Name: transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
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著者らは、トレイシーJ.ラムに授与免疫とワクチンおよびNIH新イノベーター賞（1DP2AI112242-01）のための児童センターを通じて資金調達を認めます。著者らはまた、RAD1 Sの寛大な貢献のためナタリアP. Degtyarevaに感謝セレビシエ 。

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著者らは、開示することは何もありません。

一緒に、プロトコルは、本明細書中に腸への異種治療用タンパク質の送達のための栄養要求性プロバイオティクス酵母株の開発とテストのために必要な基本的な手順を説明します。この操作および組換えプロバイオティクス酵母のテストは、個々の研究室では現在、慣れていない可能性があるとの技術とリソースが必要です。多数の以前の研究では、複数の酵母とマウスの株については、上記のプロトコルを説明したがこのように、これらの方法では、筆者の知る限り詳細な、統一された形で提示されていません。さらに、本原稿は、一般的に使用される実験室酵母株未満の十分に特徴づけされているプロバイオティクス酵母の遺伝子操作のための現在の標準化されたプロトコルを、適応に特に重点を置きます。 （パート1で説明した）突然変異誘発および形質転換（パート2）の両方のための多くのステップは、このような二倍体の操作のために最適化されなければならない、プロバイオティクス酵母isolatエス。本稿では、動物の扱い（パート3）と小腸のパイエル板免疫組織（パート4）の解剖に関連する潜在的な落とし穴を説明します。 多くの産業および臨床的に関連する酵母株は、大規模な遺伝子操作に即座に適合されないように、そのような高価な抗生物質を含まない増殖させ選択することができる栄養要求性突然変異体株を生成することが必要です。 UV変異誘発は、栄養要求性遺伝子7,41の迅速な非特異的な変異を可能にするような一手法です。生存曲線は、容易に変異体をスクリーニングするための適切な用量を決定するために（ 図1および図 2）を生成することができます。しかしながら、このアプローチは、酵母株の増殖速度または他の特性に影響を与えることができる標的変異をオフ誘発するリスクを伴います。ターゲットを絞ったノックアウトではなく、PCR構築またはCRISPR / Cas9システムを使用して生成することができます。その後のスクリーニングまたは選択突然変異体の（ 図3）は、栄養要求性酵母の同定を可能にします。 5-FOA培地上にプレーティングすることにより、選択の使用は、例えば、まだ機能URA3栄養要求性遺伝子を含む任意の酵母の迅速な排除を可能にします。可能な場合、この選択アプローチは、生成されたすべてのコロニーの分析を必要とする画面に好ましいかもしれません。選択またはスクリーニングのいずれかで、しかし、栄養要求性の状態を確認するために、選択培地上に個々の酵母コロニーを繰り返しストリーキングを実行するために重要です。 生成された変異体の形質転換は、異なるプロトコルを介して達成することができます。 LiOAc変換は、特に、最も一般的に使用される実験室S.ために、多くの酵母の形質転換に有効であるがセレビシエ株は、例えば、エレクトロなどの代替プロトコルは、他の酵母は、より高い効率（ 図4）で分離し変換することができます。それぞれの新しい株は、USIをテストする必要があります形質転換のための最適な条件を決定するために複数のプロトコルをngの。インキュベーション時間およびDNAの濃度を変化させる、例えば、全体的な変換効率に影響を与えることができ、各株33について試験し、最適化されるべきです。 強制経口投与は、直接免疫組織その後、酵母および異種タンパク質についてアッセイすることができ、マウス消化管、これらの組換え酵母の制御された用量の送達を可能にします。適切な経口栄養法（ 図6）は 、動物の不快感を最小限にし、実験精度を高めることが重要です。また、パイエル板は、腸からの組換え酵母の取り込みを評価するための重要な部位です。免疫組織のこれらのクラスターは、抗原のサンプリングおよび粘膜免疫応答の誘導の重要な部位です。直径酵母3-6ミクロンを含む大規模な抗原は、GAを横断するために、パイエル板のM細胞に取り込まれる可能性が最も高いですstrointestinal上皮および免疫細胞と相互作用します。パッチではなく腸管腔または粘膜固有層が収集されているよりも（ 図7）の中から、その細胞のみを確実にするために、パイエル板を切開する際には注意する必要があります。さらなるステップはまた、回収された酵母（ 図8）において異種タンパク質の適切な発現および機能を評価するために、次の解剖を取らなければなりません。酵母溶解物および免疫ブロット法からの全タンパク質の調製物は、タンパク質の発現を評価する一つの標準的な方法です。しかしながら、このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能に関する情報を提供しません。タンパク質機能を評価するために、酵母プラスミドコードするGFPで形質転換し、機能的なGFP発現（ 図5）を評価するために、パイエル板から回収した後、蛍光顕微鏡下で分析することができます。 要するに、この原稿があちこちのステップに及ぶ詳細な実験プロトコルの統一セットを提示マウスの腸からのプロバイオティクス酵母の回復に栄養要求性変異体の生成をメートル。伝統的に専門知識の単一の領域内に入らないプロトコルをコンパイルすることにより、これらの記述は、経口薬物送達ベクターとして設計されたプロバイオティクス酵母に対する免疫応答をテストし、さらに研究を促進します。著者らは、この研究では、新規の、プロバイオティクスベースの組換え治療法の開発に最も効率的なアプローチのために道を開く、議論を奨励し、試験した各酵母株のための実験方法の最適化を促進することを願っています。

