We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

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The authors have nothing to disclose.

전반적으로,이 프로토콜은 I) 파악 하였다 생리적 장갑차로 내피 세포를 조사하기위한 방법을 설명하고, II) &#39;평면 세포 APC 모델&#39;의 새로운 유형으로. 전자와 관련하여, 이는 점차 적응 면역 반응을 형성하는데 16-18 (조혈 장갑차에 비해, IE)를 둘레 비 조혈 (또는 &#39;기질&#39;) 장갑차 중요한, 비 중복 역할을하는 것으로 인식되고있다. 이러한 &#39;세미 프로&#39;장갑차, 혈관과 (크게 전문 장갑차를 능가) 림프 내피 세포 중 최고의 16-18 평가 중입니다. 그러나, 신호 이벤트의 세부 사항과 결합 면역 시냅스는 주로 uninvestigated 남아있다. 여기에 설명 된 방법은이 새로운 영역에 대한 이해를 증진하기위한 기초를 제공한다. 예를 들어, 별개의 adaptiv을 나타내는 것으로 공지되어 다른 조직으로부터 내피 형성 ISS의 연구에 이러한 방법을 적용전자 면역 기능 (예를 들어, 간, 림프 내피 세포)는 특히 유익 할 수있다. 현저하게,이 방법은 적응성 면역 반응의 기본 메커니즘을 심문하는 능력을 향상시키기 위해 전문 APC 장갑차 인공 기판 모델 사이의 간극을 메우는 것을 돕는다. 평면 (즉, 지질 이중층, 항체 코팅 유리) APC 기판 반면, 이러한 모델은 본질적으로 제한되어있다 (많은 중요한 통찰력 7,11-14으로 이어질했다) 최적의 영상을 제공합니다. 대안 적으로, 세포 - 세포 생리적 사형 역학의 세부 사항은 여기까지 깊이 방향 관련 이미징 문제 8-10 의해 가려되었다. 현재의 접근법에 설치된 촬상 기능 의적 달리 탐지 입체 구조와 세포 내 생리적 APC-T 세포의 빠른 인터페이스를 공개 리모델링이 장애물을 극복. 항원 signalin의 새로운 이해에 대한 이러한 제안 가능성지. 예를 들면, T 세포는, (예를 들어,도 2d,도 3) TCR 액틴 및 시그널링 분자가 풍부 ILPs을 형성하는 감사 이러한 가능성 마이크로 클러스터 시그널링 평면 TCR 3 차원 대향 부를 관찰 생리적를 나타낸다는 것을 시사 인공 APC는 6,7,12-14,29-31 기판들. 이것은 생리적 설정에서 림프구가 증폭 &#39;signalosome&#39; 같은 특성을 가진 개별 세포 내&#39;3D-반응 볼륨 &#39;로 ILPs을 사용하고 중요한 분자 / 활동 (32, 33)을 집중하여 신호 유지 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 광경에 상당한 역학적 입력 (즉, 세포 - 세포 힘 부여)의 존재에 대해 APC ILP 돌기는 촬상으로부터 추론 될 수있는 경우. 기계적인 힘이 점점 항원 신호의 중요한 촉진제로 볼대로 정확하게 어떻게 그런 힘이있는 동안은, 사소하다적하 목록은 14,34-37 확실하지 않다. 전문 장갑차을위한 합리적인 대리로이 모델의 전반적인 관련성이 비슷한 ILP의 배열이 유사한 이미징 방법이 사용될 때 (B 세포와 조금 적게)의 EC 및 DC에서 형성된 시냅스에서 볼 수 있다는 우리의 직접 시연에 의해 지원됩니다 (예 : 같은 형광 메이커 및 IS 평면 방향 평면 19)의 제어를 사용. 그럼에도 불구하고 전문 APC 막 표면 대 EC의 상대적 생체 역학적 특성은 알 수 있고이 파라미터의 차이가 토폴로지 및 항원 반응의 세부 사항에 영향을 미칠 수 있음을 고려해야한다. 본원에 기재된 방법의 핵심은 그 해상도 혜택을 강하게 관련된다. 이는 다시 형광 신호의 강도에 매우 관련이있다. 따라서, fluores의 형질과 염색을 최적화에 특별한주의를 지불하는 것이 중요합니다센트 기자 촬상 파라미터 / 기술 (예를 들면, 노출 시간, 포커스 등). 전자와 관련하여, 여기에 설명 된 라이브 셀 연구 프로토콜은, 일반 막 실시간으로 T 세포 APC 계면에서 위상 변화 (예를 들면,도 2, 영화 1보고 세포질 마커 형질 제한된다 2). 또한,이 프로토콜은 쉽게 내피 (에 부수적으로 도입 / 영상 추가 기자보다 정교한 분석을 수정할 수 있습니다 예를 들어, 형광 단백질 태그 MHCI / II 및 신호 및 생체 역학에 대한 접착, 공동 자극과 공동 억제 분자 및 바이오 센서 역학). 불행하게도, 그러나, 일반적인 제한은 림프구 형질 악명이 곤란하다는 것이다. 이 형광 단백질 라이브 세포 이미징을위한 T 세포 (예를 들어, TCR에 태그, PKC-Q 등)의 편리한 사용을 방해한다. 동안현재의 프로토콜은 SAG (널리 사용되는 모델)을 통해 인간의 이펙터 / 메모리 CD4 +받은 Th1 형 림프구의 활성화를 포함, 훨씬 광범위한 가능성은 존재한다. 이전에 19, 20를 알 수 있듯이이 방법은 다른 CD4 + 집합 및 CD8 + 림프구 살해 반응의 활성화의 응답으로 다른 설정의 넓은 범위에 쉽게 적응할 수있다. 기존 TCR-형질 전환 균주에서 림프구 및 내피 세포의 분리를 통해이 방법은 특정 펩타이드 항원 (19, 20)에 대한 반응을 연구하기 위해도 쉽게 적응할 수있다. 마지막으로, 현재의 접근 방식은 효과기 / 메모리 T 세포의 검사에 한정된다. 그러나, 필수 공동 자극 분자 (CD80 / 86, 일반적으로 내피 세포에서 발현되지 않음)이 모델의 순진 세포 프라이밍 역학 연구를 위해 허용 할 수 있습니다와 내피 세포의 형질 전환.

