을위한 개발과 영양 요 바이오 틱 효모 균주의 시험에 필요한 필수 단계를 설명합니다. 이 조작 및 재조합 바이오 틱 효모의 테스트는 개별 실험실은 익숙하지 않을 수있는 기술과 자원을 필요로한다. 많은 선행 연구가 여러 효모와 마우스 균주에 대해 위의 프로토콜을 설명하고 있지만 따라서, 이러한 방법은 저자의 지식이 상세한, 통합 형태로 제공되지해야합니다. 또한, 본 원고는 덜 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주보다 특징 바이오 틱 효모의 유전자 조작에 대한 현재의 표준화 된 프로토콜을 적응에 특히 중점을두고 있습니다. 및 변환 (2 부) (1 부에서 설명) 모두 돌연변이 유발을위한 많은 단계는 이배체의 조작, 프로 바이오 틱 효모 ISOLAT에 최적화해야에스. 이 원고는 (은) 동물 처리 (파트 3) 소장의 파이어 판 면역 조직 (파트 4)의 해부와 관련된 잠재적 인 함정에 대해 설명합니다. 많은 산업 및 임상 적 효모 대규모 유전자 조작에 바로 적용 할 수없는 것처럼, 이러한 값 비싼 항생제없이 성장 선택할 수 영양 요 구성 돌연변이 균주로 생성하는 제 필요하다. UV 돌연변이 유발은 영양 요 유전자 7,41의 빠른 특이 변이를 허용 하나의 방법입니다. 생존 곡선을 용이하게 돌연변이를 스크리닝 적절한 투여 량을 결정하기 위해 (도 1, 2)를 생성 할 수있다. 그러나,이 방법은 성장 속도 또는 효모 균주의 다른 특성에 영향을 미칠 수있는 대상 돌연변이를 유발의 위험을 운반한다. 표적 녹아웃 대신 PCR을 구축하거나 CRISPR / Cas9 시스템을 이용하여 생성 될 수있다. 이후 심사 또는 선택돌연변이의 (그림 3) 영양 요 효모의 식별이 가능합니다. 5-FOA 매체 상으로 도금하여 선택을 사용하면, 예를 들어, 여전히 기능성 영양 요 URA3 유전자를 포함하는 효모의 신속한 제거를 허용한다. 가능하면,이 선택 방법은 생성 된 모든 콜로니의 분석을 요구 화면으로 바람직 할 수있다. 선택 또는 심사 중 하나와 함께, 그러나, 영양 요 구성 상태를 확인하기 위해 선택 배지에 각각의 효모 식민지의 반복되는 줄무늬를 수행하는 것이 중요합니다. 생성 된 돌연변이의 변형 상이한 프로토콜을 통해 달성 될 수있다. 비록 LiOAc 변환 특히 가장 일반적으로 사용되는 실험실 S., 많은 효모의 형질 전환에 효과적이다 cerevisiae의 균주는 같은 전기와 같은 다른 프로토콜은 다른 효모 효율성 (그림 4)로 분리 변환 할 수 있습니다. 각각의 새로운 균주는 USI를 테스트해야여러 프로토콜을 ng를하면 변환을위한 최적의 조건을 결정합니다. 배양 시간 및 DNA의 농도를 변화, 예를 들면, 전체의 변환 효율에 영향을 미칠 수 있고, 각 변형 (33)에 대해 시험하고 최적화한다. 구강 투여는 직접 면역 조직 한 후 효모 및 이종 단백질을 분석 할 수있는 쥐의 위장, 이러한 재조합 효모의 제어 된 복용량의 전달이 가능합니다. 적절한 구강 투여 기술 (그림 6) 동물의 불편을 최소화하고 실험 정밀도를 증가하는 것이 중요합니다. 또한, 파이어 패치는 소장에서 재조합 효모의 흡수를 평가하는 주요 사이트입니다. 면역 조직이 클러스터는 항원 샘플링과 점막 면역 반응의 유도 중요한 사이트입니다. 직경 3-6 μm의 효모를 포함한 대형 항원, GA를 통과하기 위해 파이어 패치 M 세포에 의해 흡수 될 가능성이 가장strointestinal 상피 세포와 면역 세포와 상호 작용합니다. 패치 오히려 장 루멘 또는 점막 고유 층이 수집보다 (그림 7) 내에서 만 셀을 보장하기 위해 파이어 패치를 해부 때는주의해야합니다. 또한 단계는 복구 된 효모 (그림 8)에 적절한 표현과 이종 단백질의 기능을 평가하기 위해 해부 다음과 같은주의해야합니다. 효모 해물과 면역에서 총 단백질의 제조 단백질 발현을 평가하는 하나의 표준 방법이다; 그러나,이 방법은 단백질 폴딩과 기능에 관한 정보를 제공하지 않는다. 단백질의 기능을 평가하기 위해, 효모 플라스미드 인코딩 GFP로 형질 기능적 GFP 발현 (도 5)를 평가하기 위해 파이어 패치 회복 후 형광 현미경으로 분석 될 수있다. 요컨대,이 원고는 이리저리 단계에 걸친 상세한 실험 프로토콜의 통합 세트를 제공합니다쥐 소장에서 프로 바이오 틱 효모 회복 영양 요 구성 돌연변이 생성 미터. 전통적으로 전문 지식을 하나의 영역에 속하지 않는 프로토콜을 컴파일하여, 이러한 설명은 경구 약물 전달 벡터로 설계 프로 바이오 틱 효모에 대한 면역 반응을 테스트하는 추가 연구를 촉진 할 것이다. 저자는이 연구는 소설, 프로 바이오 틱 기반 재조합 치료의 발전에 가장 효율적인 방법에 대한 방법을 포장, 토론을 장려하고 각 시험 효모 균주에 대한 실험 방법의 최적화를 촉진 바랍니다.