プロバイオティック微生物は、効率的かつ経済的に消化管に異種タンパク質を提供する魅力的な潜在的な手段です。これらの生物は、まだ1コロニーを形成しない消化管通過を存続制御の投与を可能にし、薬物が発現への曝露を制限することが可能です。また、簡単に大規模で異種タンパク質を産生するために、これらの生物を設計する能力は、それらを合成送達粒子への経済的な代替をレンダリングします。しかし、このようなアプローチの開発は、最近2 ブラウディプロバイオティクス酵母サッカロマイセスの栄養要求株を用いて実証されたように、実験技術の知識が伝統的に酵母および分子生物学から動物取扱技術および免疫学的方法に至るまで、与えられた研究の中に結合していない必要があります。したがって、本明細書に記載の個々の手順は、それ自体では小説ではありませんが、実験室プロトコルは、本稿の目的は、マウス消化管への薬物送達ビヒクルとしてプロバイオティクス酵母の実験的試験のために必要な技術と統合された導入を提示することです。提供に不可欠なプロトコルをまとめたものです：簡単に遺伝的に操作することができる酵母の栄養要求性変異株の1）の生成は、酵母培養物の2）の形質転換は、異種タンパク質を発現します。強制経口投与を介して腸への組換え酵母の3）投与;そして4）その異種タンパク質発現のマウス腸及び評価から実行可能な組換えプロバイオティクス酵母の回復を。 多数の正および負の選択方法は、酵母種の操作のために存在するが、まず、このような栄養要求性マーカーの使用を介して負の選択は、酵母を形質転換し、選択することができる効率および容易さの両方を増加させます。共同での抗生物質を使用して形質転換体の正の選択、ntrast、大幅酵母操作のコストを増加させます。また、抗生物質を含む固体培地上での酵母の選択が出て、合成ドロップ固形培地（未発表の観察）での栄養要求性酵母の選択に相対的な形質転換されていないバックグラウンドコロニーの増加成長を可能にすることができます。栄養要求性酵母は、必須アミノ酸またはウラシルの合成のための重要な酵素を欠いている株です。このような酵母は、酵母は不可欠な代謝産物を欠いているメディアアウト合成ドロップ上にめっきされたときにこのように、負の選択を可能にする、不足している代謝物または代謝遺伝子を補充した場合にのみ成長することができます。多くの一般的に使用されるサッカロマイセス・セレビシエ実験室株は、すでに実際には栄養要求性変異株3です。工業、臨床、およびプロバイオティクス酵母株は、しかし、一般的にすべての必要な栄養素を合成する能力を持つ原栄養です。このような酵母のより効率的な遺伝子操作を有効にするには、栄養要求性遺伝子を選択的に標的とすることができます抗生物質を含まない選択することができる株を生成します。 6 -栄養要求性マーカー遺伝子の標的特異的4を標的 CRISPR / Cas9を通してより最近、相同組換えに頼るまたはPCR媒介性の遺伝子破壊を介して達成することができます。また、UV突然変異誘発は、すぐにでも、複数のプラスミドを用いた形質転換は7技術的に困難な酵母株に栄養要求性変異体を生成することができます。 PCRの標的化およびCRISPR / Cas9が広範囲に他の場所に記載されているが、この写本の一つは負の選択ではなく、酵母形質転換体の正の抗生物質の選択を可能にする栄養要求株を作成するために、UV突然変異誘発アプローチを説明する詳細なプロトコルである部分で提示。 異種タンパク質の経口送達のためのそのような栄養要求性株の使用で次の必要なステップでは、プラスミドDNAと酵母の形質転換です。賛否の最初の成功の変換以来1978年8 サッカロミセス・セレビシエについて報告Tスフェロプラストは、多数の変更は、効率を高め、酵母種の遺伝的に改変することができると容易に特徴付けられています。 S.へのDNAの形質転換の成功のためのエレクトロポレーションの使用セレビシエは、最初の 1985年9で説明した、それ以来浸透圧的支持細胞10から1 Mソルビトールインキュベーションの添加によって改善されました。エレクトロポレーションの効率はさらに酵母種および株、細胞数及び増殖の位相、電気容量、電界強度、および特定のバッファ11に依存することが示されています。それは特別な機器を必要としないように元々伊藤ら 12によって記載リチウムアセテート（LiOAc）変換は、最も一般的に使用される形質転換プロトコルの一つです。さらなる分析は、細胞が中期対数期に回収されたときLiOAc酵母形質転換の効率が大幅に増加することを示しました成長及びC 12 42℃でポリエチレングリコール（PEG）及びDNAの存在下で熱ショックを与えています。 PEGと全体無傷の酵母のインキュベーションは、おそらく、細胞膜へのDNAの付着を向上させることを通じて、ならびに膜13上の他の効果を経由して、効率的な形質転換のために不可欠です。リチウム自体も無傷の細胞14の透過性を増大させます。なお、ほとんどの実験室S.