T 림프구는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 효율적으로 결합 된 펩티드 항원은 (Ag)을 인식하는 능력을 특징으로 적응 면역계의 분기 아르는 T 세포 수용체 (TCR도 1)를 통해 분자. 나이브 림프구 구조적 마이그레이션 &#39;전문의 Ag 제시 세포&#39;(장갑차; 예 : 수지상 세포)을 주사 메모리 / 효과기 T 세포가 효과적으로 말초 조직 내의 장갑차 및 잠재 표적 세포의 매우 넓은 범위를 조사 할 필요가 있지만, 림프절 내. APC에 동족의 Ag의 최초 인식 다음 분에서 자신의 마이그레이션을 체포하고 전문 친밀한 세포 - 세포 인터페이스라고 &#39;면역 시냅스&#39;를 형성하기 시작 림프구 (IS). 지속 (즉, 30 ~ 60 분) 접점이 증폭 2-7 신호를 유지해야한다. 새로운 연구는 IS 내에, 그것이 연속 형성하고 신속한 R이라고 파악강도와 면역 반응 2-7 결과의 품질을 결정 (즉, MHC / AG-TCR, F - 굴지, 접착 및 신호 분자를 포함) 이산 서브 셀룰러 신호 마이크로 클러스터의 emodeling. 그러나, 이러한 방법의 세부 사항 및 동적 규제기구는 불완전 8,9 이해된다. 이것은 근본적으로 필요한 시공간 촬상 제한 APC 표면의 불규칙한 토폴로지 및 세포 - 세포 상호 작용의 저조한 제어 평면 배향, 이슈와 관련된 기술적 인 과제는 크게 기인하는 80-10 (Figure1A)에 접근한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> 이미징 면역 시냅스 역학 그림 1. 생리적 평면 셀 APC 모델은. 회로도는 T 세포와 professio 사이의 면역 학적 시냅스의 전통적인 이미지를 보여<html> NAL APC (A)와 T 세포와이 신규 한 내피 평면 APC 모델 (C)에 비해 전통적인 평면 지질 이중층 APC 모델 (B). ,, 극적으로 즉, 공간 (Z 영상 플레인의 해상도 ~ 1 ㎛) 및 시간을 (타협, 전문 장갑차는 생리적 면역 시냅스를 제공하지만 (해상도 ~ 0.2 μm의 최적의 XY 영상 평면에 대한 즉,) 제대로 지향 세포 - 세포 인터페이스를 제공 필요에 의한 반복적으로 영상의 해상도) 모든 Z 영상면을 스캔합니다. 이중층 모델 시공간 최적 이미징 해상도를 제공 평면 위상을 가질뿐만 아니라, 고도의 비 - 생리 학적 및 강성 간략화된다. 이것은 내피 세포 모델 생리적 환경에서 최적의 공간 및 시간 해상도 이미징을 제공하는 APC의 고전 생리적 기판과 지질 이중층의 평면 위상을 결합한다.M / 파일 / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이전의 연구는 부분적으로 최적의 XY 촬상에 평행 한 평면으로 T 세포의 활성화 표면 고정을 통해, 즉, 최적의 시공간 해상도 (제공 현상 평면 기판 모델 (즉, 지질 이중층과 항체 - 코팅 된면)에 의해 이러한 장애물을 회피했다 평면) 11 ~ 15 (그림 1B). 이러한 모델은 동적 액틴 / TCR 신호 마이크로 클러스터 7,11-14의 발견을 포함하여 T 세포에 항원 신호를 제어하는 분자 / 세포 내 역학에 중요한 통찰력을 촉진하고있다. 그러나, 이러한 모델은 본질적으로 과도하게 단순화되고,뿐만 아니라 강성 (도 1b) (3 차원 기하학적 특징의 개발 / 연구를 배제). 따라서, PHY에 그러한 결과를 연관시키는 방법 불확실siologic 세포 - 세포 면역 감시. 여전히 파악 하였다 있지만, 혈관과 림프 내피 세포가 큰로서 등장하고있다 (즉, ~ 1,000 배의 모든 전문 장갑차보다 숫자에 큰) &#39;세미 프로&#39;장갑차 16-18의 주변 함. (예를 들어, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1,하지만 CD80 및 CD86)이 세포는 MHC-I-, MHC-II-공동 자극 분자의 군중을 표현하고 전략적입니다 그들은 전문적인 감시 기능 16-18를 제공 혈액 조직 인터페이스에 위치. 이전의 연구에서는 내피 세포가 효율적으로 효과기 / 메모리 있지만 나이브 아니라 T 세포 19-25 다시 자극 할 수 있음을 입증 하였다. 따라서, 내피 세포는 T 세포 활성화, 분화, 메모리 및 공차 16,17,26 로컬 영향력 말초 조직 내의 적응성 면역 반응의 이펙터 단계에 고유 APC의 역할을하는 것으로 보인다. 크리시험 관내에서 배양 학적 때, 내피 세포는 사실상 평면 세포 표면을 형성하고 (형광 단백질 기자 예) 형질 용이하다. 이러한 기능은 세포 - 세포 상호 작용 19,27 동안 위상 역학의 높은 시공간 해상도 이미징에 이상적입니다. 따라서 내피 세포는 응답 (그림 1C) (19, 20)를 항원 인식을 운전하고 조절하는 분자 / 세포 내 리모델링 메커니즘 연구를위한 뚜렷하게 적합 생리적 &#39;평면 세포 APC&#39;모델이 될 수 있습니다. 