저자는 표면 형광 현미경에 관한 기술적 조언 박사 레오 니드 볼코프 에릭 보우 차드을 감사드립니다. 경제적 지원 GB의 건강 연구 (보조금 # 1 MOP-93781)의 캐나다 연구소에 의해 자금 지원

동물 보호는 셔 브룩 대학 동물 관리 및 사용위원회에 따라이었다. 1. 튜브 준비 <ol><li> 셀 소팅 전날, 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 1-2 mL를 넣고 15 mL 및 50 mL의 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 관한 것이다. 중요한 단계 : 프로토콜에서 사용되는 모든 튜브가 코팅 된 것을 확인합니다. 참고 : FBS 코팅 튜브 벽에 달라 붙는 세균 세포를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 튜브를 균일하게 회전을 사용하여 코트 4 ° C에서 반전에 의해 O / N을 섞는다. </li><li> 다음 날, 경사에 의해 코팅 된 튜브에서 FBS를 제거합니다. <ol><li> * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다. <br/&gt; 참고 : 이전에 셀 또는 셀 정렬하는 동안 사용되는 다른 튜브의 오염의 손실을 초래할 수 정렬에 튜브에 잔류 FBS, </li><li> 라운드 5 ML의 폴리 프로필렌 정제 된 세포를 수집하는 데 사용 하단 튜브 FBS (약 100 ~ 200 μL)의 작은 잔류 볼륨을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 2. 휴대 준비 <ol><li> O를 CO 2 질식 이어 2 / 이소 플루 란 (당시 2 %로 유지 5 %에서 유도)를 사용하여 마취 한 남성 마우스를 희생. </li><li> 소비세 및 디 캡슐 모두 고환과 1.5 ML 튜브로 버퍼를 정렬 500 μL에 작은 가위로 말하다. </li><li> 그대로 100-1,000 μL 팁과 후 정액을 운반하는 최초의 잘린 100-1,000 μL 팁과 1.5 ML 튜브에 부드러운 상하 피펫으로 세관,과에서 세척 생식 세포. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 하나의 여과 공정에 의해 파편과 덩어리를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 이전에 여과 액을 수집iously 1 단계에서 FBS로 코팅. </li><li> 이전에 1 단계에서 코팅 된 15 ML 원뿔 튜브에 총 3 ㎖의 볼륨 및 전송 여과까지 버퍼를 정렬 한 번 필터를 씻으십시오. </li><li> 0.8 mM의 EDTA의 최종 농도를 얻도록 50 mM의 EDTA 세포 현탁액의 pH를 8 밀리 리터당 (3 ㎖, 48 μL)의 16 μL를 추가한다. </li><li> 생식 세포를 해결하려면, 천천히 우유 정지를 만들어 부드러운 교반 10ml를 피펫 (낮은 속도로 소용돌이)를 사용하여 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 3 볼륨을 추가합니다. 중요한 단계 : 에탄올을 천천히 첨가 세포 제제의 무결성을 유지하는 것이 중요하고 중요하다. 우리는 빠른 에탄올 첨가 효율 정렬 주요한 감소의 결과로 세포 용해를 유발한다는 지적. 3 ml의 세포 현탁액의 경우, 에탄올의 9 ㎖를 약 1 분으로 첨가되어야한다. </li><li> 반전에 의해 가끔 혼합 15 분 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> 원심 분리기 세포 5 분 800 XG에 서스펜션과 맑은 제거상층 액. </li><li> 부드럽게 정렬 버퍼 2 ㎖에 고정 생식 세포를 재현 탁. </li><li> SYTO16 DNA 염료 (DMSO 1 mM의 용액)의 4 μl를 추가하고 (빛으로부터 보호) 적어도 30 분 동안 품어. 주 : 최상의 정렬 결과는 쉽게 정자의 고도로 압축 된 핵에 도입되는 DNA 투과성 염료이므로 SYTO16를 사용하여 얻어진다. </li></ol> 3. 세포 분류기는 설정 참고 : 여기, 4 레이저 (405 nm의 - 보라색, 488 nm의 - 블루, 561 nm의 - 노란색 - 녹색, 633 nm의 - 빨강) 20 매개 변수 BDFACSAria III 세포 분류기 사용됩니다. BD FACSDiva 6.1.3 소프트웨어는 데이터를 시각화 및 분석하는 데 사용된다. 설정이 사용 분류기의 종류에 따라 달라질 수있다. <ol><li> 유체 역학 종료 절차 (소프트웨어의 &quot;사이토&quot;메뉴) 분류 이전시 칼집 유체로 70 % 에탄올을 실행하여 FACS 분류기를 소독. 소프트웨어의 도구 모음에서 &quot;사이토&quot;를 선택하고 &quot;유체 쉬를 선택. &quot;를 utdown 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다. </li><li> 제조 및 수정 및 오염물을 제거하기 위하여 0.22 μm의 필터로 1X PBS 필터. 탱크 내부의 상부에 용접선에 칼집 탱크를 채우기. </li><li> 소프트웨어를 시작하고 로그인합니다. 이전에 정렬에 적어도 30 분 동안 레이저를 따뜻하게 외과 분류기를 시작합니다. 유체 역학에서 에탄올을 세척하는 두 유체 시작 프로세스를 실행합니다. 