セレビシエ株は容易LiOAc変換3を用いて形質転換することができ、他の酵母種は、より効率的に代替プロトコルを用いて形質転換することができる。 ピキア・パストリス 、例えば、最も効率的にエレクトロポレーションではなく、LiOAc変換13を介して変換される。これは、複数のテストするため、重要です遺伝的に特徴づけられていない酵母株を変更しようとすると、インキュベーション期間および試薬濃度を最適化するための形質転換の方法および。この原稿は、このようにLiOAc trの両方を記述栄養要求性変異株と野生型S.の形質転換のための技術としてansformationとエレクトロポレーションブラウディ 。興味のある読者は、酵母形質転換、代替プロトコル、およびアクション13,15の可能なメカニズムのさらなる議論の進化の徹底的な説明については、最近のレビューに向けられています。プラスミドは簡単に検出可能なタンパク質をコードする酵母の形質転換は、異種タンパク質の適切な発現および機能を確保するために、下流のテストのために、さらに不可欠です。無数の異なるタンパク質は、治療研究と、ELISAを免疫ブロッティングによるタンパク質の検出のために利用可能な抗体、および他の技術の最終的な目的に応じて適宜選択することができます。これらの技術のためのプロトコルは、完全に別の箇所16,17に記載されている、標準曲線と比較することによって形質転換された酵母からの異種タンパク質の産生のレベルを決定するために用いることができます。デモの目的のために、ショーへ酵母の生物学において非常に一般的に使用されるタンパク質の産生に成功し、この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して、後続の検出を可能にコードするプラスミド緑色蛍光タンパク質（GFP）との変換を示します。 異種タンパク質を発現するプロバイオティック生物の生産にも同様に重要な部分3および4に記載されているように、胃腸組織内のこれらの微生物の適切な投与および検出です。強制経口投与を介して組換え酵母の投与からC57BL / 6マウスを、直接胃に酵母の制御された量の送達を可能にする自然18嘔吐することができません。しかし、不適切な動物の取り扱いと強制経口投与は、食道損傷や穿 ​​孔、胃穿孔、気管内投与、および誤嚥性肺炎19,20につながることができます。悪い技術と経験不足はさらに、マウスの免疫応答と実験RESUの変動を増加させることができます強制経口投与21,22時に動物のストレスに起因しているLTS、。適切な手法で実践は、このように、動物の不快感を減衰させることができるだけでなく、実験結果の精度を高めることができます。本稿では説明し、組換え酵母の制御された用量の投与のための動物の取り扱いと強制経口投与を示しています。 最後に、酵母および異種タンパク質の存在のためのリンパ組織を分析することによって組換え酵母の配信の成功を確認することが重要です。最も簡単かつ予測酵母の存在について試験することができる胃腸の免疫組織がパイエル板です。パイエル板は、粘膜免疫応答の誘導23の主要な部位である小腸に沿って二次リンパ器官です。内腔からの抗原は、上皮でmicrofold（M）細胞を介してtranscellularly転送され、パイエル板中に放出され、このように同封さらしますD抗原腸の管腔内容物に細胞を提示します。腸上皮を横切る粒子の取り込みはまた、杯細胞によって達成することができますが、これらの細胞のみを取る粒子径24で0.02μm未満に示されています。経上皮樹状突起はまた、腸管腔25から小さな粒子を取るCD103 +樹状細胞（DC）から延長しました。しかし、CD103 + DCは、細菌よりも大きな粒子を取ることが実証された報告は現在のところ存在しません。したがって、無傷のプロバイオティック酵母は、直径が3~6ミクロンの間の平均サイズ、M細胞によって取り込まれ、パイエル板に転写される可能性が最も高いです。ここで説明するこの手順では、簡単にプロバイオティクス細菌の取り込みを評価するために適合させることができるものの、生存可能な遺伝子組換え酵母のためのパイエル板の収集およびスクリーニングするためのプロトコルです。 要約すると、送達するための組換えプロバイオティクス酵母を評価します腸へrapeuticタンパク質は、動物の取り扱いおよび免疫学に分子生物学に及ぶ実験技術に習熟する必要があります。 1のためにここに提示されているプロトコル）を簡単に否定的に抗生物質を含まない選択することができます生成と栄養要求性酵母株のスクリーニングは、2）代替プロトコルは、酵母を形質転換し、異種タンパク質の発現を可能にする、3）適切な動物ハンドリング技術とのための強制経口投与のデモンストレーション組換え酵母の胃内送達、およびパイエル板の解剖のための4）プロトコル、生存組換え酵母で機能的異種タンパク質をスクリーニングします。組み合わせることで、これらのプロトコルは、胃腸管に異種治療用タンパク質を送達することができるプロバイオティクス酵母株の生成およびテストを可能にします。