프로 바이오 틱 미생물을 효​​율적이고 경제적으로 위장관에 이종 단백질을 전달하는 흥미로운 잠재적 인 수단이다. 이 생물은 아직 1 식민지화하지 않는 위장관 통과 생존 제어 투약이 가능하고 약물 표현에 노출을 제한 할 수있다. 또한, 쉽게 대규모 이종 단백질을 생산하는 이들 미생물을 설계하는 능력은 그들을 합성 전달 입자 경제적 인 대안을 렌더링한다. 최근 2 boulardii에 생균제 효모 사카의 영양 요 구성 균주를 사용하여 입증하지만, 이러한 접근법의 개발은, 효모 및 분자 생물학에서 동물 처리 기술 및 면역 학적 방법에 이르기까지 전통적으로 특정 연구에서 결합되지 실험 기법에 대한 지식을 필요로한다. 본원에 기재된 각각의 방법은 그 자체로 신규 아니다 따라서 비록실험 프로토콜이 원고의 목적은 쥐 위장관에 약물 전달 비히클로서 생균제 효모 실험 테스트에 필요한 기술을 통합 도입을 제공하는 것이다. 제공에 필수적인 프로토콜의 편집이다 : 쉽게 유 전적으로 조작 할 수있는 효모의 영양 요 구성 돌연변이 균주의 1) 생성; 효모 배양 2) 변환은 이종 단백질을 발현하는 단계; 구강 투여를 통해 장에 재조합 효모의 3) 관리; 자신의 이종 단백질 발현의 쥐 소장 및 평가에서 가능한 재조합 바이오 틱 효모의 4) 복구. 다수의 양성 및 음성 선택 방법 효모 종의 조작에 존재하지만 첫째, 이러한 영양 요 구성 마커를 사용함으로써 부정적 선택 효율 효모 형질 전환 및 선택 될 수있는 용이성을 모두 증가시킨다. 공동 항생제를 사용하여 형질 전환 체의 긍정적 인 선택,ntrast 크게 효모 조작의 비용을 증가시킨다. 또한, 항생제 함유 고체 배지에 효모의 선택은 밖으로 합성 드롭 고체 배지 (게시되지 않은 관찰)에 영양 요 효모의 선택에 대해 변형되지 않은 배경 식민지의 증가 성장을 할 수 있습니다. 영양 요 구성 효모가 필수 아미노산 또는 우라실의 합성에 중요한 효소가 결여 균주이다. 효모가 필수 대사 물질이 부족 미디어 밖으로 합성 드롭에 도금 할 때 따라서 음의 선택이 가능 누락 된 대사 또는 대사 유전자로 보충하면 효모는 증가 할 수 있습니다. 많은 일반적으로 사용되는 사카로 마이 세스 세레 비지에 실험실 균주는 이미 사실 영양 요 구성 돌연변이 3입니다. 공업, 임상, 바이오 틱 및 효모 그러나, 일반적으로 필요한 모든 영양소를 합성하는 능력 prototrophic이다. 효모를보다 효율적으로 유전자 조작을 사용하려면, 영양 요 구성 유전자를 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다항생제없이 선택 될 수있는 균주를 생성한다. 6 - 영양 요 구성 마커 유전자의 구체적인 타겟팅 CRISPR / Cas9 4 타겟으로 최근에 상동 재조합에 의존 PCR 매개 유전자 파괴를 통해 달성 될 수있다. 또한, UV 돌연변이 유발 빠르게도 7 기술적으로 어려운 여러 플라스미드와 함께하는 형질 전환 효모 균주의 영양 요 구성 돌연변이 체를 생성 할 수 있습니다. PCR 타겟팅 및 CRISPR / Cas9 광범위 다른 설명되었지만,이 원고 한 음성 선별보다는 효모 형질 전환 체의 양성 항생제 선택할 수 영양 요 구성 균주를 제작하는 UV 돌연변이 유발 접근법을 설명하는 상세한 프로토콜 부분에 제시 하였다. 이종 단백질의 경구 전달을 위해 같은 영양 요 구성 균주의 사용에 필요한 다음 단계는 플라스미드 DNA로 형질 전환 효모이다. 찬성의 첫 번째 성공적인 변환 이후1978 사카로 마이 세스 세레 비지에 (8)에 대해보고 된 spheroplasts t는 수많은 변형 효율을 증가 효모 종은 유 전적으로 변형 될 수있는 것을 특징으로 완화되었다. S.로 DNA의 성공적인 전환을위한 전기 사용 cerevisiae를 먼저 1985 9에서 설명하고, 이후지지 삼투 셀 (10)에 1 M 소르비톨 배양 첨가를 통해 개선되었다. 전기 효율은 또한 효모 종 및 균주, 세포 수와 성장 단계, 전기 체적, 전계 강도, 및 특정 버퍼 (11)에 의존하는 것으로 나타났다. 이 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에 원래 이토 외. (12)에 의해 기재된 리튬 아세테이트 (LiOAc) 변환은, 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜 사이에서 변환된다. 추가의 분석은 세포를 중간 로그 상에 수집되는 경우 LiOAc 효모 변환 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다열 성장은 42 ° C에서 12 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 DNA의 존재 하에서 충격된다. PEG와 전체 그대로 효모의 배양이 가능 세포막에 DNA의 첨부 파일을 개선을 통해뿐만 아니라 막 (13)에 다른 효과를 통해, 효율적인 변환을 위해 필수적이다. 리튬 자체도 손상 전지 (14)의 투과성을 증가시킨다. 대부분의 실험실 S. 있지만 세레 비지에 균주 쉽게 LiOAc 변형 3을 이용하여 변환 될 수 있고, 다른 효모 종은 더욱 효율적으로 다른 프로토콜을 사용하여 변환 될 수있다. 피 키아 파스 토리스, 예를 들면, 가장 효율적으로 변환 오히려 LiOAc 변환 (13)보다 전기를 통한 것이다. 이것은 중요하다, 따라서, 복수의 테스트 유 전적으로지지 않은 효모 균주를 수정을 시도 할 때와 변화의 방법은 배양 기간과 시약의 농도를 최적화 할 수 있습니다. 이 원고 따라서 LiOAc 그럴 모두 설명영양 요구 돌연변이와 야생 유형 S.의 변환을위한 기술로 ansformation 및 전기 boulardii에. 관심있는 독자는 효모 변형, 다른 프로토콜 및 행동 13, 15의 가능한 메커니즘의 추가 논의의 진화의 철저한 설명은 최근 리뷰에 관한 것이다. 플라스미드가 쉽게 검출 가능한 단백질을 코딩하는 효모로 형질 전환은 적절한 발현 이종 단백질의 기능을 보장하기 위해 다운 스트림 테스트 또한 필수적이다. 무수한 다른 단백질 치료 연구의 궁극적 인 목적 및 면역, ELISA, 및 다른 기술에 의해 단백질이 검출 가능한 항체에 따라 선택 될 수있다. 