소프트웨어의 도구 모음에서 &quot;사이토&quot;를 선택하고 &quot;유체 시작&quot;을 선택합니다. 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다. 참고 :이 정상 칼집 유체 (1X PBS)와 유체 공학을 복원합니다. </li><li> 정렬 블록과 증류수로 편향 판을 청소하고 철저하게 그들을 건조. 초음파 욕에서 2 분 동안 증류수 튜브에 넣고 100 ㎛ 노즐을 초음파 처리. 철저하게 노즐을 닦습니다. </li><li> 흐름 셀에 100 μm의 노즐을 삽입하고 12 노즐 잠금 레버를 시계 방향으로 돌립니다시간 위치. 20 PSI에 칼집 압력을 설정합니다. </li><li> 스트림의 전원을 켜고 (약 30) 주파수에 대한 목표 값을 얻기 위해 진폭을 조정, 1 (150의 주위에) 삭제하고 (12 정도) 갭과 안정적인 방울 breakoff 패턴을 (몇 위성 방울) 설정합니다. 감쇠를 끕니다. </li><li> 스트림이 직선이고 정렬 블록의 각도를 변경하여 폐기물 흡입기의 중심 안타 있는지 확인합니다. 참고 : 10 PSI에서 130 μm의 노즐도 테스트하고 명백한 차이는 발견되지 않았다. </li><li> 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 적색 -77.39, 37.33 및 -39.85 0으로 설정 레이저 지연. </li><li> 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 붉은 1.0, 0.75 및 0.96에 대한 1.14로 확장 설정 지역. </li><li> (소프트웨어의 &quot;사이드 스트림&quot;창에서) 테스트 정렬을 사용하여, 그 측면 스트림 패닝되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그들은 middl 충돌되도록 쪽 &quot;스트림&quot;윈도우에서, 각 사이드 스트림의 전압을 조정 슬라이더테스트 수집 튜브의 전자. 중앙 스트림 꽉 없으면 중앙 스트림을 제한하는 2 번째, 3 번째, 4 번째 드롭 설정을 조정. </li><li> 소프트웨어 ( &quot;사이토&quot;메뉴)에서 사이토 설치 및 추적 (CS &amp; T) 응용 프로그램을 시작합니다. </li><li> 제조업체의 지침을 사용하여 세포 계수기의 성능 특성 및 추적을 자동화하기 위해 350 μL 당 1 방울의 세포 계측기 설치 및 추적 구슬을 사용합니다. </li><li> CS &amp; T 응용 프로그램을 종료합니다. CS &amp; T 설정을 적용, 스트림 매개 변수는 여전히 안정적인 방울 breakoff 패턴을 할 수 있는지 확인하고 ( &quot;Breakoff 창&quot;에서) 제조 업체의 지침에 따라 스위트 스폿 (Sweet Spot) 버튼을 켭니다. </li><li> 형광 비드를 사용하는 드롭 지연 값을 최적화 (자재 표 참조). <ol><li> 홀더에 수집 튜브를 설치합니다. 정렬 블록 문을 엽니 다. &quot;사이드 스트림&quot;창에서 &quot;를 선택 한 후 전압을 켭니다시험 종류 &quot;및 서랍을 열고 수집 튜브에 액세스 할 수 있도록 흡인기 서랍 버튼을 클릭합니다. </li><li> 그들이 관의 중심으로 이동되도록 사이드 스트림을 최적화한다. 필요에 따라 값과 슬라이더를 조정합니다. </li><li> 정렬 블록 문을 닫고 중앙의 밝은 구슬 자리를 얻기 위해 마이크로 미터 다이얼을 조절해야합니다. 선택 취소 폐기물 서랍, 시험 종류 및 전압. 컬렉션 튜브를 제거합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 드롭 지연을 최적화. <ol><li> 간략하게, 비드 바이알을 격렬히 흔들 PBS 0.5 ㎖에 구슬 1 방울을 희석. </li><li> 제조업체의 지침을 사용하여 소프트웨어에서 사용할 수있는 드롭 지연 실험 템플릿을 사용하여 드롭 지연을 설정합니다. 또한, 드롭 지연을 설정하는 자동 드롭 지연 기능을 사용합니다. </li><li> 형광 비드 튜브를로드하고 임계 속도가 될 때까지 3,000 ~ 4,000 이벤트 / 초를 유량을 조정한다. 정렬 정밀도를 설정하려면 &quot;초기&quot;최종LY &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서 &quot;미세 조정&quot;에. 광학 필터를 선택하고 구슬을 정렬합니다. 100 %가 왼쪽으로 분류되어 있습니다 ~까지 드롭 지연을 조정합니다. 참고 :이 단계가 있는지 확인하는 것이 중요하다 측 스트림에 관심 종류의 세포. 구슬과 광학 필터는 100 % 액적 편차 부근 달성하는 데 사용된다. </li></ol></li></ol></li><li> 금융위원회 검출기 블록의 왼쪽 끝에 FSC 1.5 ND (중성 농도) 필터를 놓습니다. 2.00 μS에 창을 확장하고 ( &quot;사이토&quot;창에서 &quot;레이저&quot;탭에서) 1.00 FSC 영역 확장을 설정합니다. </li><li> 샘플 튜브를 넣기 전에, 응집을 피하기 위해 샘플 라인의 끝에 50 ㎛의 샘플 라인 필터를 배치했다. 