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast cultures</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Example of roller drum for yeast culture incubation</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Example stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&amp;nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Hand held colony counter pen</td></tr><tr><td>Replica plating device</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Example of replica plating stand and pads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Velveteen squares</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L shaped sterile cell spreaders&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation</td></tr><tr><td>Gavage needles</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&amp;nbsp;002</td><td>For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20&amp;nbsp;g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used</td></tr><tr><td>1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7&quot; (178 mm) serrated tip, broad grip forceps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>Example of blunt forceps needed for dissection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Straight and curved dissection scissors</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72966-02 and 72966-03</td><td>Examples of scissors needed for dissection</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation of probiotic yeast and their recovery from gastrointestinal immune tissues following oral gavage in mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

UV照射後の生存曲線の生成は、別個のコロニー形成単位（CFU）を形成することができるように希釈された酵母細胞のプレーティングを必要とします。上記のように収集された各500μlのサンプルは、約5×10 6個の細胞が含まれています。しかし、プレート当たり100以上のコロニーが正確に区別することが困難です。希釈していない試料ならびに照射細胞の連続1時10希釈をプレーティングすることは、したがって、図1に示されているように、CFUは、各UV線量で列挙することができることを保証する。希釈係数を乗じたCFUカウントは、その後の総数で割って各用量での生存率を決定するために、各500μlのサンプル中の元照射された細胞。 図2は、二倍体野生型Sの計算された割合を示していますブラウディ細胞0μJ、5000μJ、万μJ、15,000μJ20,000μJ、22,500μJ、25,000を生き残ることができますμJ、35,000μJ、および50,000μJ。これらのデータは、50％の生存率に相当する投与量を見つけるために使用することができる明確な曲線を確立します。 酵母細胞のUV線量照射を選択した後、機能的栄養要求性マーカー遺伝子の欠如を確認するために、突然変異体コロニーをスクリーニングすることが重要です。選択方法の使用は、1.2.3.1に記載され、 図3に示されるように、有意な表現型の確認の効率を高めます。無傷のUra3によって毒素5-FUを5-FOAの変換を利用するURA3選択の例が示されています。 TRP1;類似のアプローチがLYS2とLYS5ために利用可能であり、MET2およびMET15およびこれらの変異の選択の効率を高めます。ケアは、スクリーニングの間に個々のコロニーを選択するように注意しなければなりません。一貫性のYPDおよび5-FOA上の変異コロニーの成長ではなく、ウラシル- 、プレートindicat栄養要求性の表現型をES。 図4は、野生型 S.の変換効率を示します一般的に使用される実験室Sに ブラウディ （Sb）を相対LiOAc（LiOAc）およびエレクトロポレーション（電気）技術の両方を使用してセレビシエ株 （SC）。 LiOAc変換はS.のための非常に効率的であるが、 セレビシエ 、S。の変換効率ブラウディが大幅 。エレクトロポレーションを使用して改良された形質転換酵母からの適切なタンパク質発現を解析する方法の一例として、蛍光顕微鏡の図5で使用した図です 。明（A）および蛍光（B）の画像は 、Sのために示されていますセレビシエは、形質転換された酵母由来の異種タンパク質の機能発現を示す、URA3のGFPをコードするプラスミドで形質転換しました。細胞はコンカナバリンA 2の（コート5μlのコーティングされたカバースリップを使用して、より良い視覚化のために固定化することができます各22×22ミクロンのカバーガラスと空気乾燥の上に水の中mg / mlでストック溶液）。 図6Aは、強制経口投与の直前に開催されたC57BL / 6マウスを示しています。