이러한 기술에 대한 프로토콜은 완전히 다른 16,17 설명되었지만, 표준 곡선과 비교하여 형질 전환 효모에서 이종 단백질 생산의 수준을 결정하기 위해 사용될 수있다. 목적 데모 및 표시 할효모 생물학 매우 일반적으로 사용되는 단백질의 성공적인 제조 방법이 원고는 형광 현미경을 사용하여 연속적인 검출이 가능 플라스미드 인코딩 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질 전환을 제공한다. 부품 셋, 넷에 설명 된대로 이종 단백질, 적절한 관리 및 위장관 조직 내에서 이러한 미생물의 검출 인 표현 바이오 틱 미생물의 생산에 똑같이 중요. 구강 투여를 통해 재조합 효모의 관리를 직접 C57BL / 6 마우스 자연스럽게 18 구토 능력이있는에서 위,에 효모의 제어 수량의 전달을 위해 수 있습니다. 그러나, 부적절한 동물 처리 및 위관은 식도 손상 및 천공, 위 천공, 기관 관리, 흡인 성 폐렴 (19, 20)로 이어질 수 있습니다. 빈약 한 기술과 경험 부족은 또한 쥐의 면역 반응 및 실험 resu의 변동성을 증가시킬 수있다구강 투여에 21,22 동물 응력에 기인 한 LTS. 적절한 기술의 연습 따라서뿐만 아니라 동물의 불편을 감쇠 할 수 있습니다뿐만 아니라, 실험 결과의 정밀도를 높일 수 있습니다. 이 원고는 설명하고 재조합 효모의 제어 용량의 관리를 위해 동물 처리 및 구강 투여를 보여줍니다. 마지막으로, 효모 및 이종 단백질의 존재를 림프 조직을 분석하여 재조합 효모의 성공적인 전달을 확인하는 것이 중요하다. 가장 용이하고 예측 효모의 존재를 검사 할 수 위장관 면역 조직 파이어 패치이다. 파이어 패치는 점막 면역 반응의 유도 (23)의 키 사이트입니다 소장을 따라 차 림프 기관입니다. 내강에서 항원 microfold 통해 transcellularly 상피 (M) 세포를 전달하고 묶 노출 시킴 따라서 파이어 패치로 출시제시 세포 D 항원 내강 내용 장내한다. 장 상피를 가로 지르는 입자 흡수도 술잔 세포에 의해 달성 될 수 있지만, 이러한 셀은 차지 입자 직경이 24 미만 0.02 ㎛ 인 것으로 나타났다. Transepithelial 수상 돌기는 CD103 + 수지상 세포 (DC)도 25 루멘 장에서 작은 입자를 차지 연장; 그러나, CD103 + DC가 세균보다 큰 입자를 가지고 있음을 보여주는보고는 현재 존재하지 않는다. 따라서, 그대로 생균제 효모 직경 3-6 μm의 평균 크기 사이의, M 세포에 의해 용해 및 파이어 패치로 전송 될 가능성이 가장 높은. 여기에 설명 된 절차가 쉽게 바이오 틱 균의 흡수를 평가하기 위해 적응 될 수 있지만, 수집 및 생존 재조합 효모 파이어 패치 선별 프로토콜이다. 요약하면, 배달 재조합 효모 생균제 평가소장에 rapeutic 단백질은 동물의 취급 및 면역학에 분자 생물학에 걸친 실험 기술의 능력을 필요로한다. 1 여기를 제시 프로토콜) 쉽게 부정적인 항생제없이 선택할 수있는 세대 및 영양 요 효모 균주의 선별, 2) 다른 프로토콜은 효모를 변환 및 이종 단백질의 발현을 활성화, 3) 적절한 동물 처리 기술과 경구 위관의 시위 재조합 효모의 위장 납품 및 파이어 판 절제술 4) 프로토콜과 가능한 재조합 효모 및 기능 이종 단백질을 스크리닝. 결합하여, 이러한 프로토콜은 생성 및 위장관에 이종 단백질 치료제를 제공 할 수있는 생균제 효모의 테스트를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast cultures</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Example of roller drum for yeast culture incubation</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Example stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&amp;nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Hand held colony counter pen</td></tr><tr><td>Replica plating device</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Example of replica plating stand and pads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Velveteen squares</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L shaped sterile cell spreaders&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td></tr><tr><td>Gavage needles</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&amp;nbsp;002</td><td>For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20&amp;nbsp;g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td></tr><tr><td>1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&quot; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>Example of blunt forceps needed for dissection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Straight and curved dissection scissors</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72966-02 and 72966-03</td><td>Examples of scissors needed for dissection</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