이렇게하려면, &quot;사이토&quot;메뉴에서 &quot;샘플 필터 변경&quot;을 선택합니다. </li><li> 사이드 스트림 사이에서 패닝이없이 양호한 분리를 달성하고 polypropyle 달라 붙는 것을 방지하기 위해 세포를 샘플 유체의 조성물을 시험NE 튜브. <ol><li> 샘플 튜브를로드 편향 판을 켜고 서랍이 닫힌 &quot;테스트 정렬&quot;을 선택합니다. 분리가 너무 많이 패닝없이 발생하는 경우 측면 스트림 봐. 주 : 패닝 인해 샘플 버퍼에 높은 단백질 농도 쉽다. </li></ol></li><li> 외과 악기로 샘플 튜브를 넣습니다. 300 rpm의 교반과 샘플 4 ° C의 온도 샘플을 선택한다. &quot;취득 대시 보드&quot;에서 &quot;데이터를 획득&quot;을 선택합니다. </li><li> 필요한 경우 (3.0의 최대 유량) / 초 5000 이벤트 최대 적절한 이벤트 레이트를 달성하기 위해 시료를 희석. 분류 세포의 순도를 유지하도록 엄격하게 이러한 한계를 존중한다. </li><li> 분석 및 세포를 정렬 관심 인구 간섭없이 이물질을 제거하기 FSC 임계 값을 최적화한다. 대수 눈금에서 만들기 위해 30분의 530 필터와 광 승산기 튜브 (PMT)의 검출 전압을 조정반드시 전체 인구의 형광 신호는 스케일에 들어가고, 그 양의 모집단의 게이트 (도 1, 게이트 1). </li><li> 앞으로 캐터 영역 (FSC-A) / 사이드 캐터 지역 SYTO16 긍정적 인 인구 (SSC-A) 플롯을 생산하고 약 110 V 선형 규모에 FSC-을 조정하고, 약 150 V로 SSC- 매우 큰 세포와 세포 집합체를 제외하는 동안 로그 스케일의 모든 이벤트를 시각화합니다. </li><li> &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서 &quot;정렬 정밀 모드&quot;설정 &quot;4 방향 순도&quot;에 (수율 마스크 : 0, 순도 마스크 : 32, 위상 마스크 : 0). 연속 정렬에 대해 &quot;대상 이벤트&quot;메뉴에서 &quot;연속&quot;을 선택합니다. </li><li> ( &quot;정렬 레이아웃&quot;창에서) 튜브에 해당하는 필드에 정렬하는 인구를 추가합니다. 높은 중간 주파수와 끝에서 낮은 주파수를 가진 사람들과 장소의 인구. 정렬하는 동안 2500 (V)의 전압 판을 설정 샘플 모음 (T)를 유지얼음에 ubes. </li></ol> 4. 셀 정렬 <ol><li> 즉시 정렬 전에, 둥근​​ 바닥 튜브를 이전에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 50 μm의 필터를 사용하여 필터 세포. </li><li> 버퍼를 정렬 1-2 ㎖로 광범위하게 필터를 씻으십시오. </li><li> 그림 1에 설명 된 게이트 방식 다음 488 nm의 레이저를 갖추고 세포 분류기를 사용하여 정렬 고정 생식 세포는. 이전에 얼음 섹션 1에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브의 정제 분수를 수집합니다. <ol><li> FBS의 100 ~ 200 μL가 튜브 벽에 정렬 된 세포의 부착을 방지하기 위해 수집 관에 보관되어 있는지 확인합니다. </li><li> SYTO16의 농도가 정렬 기간 동안 형광 변동을 방지하기 위해 포화되어 있는지 확인합니다. 정렬 그래픽 알렉사 488 형석 파라미터 (DNA 염색) 세포에서 염색 강도의 더 이상의 변화가 없을 때 SYTO16은 포화된다. 필요한 경우, 1 μl를 추가정렬 튜브 SYTO16은 포화에 도달한다. </li><li> 알렉사 플 루어 488 대 사건 번호 : 다음 매개 변수를 표시하는 그래픽의 총 이벤트를 표시합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이, 게이트 1 DNA 양성 염색 세포를 선택한다. <ol><li> 매개 변수로 FSC-대 SSC-를 사용하여 그래픽에 게이트 1 표시 셀 <ol><li> 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 2 표시 셀. </li><li> 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 그래픽에 게이트 5 게이트 6 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 게이트 5 게이트 6 표시합니다. </li><li> 선택 spermiogenesis는 게이트 (5) 그래픽에 1-9 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는, 게이트 6 그래픽에 10-12 정자 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 디스플레이매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 1에서 세포 <ol><li> 그림 1에 켰을 때, 문 3 문 4 셀을 선택합니다. </li><li> 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 문 3 문 4 표시합니다. </li><li> 선택 spermiogenesis는 게이트 3 그래픽에 13 ~ 14 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는 게이트 4 그래픽에 15 ~ 16 정자 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