手は、マウスが任意の方向にヘッドを移動することができないことをしっかりと、マウスの背中と首を把握します。このホールドは、胃管栄養針を正確に配置し、組織損傷のリスク減少とすることができます。 図6Bは、マウスが強制飼養針を飲み込んだ後に開催された胃管栄養針を示しています。インキュベーション期間の後、犠牲マウスの小腸は慎重に、図7に示すように、周囲の組織から離れてからかわれるべきである。この操作は、周囲のいずれかを収集せずにパイエル板を簡単に識別するためのパッチのクリーンな解剖を可能にします粘膜固有層。 最後に、図8は、パイエル板から実行可能な酵母CFUの典型的な回復を示しています。 </p&gt; <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td> 酵母メディアとプレート </td><td> 変換試薬 </td></tr><tr><td> ポリエチレングリコール（PEG）を50％ </td><td> YPD： </td><td> TE / LiOAc： </td></tr><tr><td> 250グラムのPEG 3350 </td><td> 20gのペプトン</td><td> 50ミリリットル10倍のTE </td></tr><tr><td> 500ミリリットルの滅菌水</td><td> 20gのデキストロース</td><td> 50ミリリットル10倍（1M）LiOAc </td></tr><tr><td>フィルター滅菌し</td><td> 10gの酵母エキス</td><td> 400ミリリットルの滅菌水</td></tr><tr><td></td><td> 1Lの水</td><td>フィルター滅菌し</td></tr><tr><td></td><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td> TE 10倍： </td><td> YPDプレート： </td><td> PEG / TE / LiOAc： </td></tr><tr><td> 100mMのTris </td><td> 20gのペプトン</td><td> 400ミリリットルの50％PEG </td></tr><tr><td> 10mMのEDTA </td><td> 20gのデキストロース</td><td> 50ミリリットル10倍のTE </td></tr><tr><td> 7.5にpH及びフィルター滅菌し</td><td> 20gの寒天</td><td> 50ミリリットル10倍（1M）LiOAc </td></tr><tr><td></td><td> 10gの酵母エキス</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1Lの水</td><td></td></tr><tr><td></td><td>オートクレーブ</td><td></td></tr><tr><td> 20％グルコース。 </td><td> ウラシル-選択培地 </td><td> キャリアDNA（SS DNA）： </td></tr><tr><td> 200グラムのブドウ糖</td><td>ウラシルを欠く2gのアミノ酸混合物</td><td> -20℃で保存し、氷上でストランドとストアを溶融するために100℃で1〜2分間の熱を使用する前</td></tr><tr><td> 1Lの水</td><td>アミノ酸を含まない6.7グラムの酵母窒素塩基</td><td></td></tr><tr><td>フィルター滅菌し</td><td> 1Lの水</td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td></td><td>オートクレーブ滅菌または滅菌濾過により滅菌します</td><td></td></tr><tr><td></td><td>使用前に20％グルコース1:10に追加</td><td></td></tr><tr><td> 50％グリセロール。 </td><td> ウラシル-プレート： </td><td> エレクトロポレーションバッファー： </td></tr><tr><td> 500mLのグリセロール</td><td> 250mlのフラスコ中： </td><td> 1 Mソルビトール</td></tr><tr><td> 500ミリリットルの水</td><td>ウラシルを欠く2gのアミノ酸混合物</td><td> 1 mMのCaCl 2を</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>アミノ酸を含まない6.7グラムの酵母窒素塩基</td><td>蒸留水で埋めます</td></tr><tr><td></td><td> 150ミリリットルの水</td><td> 4℃でオートクレーブとストア</td></tr><tr><td></td><td> 2Lのフラスコ中： </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20gの寒天</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 750ミリリットルの水</td><td></td></tr><tR&gt; <td></td><td>オートクレーブフラスコ別途、その後、100ミリリットル20％グルコースと一緒に混ぜます</td><td></td></tr><tr><td> 完全IMDM </td><td> 5-FOA +プレート： </td><td> LiOAc / DTT </td></tr><tr><td> 500ミリリットルイスコフ改変ダルベッコ培地</td><td> 2Lフラスコ中でオートクレーブ。 </td><td> 0.1 M LiOAc </td></tr><tr><td> 5ミリリットルのペニシリンストレプトマイシングルタミン100X </td><td> 20gの寒天</td><td> 10mMのDTT </td></tr><tr><td> 500μlの2-メルカプトエタノール</td><td> 750ミリリットルの水</td><td></td></tr><tr><td> 10％熱不活性化ウシ胎児血清</td><td>ミックス： </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mlのピ​​ルビン酸ナトリウム、100mMの</td><td>アミノ酸を含まない6.7グラムの酵母窒素塩基</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ウラシル無し2gのアミノ酸混合物</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 150ミリリットル温水</td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td>冷却時、追加します。 