UV 조사 다음 생존 곡선의 생성은 별개 집락 형성 단위 (CFU)를 형성 할 수 있도록 희석하여 효모 세포의 도금을 필요로한다. 상기와 같이 수집 된 각 500 μL 샘플을 약 5 × 106 세포를 포함 그러나, 접시 당 100보다 큰 식민지를 정확하게 구별하기가 어렵다. 희석되지 않은 샘플과 조사 셀 직렬 1시 10분 희석 따라서도 1에서 설명한 바와 같이 CFU는 각각 UV 조사량에 열거 될 수 있도록 보장 도금. CFU 카운트, 희석 배수를 곱한 다음의 총 개수로 나눈 각 투여 량 %의 생존을 결정하기 위해 각각 500 ㎕의 시료에 조사하여 원래 셀.도 2는 이배체 야생형 S.의 계산 된 백분율을 나타낸다 boulardii에 세포 0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ, 25,000 살아남을 수μJ, 35,000 μJ, 50,000 μJ. 이들 데이터는 50 %의 생존율에 대응하는 용량을 찾을 수있다 맑은 곡선을 설정. UV 조사량 및 효모 세포의 선택 조사 결과, 기능적 영양 요 구성 마커 유전자의 부재를 확인하기 위해 스크린 돌연변이 콜로니 중요하다. 선택 방법을 사용하면, 1.2.3.1에서 설명한도 3에 도시 된 바와 같이, 크게 표현형 확인의 효율을 증가시킨다. 그대로 URA3하여 독소 5-FU를 5-FOA의 변환을 활용 URA3 선택의 예가 도시되어있다. TRP1; 유사한 접근 방법이 LYS2 및 LYS5 사용할 수 있으며 MET2 및 MET15 이러한 돌연변이에 대한 선택의 효율성을 높일 수 있습니다. 케어는 검사 중에 개별 식민지를 선택주의해야합니다. YPD 5-FOA 있지만 우라실에 돌연변이 식민지의 일관된 성장 - 플레이트 indicat영양 요 표현형을 말이지. 그림 4는 야생형 S.에 대한 변환 효율을 보여줍니다 일반적으로 사용되는 실험실 S.에 boulardii에 (SB)를 상대 LiOAc (LiOAc) 및 전기 (전기) 기술을 모두 사용 cerevisiae의 변형 (SC). LiOAc 변환은 S. 매우 효율적이지만 cerevisiae의, S.에 대한 변환 효율 boulardii에 크게. 전기 천공을 사용하는 형질 전환 효모에서 개선 적절한 단백질 발현을 분석하는 방법의 일 예로서, 형광 현미경 5는 사용을 도면이다. 시야 (A) 및 형광 (B) 이미지 S. 위해 도시 세레 비지에의 형질 전환 효모에서 이종 단백질의 기능적 발현을 보여주는 URA3 플라스미드 인코딩 GFP로 형질. 세포는 더 나은 시각화 (코트에게 2 5 μl를 콘 카나 발린 A를 코팅 된 커버를 사용하기위한 고정 될 수있다밀리그램 / 각 22 × 22 μm의 coverslip에 공기 건조 위에 물 ml의 원액). 도 6a는 구강 투여 직전에 개최 C57BL / 6 마우스를 보여줍니다. 손을 마우스가 어떤 방향으로 헤드를 이동 시키도록 할 수없는 것을 단단히 같은 마우스의 뒤 목를 파악했다. 이 보류 위관 바늘 정확하게 배치하고 마우스가 위관 바늘을 삼킨 후 조직 손상의 감소 위험.도 6b 개최 위관 바늘을 표시 할 수 있습니다. 도 7에 도시 된 바와 같이, 항온 배양 기간 후, 희생 마우스의 소장 신중 주변 조직으로부터 떼어 내한다.이 조작은 주변의 모든 수집없이 파이어 패치 및 패치 깨끗한 절개 쉽게 식별 할 수있게 점막 고유 층. 마지막으로, 그림 8은 파이어 패치에서 가능한 효모 CFU의 전형적인 복구를 보여줍니다. </p&gt; <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 솔루션 </td><td> 효모 미디어 및 플레이트 </td><td> 변환 시약 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 50 % : </td><td> YPD : </td><td> TE / LiOAc : </td></tr><tr><td> 250g PEG 3350 </td><td> 20g 펩톤 </td><td> 50 ml의 10 배 TE </td></tr><tr><td> 500 ml의 멸균 </td><td> 20g의 포도당 </td><td> 50 ml의 10 배 (1M) LiOAc </td></tr><tr><td> 필터 소독 </td><td> 10g 효모 추출물 </td><td> 400 ml의 멸균 </td></tr><tr><td></td><td> 1 L의 물 </td><td> 필터 소독 </td></tr><tr><td></td><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td> TE 10 배 : </td><td> YPD 판 : </td><td> PEG / TE / LiOAc : </td></tr><tr><td> 100 mM 트리스 </td><td> 20g 펩톤 </td><td> 400 mL의 50 % PEG </td></tr><tr><td> 10 mM의 EDTA </td><td> 20g의 포도당 </td><td> 50 ml의 10 배 TE </td></tr><tr><td> 7.5 및 필터 소독에 pH를 </td><td> 20g 한천 </td><td> 50 ml의 10 배 (1M) LiOAc </td></tr><tr><td></td><td> 10g 효모 추출물 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 L의 물 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td> 20 % 글루코스 : </td><td> 우라실 - 선택적 미디어 </td><td> 캐리어 DNA (SS DNA) : </td></tr><tr><td> 200g의 포도당 </td><td> 우라실 결여 2g 아미노산 믹스 </td><td> -20 ℃에서 저장 및 스트랜드 용융 100 ℃에서 1-2 분 동안 열을 사용하고 얼음에 저장하기 전에 </td></tr><tr><td> 1 L의 물 </td><td> 아미노산이없는 6.7 g 효모 질소 염기 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 소독 </td><td> 1 L의 물 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td></td><td> 고압 증기 멸균 또는 살균 필터에 의해 소독 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 사용하기 전에 20 % 포도당 1:10 추가 </td><td></td></tr><tr><td> 50 % 글리세롤 : </td><td> 우라실 - 플레이트 : </td><td> 전기 버퍼 : </td></tr><tr><td> 500㎖의 글리세롤 </td><td> 250 ml의 플라스크에 : </td><td> 1 M 소르비톨 </td></tr><tr><td> 500 ml의 물 </td><td> 우라실 결여 2g 아미노산 믹스 </td><td> 1 mM의 염화칼슘 (2) </td></tr><tr><td> 압력솥 </td><td> 아미노산이없는 6.7 g 효모 질소 염기 </td><td> 증류수로 작성 </td></tr><tr><td></td><td> 150 ml의 물 </td><td> 4 ° C에서 압력솥 및 저장 </td></tr><tr><td></td><td> 2 L 플라스크에 : </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20g 한천 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 750 ml의 물 </td><td></td></tr><tR&gt; <td></td><td> 오토 클레이브 플라스크 별도로하고 100 ㎖의 20 % 글루코스와 함께 섞어 </td><td></td></tr><tr><td> 전체 IMDM </td><td> 5-FOA의 + 플레이트 : </td><td> LiOAc / DTT </td></tr><tr><td> 500 ml의 Iscove의 수정 된 둘 베코의 미디어 </td><td> 2 L 플라스크에 오토 클레이브 : </td><td> 0.1 M LiOAc </td></tr><tr><td> 5 ml의 페니실린 스트렙토 마이신 글루타민 100X </td><td> 20g 한천 </td><td> 10 mM의 DTT </td></tr><tr><td> 500 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 </td><td> 750 ml의 물 </td><td></td></tr><tr><td> 10 %의 열은 소 태아 혈청을 불 활성화 </td><td> 혼합: </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 ml의 피루브산 나트륨 100 mM의 </td><td> 아미노산이없는 6.7 g 효모 질소 염기 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 우라실없이 2g 아미노산 믹스 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 150 ml의 따뜻한 물 </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td> 때 멋진 추가 : </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.05 g의 우라실 분말 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1g 5-FOA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 교반 및 필터 소독 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 멸균 한천 솔루션에 추가 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 ml의 20 % 포도당과 혼합 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약 목록. 