이전 접착 및 transendothelial 마이그레이션 27시 백혈구 - 내피 상호 작용의 세부 사항을 공부 (세포막과 세포질의 형광 단백질 업체들과 내피 세포의 형질 전환 포함) 보완 이미징 기술을 설립, 백혈구가 적극적으로 동적으로 내피 세포의 표면을 검사 것으로 나타났다 삽입서브 마이크론 규모의 D 후퇴는 굴지 풍부한 원통형 돌기 (~ 직경과 깊이 200 ~ 나노 미터)는 invadosome 형 돌기 (즉, &#39;ILPs&#39;) 27, 28라고합니다. 이 촬상 방법은 상기보고 (19, 20)와 같은 T 세포 - 내피 면역 시냅스 높은 시공간 해상도의 영상화를위한 첫번째 방법을 개발하기 위해 내피 APC 기능을 활용 여기서는 더 설명하는 프로토콜들의 생성에 따라 확대되었다. 이 신규 한 평면 셀룰러 APC 모델로부터 유도 중앙 결과는 T 세포의 Ag ILPs 초기 탐지를 촉진 및 후속 시그널링을 모두 유지하는 기능을한다는 것이다. 실제로, (안정화 및 칼슘 플럭스 초기에 대응하여 발생한되었다), TCR 및 활성 신호 등 PKC-Q, ZAP-70, 포스 및 HS1의 암시 분자 쇼 농축 여러 ILPs의 배열. 따라서 ILPs는 TCR 시그널링에 마이크로 입체 생리적 등가를 나타내는 것평면 이중층 모델에서 본 클러스터. 이 방법은, 따라서 민감하게 밝혀 / 보고서 분자 및 건축 (및 생체 역학 묵시적) 역학 그렇지 않으면 감지되지. 본원에 기재된 방법은 적응성 면역 반응의 기본 메커니즘을 심문하는 능력을 향상시키기 위해 전문 APC 인공 APC 기판 모델 사이의 갭을 ​​가교에 유용 할 것이다. 여기서 포커스는 CD4 +받은 Th1 형 이펙터 / 메모리 셀의 활성화에 있지만 후술하는 바와 같이,이 기본 방법은 용이하게, T 세포 유형 및 Ag로 광범위한 연구를 수정할 수있다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer stretch latex free tourniquet</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD alcohol swabs</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Bring to RT before use</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>staphylococcal enterotoxin B</td><td>Toxin Technology</td><td>BT202RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>toxic shock syndrome toxin 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Stock solution 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Stock solution 10x, dilute in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Required Kit for step 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>phenol Red-free HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Human Serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Stock solution 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toxic, use fumehood</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&amp;nbsp;</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Plates 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T plates</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Disposable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ICAM1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&amp;reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Class II antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>phosphotyrosine (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Required electroporator for step 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Forma STRCYCLE 37 &amp;deg;C, 5% CO2 Cell culture Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath model 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