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.05グラムのウラシル粉末</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1グラム5-FOA </td><td></td></tr><tr><td></td><td>攪拌し、フィルター滅菌</td><td></td></tr><tr><td></td><td>オートクレーブした寒天液に追加</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100ミリリットル20％グルコースを混ぜます</td><td></td></tr></tbody></table> 表1.試薬一覧。説明は、この原稿にプロトコルのために使用される溶液のそれぞれを作るために必要な試薬、酵母培地とプレート、および変換バッファです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig1.jpg" /> 図1酵母コロニーは、YPD培地上で増殖させた。実施例YPDプレートPの単位（CFU）を形成する実行可能なコロニーを示しますUV照射後robiotic酵母。セルを直列個々のCFUを区別し、カウントすることができるように希釈した。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig2.jpg" /> 二倍体プロバイオティクス酵母図2.生存曲線。実行可能なS.の数総播種した細胞のパーセントとしてブラウディ CFUは、UV照射（実線）のそれぞれμJの用量についてプロットしました。縦の赤い線はμJUVは、この酵母株の50％の生存率に相当する線量を示しています。 UV変異誘発からの損傷を修復することはできませんRAD1 S.セレビシエ変異株は、コントロール（破線）。として示されている<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig2large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。&lt;</a>/ A&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig3.jpg" /> URA3 の図3.確認 - UVの表現型は、YPDにウラシルを細胞に照射 - 、 および5-FOAプレートの個々のUV突然変異体のコロニーからの細胞を滅菌爪楊枝の先端を使用して収集し、静かにYPD、ウラシルを横切って画線した- 。、および5 -FOAプレート。細胞は最初の二つの直交する交差線に画線し、その後新しい爪楊枝は、第二のラインを通過し、個々の細胞を分離するまで、細胞を拡散継続するために使用されました。真のURA3 -突然変異体（MUT）は、YPDメディアおよび5-FOAの存在下ではなく、ウラシルの非存在下で成長します。コントロールURA3 - S.セレビシエ （URA3 - ）とURA3 + </<html> SUP&gt; S.ブラウディ （URA3 +）は、比較のために示されていると。酵母培地の適切な準備を確認するために、 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig4.jpg" /> サッカロマイセス 株の 図4.形質転換効率 。野生型S.ブラウディ （SB）および実験S.セレビシエ株 （Sc）が記載さLiOAc（LiOAc）およびエレクトロポレーション（電気）プロトコルを使用して形質転換しました。平均CFUはカナマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドμgのあたりに得られた結果をプロットしています。バーは平均の標準誤差を示すエラーバーと重複実験の平均を示します。エス/ ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig5.jpg" /> 図5.形質転換酵母による機能性タンパク質の発現。S. に空のプラスミド（A）プラスミドをコードするGFP（B）を用いて形質転換セレビシエは、蛍光顕微鏡を用いて分析しました。 GFPプラスミドで形質転換された酵母細胞内の蛍光は、機能的GFPの成功の生産を示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig6.jpg" /> 強制経口投与のためのC57BL / 6マウスの図6.適切に取り扱う。マウスが開催tightlです何の動きは（A）可能ではないように、小さな指の下に隠れて尾と非利き手でのy。胃管栄養針は、口の屋根に沿って咽頭に挿入されます。マウス。（B）プランジャーが押されているように、溶液はその後、胃を入力することができ、胃管栄養針の電球を飲み込むことが許可されている<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig6large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig7.jpg" /> パイエル板の図7の調製および解剖。小腸は矢印がパイエル板の数を指していると、他の臓器や組織から離れて解剖されて示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig7large.jpg" target="_blank">より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の上。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53453/53453fig8.jpg" /> 図8パイエル板から酵母回復。S で強制飼養マウスの生存可能な解剖、均質化後に検出CFU、および総パイエル板細胞のプレーティングの例ブラウディ 。細胞を、YPD酵母培地上に播種し、2日間30℃でインキュベートしました。マウスごとに回収されたCFUの典型的な収率は10未満であり<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53453/53453fig8large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