기재된 본 원고 프로토콜 사용 용액, 효모 미디어 플레이트, 및 변환 버퍼의 각각의 제조에 필요한 시약이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig1.jpg" /> 그림 1. 효모 식민지 YPD 매체에 성장. 예 YPD 판은 페이지 단위 (CFU)를 형성 가능한 식민지를 보여주는UV 조사 후 robiotic 효모. 셀이 직렬로 개별 CFU가 구분과 계산 될 수 있도록 희석 하였다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig2.jpg" /> 이배체 프로 바이오 틱 효모 그림 2. 생존 곡선. 가능한 S. 수 총 도금 세포의 퍼센트 boulardii에 CFU는 UV 조사 (실선)의 각 μJ 용량에 대한 플롯했다. 수직 빨간색 선이 효모 균주의 50 %의 생존에 해당 투여 량 μJ UV를 나타냅니다. UV 돌연변이 유발 손상을 복구 할 수 rad1 S. cerevisiae의 돌연변이는, 제어 (점선).로 표시되는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. &lt;</a>/&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig3.jpg" /> 도 URA3 3. 확인서 - UV의 표현형 YPD, 우라실에 세포를 조사 -, 5-FOA 플레이트 개별 UV 돌연변이 콜로니로부터의 세포를 무균 이쑤시개의 팁을 사용하여 수집하고 부드럽게 YPD, 우라실 걸쳐 스트리킹시켜 -., 5 -FOA 판. 세포는 먼저 새로운 이쑤시개가 두 번째 라인을 통과하고 각각의 세포가 분리 될 때까지 세포를 확산 계속하는 데 사용 된 두 개의 수직 교차 선에 줄무늬가되었다. 사실 URA3 - 돌연변이 (MUT)는 아니지만 우라실의 부재, YPD 미디어 및 5- FOA의 존재하에 성장한다. 제어 URA3 - S. cerevisiae의 (URA3 -) 및 URA3 + </<html> SUP&gt; S. boulardii에 (URA3 +)의 비교 표시되고. 효모 미디어의 적절한 준비를 확인하기 위해 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig4.jpg" /> 사카 균주의 그림 4. 변환 효율. 야생 유형 S. boulardii에 (SB)를하고 실험실 S. cerevisiae의 변형 (SC)는 설명 LiOAc (LiOAc) 및 전기 (전기) 프로토콜을 사용하여 형질 전환 하였다. 평균 CFU가 카나마이신 저항성 마커를 코딩하는 플라스미드의 μg의 당 얻어진 결과는 플롯됩니다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타내는 오차 막대와 중복 실험의 평균을 나타낸다.에스 / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig5.jpg" /> 형질 전환 효모에 의해 5. 기능성 단백질 발현 그림. S.을 빈 플라스미드 (A) 및 인코딩 플라스미드 GFP (B)로 형질 전환 된 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 형광 현미경을 이용하여 분석 하였다. GFP 플라스미드로 형질 전환 된 효모 세포에서 형광이 기능 GFP의 성공적인 생산을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig6.jpg" /> 구강 투여에 대한 C57BL / 6 마우스의 그림 6. 적절한 처리. 마우스가 개최 tightl입니다그래서 작은 손가락 아래에 자리 잡고 꼬리와 비 지배적 인 손에 y를 더 운동 (A) 할 수 없습니다. 위관 니들을 입 인두 지붕을 따라 삽입된다. 마우스는 플런저 (B) 우울과 솔루션은 다음. 위장을 입력 할 수 위관 바늘의 전구를 삼킬 수있다 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig7.jpg" /> 파이어 패치 그림 7. 준비 및 해부. 소장은 화살표 파이어 패치의 몇 가지를 가리키는으로, 다른 내부 장기 및 조직에서 멀리 해부 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig7large.jpg" target="_blank">더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의에. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig8.jpg" /> 그림 8. 파이어 패치에서 효모 복구. S.와 gavaged 마우스에서 가능한 해부, 균질화 한 후 검출 CFU, 총 파이어 판 세포의 도금의 예 boulardii에. 효모 세포를 YPD 배지에 도금을 2 일 동안 30 ℃에서 배양 하였다. 마우스 당 복구 CFU의 전형적인 수율은 10 미만입니다 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K 조회수.  Emory University School of Medicine.  개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다. 