an endothelial planar cell model for imaging immunological synapse dynamics

적응성 면역 T 세포와 항원 제시 세포 ( &#39;장갑차&#39;) 사이의 동적 인 상호 작용에 의해 조절 &#39;면역 시냅스&#39;라 칭한다. 이러한 친밀한 세포 - 세포 인터페이스 내에서 MHC / AG-TCR, F - 굴지, 접착의 개별 하위 세포 클러스터 및 신호 분자가 형성 빠르게 개조. 이러한 역학은 중요한 효율성과 개발 면역 반응의 품질 모두의 결정 때문에 병리학 적 면역 대 보호의 것으로 생각된다. 생리적 장갑차와 면역 시냅스의 현재 이해는 얻을 수있는 영상 해상도의 무능력에 의해 제한된다. 인공 기판 모델 (예를 들면, 평면 지질 이중층)이 우수한 해상도를 제공하며 매우 유용한 도구되었을지라도, 이들은 본래 비 생리적 및 과도하게 단순화된다. 혈관과 림프 내피 세포는 &#39;반 직업의 중요한 말초 조직 (또는 기질) 구획으로 등장알 장갑차 &#39;. (전문 장갑차의 분자 기계의 대부분을 표현할)이 거의 평탄한 장갑차 세포 표면을 형성하는 독특한 특징을 갖고 (형광성 단백질 리포터로, 예) 형질 용이하다. 여기서 기본 접근법을 설명한다 신규하고 개선 된 이미징 및 항원 기본적인 시그널링 프로세스 심문 생리적 &#39;평면 셀룰러 APC 모델&#39;내피 세포 등을 구현한다.