ここで提示は、開発変換、管理、およびプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・ブラウディの異種タンパク質の発現を試験するために使用することができる技術の統一説明します。

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K ビュー.  Emory University School of Medicine. ここで提示は、開発変換、管理、およびプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・ブラウディの異種タンパク質の発現を試験するために使用することができる技術の統一説明します。 

ビデオ: Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

遺伝学

A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be used to model diseases that are otherwise difficult or impossible to study in humans or other animal models. The gut microbiome can have a profound impact on human health and disease. However, the murine gut microbiome is very different than the one found in humans. &#160;There is a need for improved pre-clinical hu-mice models that have an engrafted human gut microbiome. Therefore, we created double hu-mice that feature both a human immune system and stable human-like gut microbiome. NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice are one of the best animals for humanization due to their high level of immunodeficiency. However, germ-free NSG mice, and various other important germ-free mice models are not currently commercially available. Further, many research settings do not have access to gnotobiotic facilities, and working under gnotobiotic conditions can often be expensive and time consuming. Importantly, germ-free mice have several immune deficiencies that exist even after the engraftment of microbes. Therefore, we developed a protocol that does not require germ-free animals or gnotobiotic facilities. To generate double hu-mice, NSG mice were treated with radiation prior to surgery to create bone-marrow, liver, thymus-humanized (hu-BLT) mice. The mice were then treated with broad spectrum antibiotics to deplete the pre-existing murine gut microbiome. After antibiotic treatment, the mice were given fecal transplants with healthy human donor samples via oral gavage. Double hu-BLT mice had unique 16S rRNA gene profiles based on the individual human donor sample that was transplanted. Importantly, the transplanted human-like microbiome was stable in the double hu-BLT mice for the duration of the study up to 14.5 weeks post-transplant.

We describe a novel method for generating double humanized BLT-mice that feature a functional human immune system and a stable engrafted human-like gut microbiome. This protocol can be followed without the need for germ-free mice or gnotobiotic facilities.

安定したヒト様腸内微生物叢とヒト免疫系を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデル

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

生化学

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult mouse models to neonatal diseases is limited. To better understand disease progression, host responses and long-term impact of interventions in neonates, a neonatal mouse model likely is a better fit. The sparse use of neonatal mouse models can in part be attributed to the technical difficulties of working with these small animals. A neonatal mouse model was developed to determine the effects of probiotic administration in early life and to specifically assess the ability to establish colonization in the newborn mouse intestinal tract. Specifically, to assess probiotic colonization in the neonatal mouse, Lactobacillus plantarum (LP) was delivered directly into the neonatal mouse gastrointestinal tract. To this end, LP was administered to mice by feeding through intra-esophageal (IE) gavage. A highly reproducible method was developed to standardize the process of IE gavage that allows an accurate administration of probiotic dosages while minimizing trauma, an aspect particularly important given the fragility of newborn mice. Limitations of this process include possibilities of esophageal irritation or damage and aspiration if gavaged incorrectly. This approach represents an improvement on current practices because IE gavage into the distal esophagus reduces the chances of aspiration. Following gavage, the colonization profile of the probiotic was traced using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of the extracted intestinal DNA with LP specific primers. Different litter settings and cage management techniques were used to assess the potential for colonization-spread. The protocol details the intricacies of IE neonatal mouse gavage and subsequent colonization quantification with LP.

This study details the process of gavaging precise amounts of probiotics to neonatal mice. The experimental set-up was optimized to include but is not limited to probiotic dosing, methods of administration, and quantification of bacteria in the intestines.

強制経口投与を用いた新生児マウスにおけるプロバイオティクス研究

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...

免疫・感染学

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted considerable attention. Accumulating evidence suggests that dysbiotic microbiota plays an active role in triggering or worsening the inflammatory process in IBD and that fecal microbiota transplantation (FMT) is an attractive therapeutic strategy since transferring a healthy microbiota to IBD patient could restore the appropriate host-microbiota communication. However, the molecular mechanisms are unclear, and the efficacy of FMT has not been very well established. Thus, further studies in animal models of IBD are necessary. In this method, we applied FMT from wild-type C57BL/6J mice to IL-10 deficient mice, a widely used mouse model of colitis. The study elaborates on collecting fecal pellets from the donor mice, making the fecal solution/suspension, administering the fecal solution, and monitoring the disease. We found that FMT significantly mitigated the cardiac impairment in IL-10 knockout mice, underlining its therapeutic potential for IBD management.

The interaction of genetic susceptibility, mucosal immunity, and intestinal microecological environment is involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). In this study, we applied fecal microbiota transplantation to IL-10 deficient mice and investigated its impact on colonic inflammation and heart function.

インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...

Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal microbiota transplantation (FMT) is a valuable approach to delineating a direct role of the total microbiota or isolated species in disease pathophysiology. It is a safe treatment option for patients with recurrent Clostridium difficile infection. Preclinical studies demonstrate that manipulating the gut microbiota is a useful tool to study the mechanistic link between dysbiosis and disease. Fecal microbiota transplantation may help elucidate novel gut microbiota-targeted therapeutics for the management and treatment of cardiometabolic disease. Despite a high success rate in rodents, there remains translational changes associated with the transplantation. The goal here is to provide guidance in studying the effects of gut microbiome in experimental cardiovascular disease. In this study, a detailed protocol for the collection, handling, processing, and transplantation of fecal microbiota in murine studies is described. The collection and processing steps are described for both human and rodent donors. Lastly, we describe using a combination of the Swiss-rolling and immunostaining techniques to assess gut-specific morphology and integrity changes in cardiovascular disease and related gut microbiota mechanisms.