비디오: Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

연구

유전학

A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be used to model diseases that are otherwise difficult or impossible to study in humans or other animal models. The gut microbiome can have a profound impact on human health and disease. However, the murine gut microbiome is very different than the one found in humans. &#160;There is a need for improved pre-clinical hu-mice models that have an engrafted human gut microbiome. Therefore, we created double hu-mice that feature both a human immune system and stable human-like gut microbiome. NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice are one of the best animals for humanization due to their high level of immunodeficiency. However, germ-free NSG mice, and various other important germ-free mice models are not currently commercially available. Further, many research settings do not have access to gnotobiotic facilities, and working under gnotobiotic conditions can often be expensive and time consuming. Importantly, germ-free mice have several immune deficiencies that exist even after the engraftment of microbes. Therefore, we developed a protocol that does not require germ-free animals or gnotobiotic facilities. To generate double hu-mice, NSG mice were treated with radiation prior to surgery to create bone-marrow, liver, thymus-humanized (hu-BLT) mice. The mice were then treated with broad spectrum antibiotics to deplete the pre-existing murine gut microbiome. After antibiotic treatment, the mice were given fecal transplants with healthy human donor samples via oral gavage. Double hu-BLT mice had unique 16S rRNA gene profiles based on the individual human donor sample that was transplanted. Importantly, the transplanted human-like microbiome was stable in the double hu-BLT mice for the duration of the study up to 14.5 weeks post-transplant.

We describe a novel method for generating double humanized BLT-mice that feature a functional human immune system and a stable engrafted human-like gut microbiome. This protocol can be followed without the need for germ-free mice or gnotobiotic facilities.

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

생화학

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult mouse models to neonatal diseases is limited. To better understand disease progression, host responses and long-term impact of interventions in neonates, a neonatal mouse model likely is a better fit. The sparse use of neonatal mouse models can in part be attributed to the technical difficulties of working with these small animals. A neonatal mouse model was developed to determine the effects of probiotic administration in early life and to specifically assess the ability to establish colonization in the newborn mouse intestinal tract. Specifically, to assess probiotic colonization in the neonatal mouse, Lactobacillus plantarum (LP) was delivered directly into the neonatal mouse gastrointestinal tract. To this end, LP was administered to mice by feeding through intra-esophageal (IE) gavage. A highly reproducible method was developed to standardize the process of IE gavage that allows an accurate administration of probiotic dosages while minimizing trauma, an aspect particularly important given the fragility of newborn mice. Limitations of this process include possibilities of esophageal irritation or damage and aspiration if gavaged incorrectly. This approach represents an improvement on current practices because IE gavage into the distal esophagus reduces the chances of aspiration. Following gavage, the colonization profile of the probiotic was traced using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of the extracted intestinal DNA with LP specific primers. Different litter settings and cage management techniques were used to assess the potential for colonization-spread. The protocol details the intricacies of IE neonatal mouse gavage and subsequent colonization quantification with LP.

This study details the process of gavaging precise amounts of probiotics to neonatal mice. The experimental set-up was optimized to include but is not limited to probiotic dosing, methods of administration, and quantification of bacteria in the intestines.

Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...

면역학 및 감염병학

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted considerable attention. Accumulating evidence suggests that dysbiotic microbiota plays an active role in triggering or worsening the inflammatory process in IBD and that fecal microbiota transplantation (FMT) is an attractive therapeutic strategy since transferring a healthy microbiota to IBD patient could restore the appropriate host-microbiota communication. However, the molecular mechanisms are unclear, and the efficacy of FMT has not been very well established. Thus, further studies in animal models of IBD are necessary. In this method, we applied FMT from wild-type C57BL/6J mice to IL-10 deficient mice, a widely used mouse model of colitis. The study elaborates on collecting fecal pellets from the donor mice, making the fecal solution/suspension, administering the fecal solution, and monitoring the disease. We found that FMT significantly mitigated the cardiac impairment in IL-10 knockout mice, underlining its therapeutic potential for IBD management.

The interaction of genetic susceptibility, mucosal immunity, and intestinal microecological environment is involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). In this study, we applied fecal microbiota transplantation to IL-10 deficient mice and investigated its impact on colonic inflammation and heart function.