내피 세포를 사용하고 생리적 복잡성 및 전문 장갑차의 변형성을 가진 평면 지질 이중층 모델의 해상도의 이점을 조합 한 새로운 촬상 방식은 (도 1)을 개발 하였다. (2)이 관찰] 이주 칼슘 플럭스 및 위상 역학의 예를 제공 도표 접근. 내피에 처짐의 부재 하에서, SAG 특정 CD4 +받은 Th1 림프구 빠르게 편광 확산 칼슘 플럭 싱없이 내피 표면 (도 2a)을 통해 측 방향으로 이동 (미도시). ~ 5 ~ 10 분 이내에 이러한 림프구는 내피를 통해 윤회를 시작합니다. 내피 위에 SAG로드의 존재에서, &#39;기름에 튀긴 된 계란&#39;토폴로지 대칭 확산 림프구 (즉, 30 ~ 60 분) 세포 내 칼슘 플럭스 (그림 2B, 영화 1) 유지를 개시 할들이 전시되는 시간 동안을거의 또는 전혀 마이그레이션 (그림 2C). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig2.jpg" /> T 세포 활성화 및 마이그레이션 내피 장갑차의 면역 시냅스 토폴로지. (A)의 패널도 2 라이브 셀 분석 처짐의 유무에 내피 세포에 T 세포 이동의 시계열 화상의 예를 나타낸다. 상단 패널은 DIC의 이미지를 보여줍니다. 마이그레이션하는 T 세포의 초기 위치가 적색 점선으로 표시된다. 낮은 패널은 마이그레이션 T 세포의에 의해 내피 세포에 형성 함입을 보여줍니다. 화살표 내피 APC면에 대하여 &#39;invadosome 형 돌기&#39;(ILPs) (D 참조)의 T 세포 생성의 결과로 형성되는 막 - YFP 형광 과도 링 (~ 0.5 ㎛의 직경)의 형성을 나타낸다. (B)는 처짐로드 내피 (왼쪽의 존재하에 유사한 일련의 예를 도시 한 참고영화 1)과 칼슘 농도 (우)의 동적 변화를 정량적으로 추적 대응. 화살표는 높은 칼슘 플럭스 (II)과 상관 칼슘 플럭스 (I)의 개시와 관련이 초기 ILPs 형성 복수 ILPs 후속 안정화를 나타낸다. B와 같은 (C) 실험 추적 분석을 셀 하였다. 10 분 (붉은 흔적)의 지속 시간이 남아 쇼 담당자 T 세포 마이그레이션 경로에 DIC 이미지. 오른쪽 그래프는 부재 및 SAG의 존재하에 계산 된 이동 속도를 보여줍니다. (D) (19에서 수정) 면역 시냅스 토폴로지의 동적 분석. (I) 막 대상-YFP 및 가용성 세포질 RFP 구성된 민감한 내피 세포 / APC &#39;토폴로지 기자 시스템&#39;을 보여 회로도. 실린더 모양의 함입 생성 내피 세포 표면에 돌출 굴지 매개 ILP G (휴대 발 인쇄의 유형은 &#39;PODO-인쇄&#39;라고합니다)막 YFP 형광의 고리로 표시 급격하게 구부러진 막에 iving 상승 (즉, en 얼굴 볼 실린더의 벽). 이러한 궤적에서 세포질 변위 및 제외는 세포질 RFP의 어두운 원을 나타납니다. DIC 및 (ii) SAG의 존재와 같은 분석의 예를 보여 형광 이미지 (또한 영화 2에 해당 참조). 단일 초기 PODO-인쇄 / ILP는&gt; (20)가 15 분에 걸쳐 ILPs 안정화의 배열로 개발하고 있습니다. 막 - YFP의 고리는 제외 세포질 RFP의 영역과 중첩함으로써 15 분 (III)에서 파란색 상자 번의 PODO 인쇄 / ILP 고해상도보기를 도시한다. 점선 (IV)는 형광 강도의 정량적 라인 스캔 분석을 보여줍니다. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이전에 설립 된 바와 같이, 림프구는 액티브엘리 프로브는 확장 액틴과 HS1 (cortactin 상동)에 의한 내피 세포의 표면이 풍성하고 WASp- 및 SRC 의존 돌기 &#39;invadosome 형 돌기라고; (ILPs 각 ~ 직경 깊이 0.5 μm의) 27,28. 