The goal here is to outline a protocol to investigate the mechanisms of dysbiosis in cardiovascular disease. This paper discusses how to aseptically collect and transplant murine fecal samples, isolate intestines, and use the "Swiss-roll" method, followed by immunostaining techniques to interrogate changes in the gastrointestinal tract.

マウス糞便分離と微生物叢移植

Gut microbiota dysbiosis plays a role in the pathophysiology of cardiovascular and metabolic disorders, but the mechanisms are not well understood. Fecal ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

無菌マウスへのヒト糞便移植のためのBioexclusion IsoPositive Cage実験の調製と維持

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Fecal Microbiota Transplantation and Detection of Prevalence of IgA-Coated Bacteria in the Gut

Gut microbiota exert pleiotropic roles in human health and disease. Fecal microbiota transplantation (FMT) is an effective method to investigate the biological function of intestinal bacteria as a whole or at the species level. Several different FMT methods have been published. Here, we present an FMT protocol that successfully depletes gut microbiota in a matter of days, followed by transplantation of fecal microbiota from fresh or frozen donor intestinal contents to conventional mice. Real time-PCR is applied to test the efficacy of bacterial depletion. Sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) is then applied to test the relative abundance and identity of gut microbiota in recipient mice. We also present a flow cytometry-based detection method of immunoglobulin A (IgA)-coated bacteria in the gut.

<meta charset="utf8"></head><body>糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

We established an efficient way to deplete intestinal bacteria in three days, and subsequently transplant fecal microbiota via gavage of fecal fluid prepared from fresh or frozen intestinal contents in mice. We also present an optimized method to detect the frequency of IgA-coated bacteria in the gut.

糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

Gut microbiota exert pleiotropic roles in human health and disease. Fecal microbiota transplantation (FMT) is an effective method to investigate the ...

生物学

Investigating the Alleviating Effects of Bacillus cereus Administration on Colitis through Gut Microbiota Modulation

Gut microbiota dysbiosis is thought to exert a role in the progression of colitis. However, the precise standards for probiotic administration in alleviating colitis remain undefined. Most analysis methods rely on limited diversity and abundance of gut microorganisms. Therefore, observational studies cannot establish causation. In this study, we applied antibiotic-induced pseudo-germ-free mice to investigate the role of gut microbiota in regulating the probiotic effects of Bacillus&#160;cereus (B. cereus)&#160;on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. This process allows for evaluating the bidirectional regulating effect of B. cereus&#160;supplementation on health and provides stable and reproducible results. Here, the detailed protocols for B. cereus cultivation, gavage operation, stool collection, and antibiotic clearance treatment on colitis mice are provided. The optimization methods are also applicable for other chronic inflammatory-associated disorders. The results showed that B. cereus administration decreased body weight loss, colon length shortening, disease activity index, and histopathological scores. However, treatment with antibiotics suppressed the positive effect of B. cereus on colitis. These results indicate that gut microbiota are needed for the alleviating effects of B. cereus on colitis. Therefore, exploring the beneficial effects of probiotics in this research is a promising approach for developing novel treatment strategies for alleviating the symptoms of chronic inflammatory-associated disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>腸内細菌叢の調節による大腸炎に対するセレウス菌投与の緩和効果の調査

Here, we present a protocol to establish the antibiotic-induced pseudo-germ-free dextran sulfate sodium-induced colitis mouse model to investigate the role of gut microbiota in regulating the positive effects of Bacillus cereus on colitis.

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

要約

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再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

安定したヒト様腸内微生物叢とヒト免疫系を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデル

強制経口投与を用いた新生児マウスにおけるプロバイオティクス研究

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価

マウス糞便分離と微生物叢移植

無菌マウスへのヒト糞便移植のためのBioexclusion IsoPositive Cage実験の調製と維持

糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

腸内細菌叢の調節による大腸炎に対するセレウス菌投与の緩和効果の調査

マウスにおける強制経口投与に続いてプロバイオティクス酵母の形質転換および消化管免疫組織から彼らの回復

要約

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安定したヒト様腸内微生物叢とヒト免疫系を特徴とする二重ヒト化BLTマウスモデル

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インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価

マウス糞便分離と微生物叢移植

無菌マウスへのヒト糞便移植のためのBioexclusion IsoPositive Cage実験の調製と維持

糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

糞便微生物叢移植と腸内IgA被覆細菌の有病率の検出

腸内細菌叢の調節による大腸炎に対する セレウス菌 投与の緩和効果の調査

腸内細菌叢の調節による大腸炎に対するセレウス菌投与の緩和効果の調査