정자 세포는 항상 정액을 운반하는 상피 세포의 복잡성뿐만 아니라 체외 문화의 제한된 성공을 주어 연구에 도전하고있다. 수년에 걸쳐, 많은 접근법은 다양한 종에서 생식 세포가 개발되었다 정제한다. 퍼콜 또는 소 혈청 알부민 구배로 중력을 이용하여 침전 정화 기법은 일반적으로 그대로 생식 세포의 우수한 수율을 제공하지만, 이러한 감수 배체 세포 및 정자 10 일부 세포 유?...

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

마우스 정자의 분화는 그대로 게놈과 수컷 생식 기능의 제조를위한 하나의 중요한 과정이 다음 세대로 전달 될 것이다. 지금까지, 이러한 형태 학적 변화의 분자 연구는 후속 분석을위한 spermatid 분화 이러한 중요한 단계의 적절한 분리를 가능하게하는 방법의 결여에 의해 방해되어왔다. 유동 세포 계측법을 사용하여 이러한 세포의 적절한 게이트에서 이전 시도 때문에 염색질 리모델링을받은 정자의 DNA 형광의 독특한 증가로 어려웠을 수있다. 이러한 관찰에 기초하여, 우리는 에탄올로 고정 마우스 정자 네 개체군의 재현성 정화를 허용 방식 계측법 단순 흐름의 세부 사항을 제공하는, 각각의 핵 리모델링 과정에서 다른 상태를 나타내는. 인구 농축 단계 특정 마커와 형태 criterions에를 사용하여 확인할 수있다. 정자 정제 게놈과 proteom 위해 사용될 수있다IC는 분석한다.

게이팅 전략 유동 세포 계측법에 사용 그림 1은 네 개의 순수 spermatid 인구를 정렬 유동 세포 계측법에 사용되는 게이팅 전략을 나타냅니다. 간단히, 긍정적 인 DNA 염색과 세포 (알렉사 플 루어 488-A)를 처음 크기 대 granulosity (SSC-A)를 보여주는 도트 플롯에 spermiogenesis 1. 정자가 12이 선택 단계들 게이트 (문 2)와 선택 ...

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K 조회수.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>배아 발달을 연구하기 위한 Murine Round Spermatid Injection Procedure

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 라운드 Spermatid 주입

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

마우스 라운드 Spermatid 주입

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

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마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

마우스 라운드 Spermatid 주입

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