멤브레인 타겟 형광 단백질 (FP)의 형질 전환 세포는 세포 표면에서 세포 내 위상 역학에 매우 민감한 리포터를 제공하기 위해 설명되었다. 이러한 방식으로, 형광 막 FP의 밝은 링이 T 세포 ILPs 돌출부 결과 T 세포 - 내피 세포 상호 작용하는 동안 굽힘 멤브레인을 가리킨다 나타났다. 그것은 여기에 표시되며, 이전의 연구 19, 20,에 그 작은 빠르게 ILPs 양식과 매출의 클러스터 (즉, 10 ~ 30 초 ~의 수명) SAG의 부재에서 내피 세포에 대한 T 세포의 측면 이동하는 동안 (그림 2A 반면, ), 그들은 매우 안정 (즉, ~ 30 분의 수명)과 존재의 조밀 한 배열로 축적 될SAG의 (그림 2B). 또한, 칼슘 ILPs 개시 동력학 분석은 ILPs 칼슘 시그널링 선행 보여 이들이 MHC-II /의 Ag 인식 처리 (도 2Bii) 돕기 제안 ( &#39;타임 옵셋&#39;). 또한 ILPs 어레이 최대 칼슘 플럭스 (도 2Bii)에 상응 형성 안정화. 아이디어는 막 형광의 고리 내피 장갑차에 이산 함입 명소를 구동하는 T 세포 돌기에 대응, 모든 경우에이 반지는 가용성을 DsRed에 의해보고 된 난민 / 제외 세포질의 영역 (과 공간과 역학적으로 연관 데모에 의해 확인된다 그림 2D 및 영화 2). 그림 3은 고정 된 엔드 포인트 공 초점 영상 검사의 예를 제공합니다. T 세포와 내피 장갑차 사이에 형성 저하, ISS의 존재 공동 배양 10 분 후 나는, 고정에 의해 촬영되었다mmuno 형광 염색 및 공 초점 현미경. 이러한 연구는 ILPs 특히 관련 ISS 내 중요한 분자의 세포 내 분포 역학의 분석 및 신호 활동을 제공합니다. 특히, 세포 골격 / 골격 레귤레이터 (액틴, HS1도 3A), 항원 제시 / 인식 (CD3 / MHC-II도 3B) 부착 (ICAM-1, LFA-1, talin도 3C) 및 항원 신호 (PKC -Q도 3D는) PODO-인쇄 / ILP에서 협력 강화되어야 볼 수 있습니다. 촛점 직렬 섹션 Z-스택 디지털 재구성, T 세포 - 내피 내피는 APC 표면으로 돌출 T 세포 ILP 불거 이산 3 차원 구조 (도 3Aii, C1 내지 가진다고도 2D에 도시 된 것과 상보적인 증거를 제공한다 III, D). (그림 3Civ). <img alt="그림 3" src= &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53288 / 53288fig3.jpg&quot;/&gt; T 세포 내피 세포 면역 시냅스의 분자 분포 역학 그림 3. 고정 샘플 분석. 림프구는 30 분 동안 SAG로드 내피 세포에 배양 고정 및 염색 하였다. 표시 패널에서 내피 세포는 막 YFP 또는 -DsRed을 표현하기 위해 사전에 형질 감염시켰다. (A) 대표 화상 표시 액틴 (I) 및 HS1 (cortactin 동족체; ⅱ) 내피 형광 막 YFP 고리 (즉, &#39;의 중심과 연관 마이크로 클러스터의 면역 시냅스의 주변에 공동 농후 PODO-지문 &#39;; T 세포 ILPs이 PODO-인쇄 모양에 대한 책임이 있음을 확인)도 2D를 참조하십시오. 사이드 뷰 (II. 90 투사) ILPs이 (19에서 수정) Z 영상 평면에서 3 차원 돌출부를 나타낸다는 것을 보여줍니다. (B) TCR T 세포 (I) 및 endoth 대표 엔리치elial MHC-II (ii)는 면역 시냅스 내에서, ILP / PODO-인쇄에 분리 된 세포 내 파티션을 보여줍니다. 각각 IS의 PODO - 인쇄 및 ILP에서 ICAM-1과 LFA-1 (C) (I) 대표 공동 농축. (i)는 IS의 공 초점 섹션의 3 차원 디지털 복원은 60 ° (상단 패널)와 90도 (; 낮은 패널 직교보기) 회전 표시합니다. (II)의 얼굴 엔 IS의 확대보기를 표시합니다. (ⅲ) (ⅱ) ((19)로부터 개질)의 박스 영역의 수직 단면도이다. 