인터루킨 10-결핍 마우스 모델에서 분변 미생물 이식의 치료 평가

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...

Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal microbiota transplantation (FMT) is a valuable approach to delineating a direct role of the total microbiota or isolated species in disease pathophysiology. It is a safe treatment option for patients with recurrent Clostridium difficile infection. Preclinical studies demonstrate that manipulating the gut microbiota is a useful tool to study the mechanistic link between dysbiosis and disease. Fecal microbiota transplantation may help elucidate novel gut microbiota-targeted therapeutics for the management and treatment of cardiometabolic disease. Despite a high success rate in rodents, there remains translational changes associated with the transplantation. The goal here is to provide guidance in studying the effects of gut microbiome in experimental cardiovascular disease. In this study, a detailed protocol for the collection, handling, processing, and transplantation of fecal microbiota in murine studies is described. The collection and processing steps are described for both human and rodent donors. Lastly, we describe using a combination of the Swiss-rolling and immunostaining techniques to assess gut-specific morphology and integrity changes in cardiovascular disease and related gut microbiota mechanisms.

The goal here is to outline a protocol to investigate the mechanisms of dysbiosis in cardiovascular disease. This paper discusses how to aseptically collect and transplant murine fecal samples, isolate intestines, and use the "Swiss-roll" method, followed by immunostaining techniques to interrogate changes in the gastrointestinal tract.

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Fecal Microbiota Transplantation and Detection of Prevalence of IgA-Coated Bacteria in the Gut

Gut microbiota exert pleiotropic roles in human health and disease. Fecal microbiota transplantation (FMT) is an effective method to investigate the biological function of intestinal bacteria as a whole or at the species level. Several different FMT methods have been published. Here, we present an FMT protocol that successfully depletes gut microbiota in a matter of days, followed by transplantation of fecal microbiota from fresh or frozen donor intestinal contents to conventional mice. Real time-PCR is applied to test the efficacy of bacterial depletion. Sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) is then applied to test the relative abundance and identity of gut microbiota in recipient mice. We also present a flow cytometry-based detection method of immunoglobulin A (IgA)-coated bacteria in the gut.

<meta charset="utf8"></head><body>분변 미생물군 이식 및 장내 IgA 코팅 박테리아 유병률 검출

We established an efficient way to deplete intestinal bacteria in three days, and subsequently transplant fecal microbiota via gavage of fecal fluid prepared from fresh or frozen intestinal contents in mice. We also present an optimized method to detect the frequency of IgA-coated bacteria in the gut.

분변 미생물군 이식 및 장내 IgA 코팅 박테리아 유병률 검출

Gut microbiota exert pleiotropic roles in human health and disease. Fecal microbiota transplantation (FMT) is an effective method to investigate the ...

생물학

Investigating the Alleviating Effects of Bacillus cereus Administration on Colitis through Gut Microbiota Modulation

Gut microbiota dysbiosis is thought to exert a role in the progression of colitis. However, the precise standards for probiotic administration in alleviating colitis remain undefined. Most analysis methods rely on limited diversity and abundance of gut microorganisms. Therefore, observational studies cannot establish causation. In this study, we applied antibiotic-induced pseudo-germ-free mice to investigate the role of gut microbiota in regulating the probiotic effects of Bacillus&#160;cereus (B. cereus)&#160;on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. This process allows for evaluating the bidirectional regulating effect of B. cereus&#160;supplementation on health and provides stable and reproducible results. Here, the detailed protocols for B. cereus cultivation, gavage operation, stool collection, and antibiotic clearance treatment on colitis mice are provided. The optimization methods are also applicable for other chronic inflammatory-associated disorders. The results showed that B. cereus administration decreased body weight loss, colon length shortening, disease activity index, and histopathological scores. However, treatment with antibiotics suppressed the positive effect of B. cereus on colitis. These results indicate that gut microbiota are needed for the alleviating effects of B. cereus on colitis. Therefore, exploring the beneficial effects of probiotics in this research is a promising approach for developing novel treatment strategies for alleviating the symptoms of chronic inflammatory-associated disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>장내 미생물군 조절을 통한 대장염에 대한 Bacillus cereus 투여의 완화 효과 조사

Here, we present a protocol to establish the antibiotic-induced pseudo-germ-free dextran sulfate sodium-induced colitis mouse model to investigate the role of gut microbiota in regulating the positive effects of Bacillus cereus on colitis.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

요약

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신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

안정된 인간과 같은 장내 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 특징으로 하는 이중 인간화 BLT 마우스 모델

Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

인터루킨 10-결핍 마우스 모델에서 분변 미생물 이식의 치료 평가

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

분변 미생물군 이식 및 장내 IgA 코팅 박테리아 유병률 검출

분변 미생물군 이식 및 장내 IgA 코팅 박테리아 유병률 검출

장내 미생물군 조절을 통한 대장염에 대한 Bacillus cereus 투여의 완화 효과 조사