에 talin (integtin / 액틴 링커 단백질)과 액틴의 (IV) 대표 공동 농축은 ILPs입니다. (D)에서 액틴과 TCR 신호 분자 PKC-Q의 대표 공동 농축은 ILPs이다. 각 패널에는 실내 얼굴보기 (왼쪽 아래 부분)과 두 가지 직교 뷰 (90 ° 투사)를 보여줍니다. 맨 왼쪽과 오른쪽 패널들이, 각각의 이웃 패널의 복제되어 사용, 무지개 fluorescenc를 사용하여 예상(19에서 수정) 전자 강도 규모. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie1.mov">영화 1 :. T 세포 칼슘 신호 전달의 라이브 셀 동적 이미징 및 면역 학적 시냅스 토폴로지</a> 내피 세포가 막 YFP을 표현하고 2B 그림에 해당하는 처지로드와 상호 작용 Fura2로드 CD4 +받은 Th1 림프구의 시간 경과 라이브 셀 이미징. T 세포에; 왼쪽 패널은 세포 내 칼슘 농도 (따뜻한 색상 높은 칼슘 시원한 색상, 저 칼슘 무지개)를 보여줍니다. 내피 APC의 표면에 마우스 오른쪽 패널에 표시 막 YFP 형광. 림프구가 확산하고 ILP 형성 시작합니다 볼 수 있습니다 (MEM-YFP 채널에서 형광 링을 통해 볼 때, 즉, &#39;PODO-인쇄&#39;도 2Bi 참조) 유지 (30 ~ 60 분) 세포 내 칼슘 플럭스의 유도에 의해, 다음을, TCR / 액틴과 유사한 ILPs / PODO-인쇄 주변 배열의 형성에 상응 발생하는 평면 이중층 APC 모델 (그림 2Bii 참조)에서 볼 수 있습니다 그 &#39;마이크로 클러스터 신호&#39;. 프레임 사이의 간격은 20 초입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie1_finale_02_18_15.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie2.mov">영화 2 : 면역 학적 시냅스 토폴로지 VI의 라이브 셀 동적 영상</a>내피와 상호 작용하는 내피 장갑차. CD4 +받은 Th1 림프구의 시간 경과 라이브 셀 이미징 (DIC, 왼쪽)의 형광 기자에 해당하는 막 YFP (녹색) 및 가용성 세포질을 DsRed (적색)의 공동 발현 및 SAG로드 그림 2D. 오른쪽 패널은 DIC, 막과 세포질 신호의 병합을 보여줍니다. 막과 세포질 형광의 결합 된 신호는 민감 다수의 형성과 개조를보고 ~ ILP 돌기로 프로빙 배열 T 세포에서 발생 0.2-1 μm의 규모면 함입 (PODO-인쇄). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie2_finale_02_18_15.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K 조회수.  Harvard Medical School - BIDMC. Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

비디오: An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

연구

면역학 및 감염병학

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

생물학

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

신경과학

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

인간 면역학적 시냅스 이미징

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...