이 프로토콜은 Vivo 2-Photon 현미경 검사법을 사용하여 장기간 동일한 뇌 위치에서 세포 역학의 반복적인 시각화를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술의 장점은, CNS의 다른 세포 유형 사이의 배열, 형태 학 및 물리적 상호 작용을 포함하여 뇌의 세포 요소의 장기적인 변화를 이미지 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 역학 및 뇌 가소성 및 신경 변성 동안 형태학적 변화를 유도하는 데 특히 유용 할 수 있습니다.
4~10주 된 청소년 또는 젊은 성인, CX3CR1 GFP 이종고테 마우스를 준비하여 17~25그램의 무게를 가지며 두개골 창 이식을 시작하십시오. 마우스를 마취한 후 머리 트리머를 사용하여 머리, 귀 사이, 눈 높이에서 목 부위 의 상단에 머리카락을 면도합니다. 마우스를 스테레오전술 수술 스테이션, 코 콘으로 이동하고 이어 바를 사용하여 머리를 안정시합니다.
시술 내내 가열 패드에서 마우스를 유지합니다. 기름 연고로 두 눈을 윤활한 다음 0.25 %의 부피 바카인 100 마이크로 리터와 밀리리터 덱사메타손 당 4 밀리그램의 100 마이크로 리터를 절개 부위에 피하합니다. 진행하기 전에 적어도 5 분 기다립니다.
면도된 머리를 피했고, 베타딘의 세 번갈아 면봉과 70%의 알코올을 사용했습니다. 그런 다음 수술 블레이드 또는 가위로 중간 선 두피 절개를합니다. 두개골 영역의 뒤쪽에서 귀 사이, 눈 사이의 정면 영역으로 확장됩니다.
남은 피부를 잘라 두개골을 드러냅니다. 과산화수소 3%로 두피와 기본 두개골 사이에 위치한 결합 조직을 출혈시키고, 스테레오전술 좌표로 이미지되는 뇌 영역을 국소화합니다. 치과 드릴 비트를 사용하여 두개골에 약 4 밀리미터의 원형 개구부를 드릴.
드릴링 하는 동안, 정기적으로 뇌를 냉각 하는 멸균 식염수와 면 봉면으로 두개골을 축 하. 뼈 파편을 제거하고 두개골 뼈를 부드럽게합니다. 완료되면 뾰족한 집게로 두개골의 이 부분을 조심스럽게 제거하십시오.
두개골을 제거 한 후, 조심스럽게 두개골 에 식염수로 축화 작은 커버 유리를 배치합니다. 멸균 닦아 여분의 식염수를 건조. 뾰족한 어플리케이터를 사용하여 창 주변에 시아노아크라일트 접착제를 바르고 뇌와 두개골에 부착할 수 있습니다.
프라이머 접착제를 두개골의 나머지 부분에 바르고 20~40초 동안 경화조명으로 치료합니다. 최종 접착제로 창 주위에 우물을 만들고 경화 조명으로 20~40초 동안 치료합니다. 작은 머리 판을 두개골에 접고, 금단반구, 두개골 절제술, 프라이머 접착제, 그리고 최종 접착제로 20~40초 동안 모두 경화시세요.
마우스가 깨어난 후, 수술 후 진통으로 buprenorphine SR의 피하 복용량 을 주입, 이는 72 시간 동안 충분할 것이다. 건강한 회복을 위해 여분의 소금 음식으로 마우스를 부활시보시기 바랍니다. 이미징은 이식 수술 후 2주 일찍 수행될 수 있습니다.
나사를 사용하여 2광자 현미경 단계에 헤드 플레이트를 장착하면 가열 판이 있는 섭씨 35도에서 유지관리해야 합니다. 로다민 B.와 같은 혈관 염료 100마이크로리터로 마우스를 피하하여 면봉으로 두개골 창 표면을 부드럽게 청소하고 70%에탄올에 담근다. 창에 물이나 식염수 몇 방울을 넣고 목표 렌즈를 용액으로 낮춥춥니까.
목적이 낮아짐에 따라 레이저가 꺼져 있는지 확인하고, 접피스를 통해 보면서 주요 혈관 랜드 마크를 나타내는 코스 맵을 그립니다. 이 도면을 사용하여 2광자 이미징 중 특정 영역을 식별합니다. 2광자 이미징을 사용하여 형광 세포와 혈관의 이미지를 수집합니다.
이미징 매개 변수에 대한 텍스트 원고를 참조하고, 적절한 좌표로 주의 깊게 메모하여 후속 이미징을 위해 정확한 영역을 다시 검토할 수 있도록 하십시오. 이 초기 이미징 세션에서 여러 가지 시야와 같이 그립니다. 후속 세션 동안 영역을 다시 이미징하기 위해 얻은 메모와 이미지를 사용합니다.
이 프로토콜은 대만 YFP-H 라인 마우스에서 Vivo에서 마이크로글리아 역학을 시각화하는 데 사용되었습니다. 특정 원더라이트는 뇌 영역의 미세 매핑을위한 안정적인 랜드 마크 역할을했다. 수상자는 안정적이지만, 일부 마이크로글리아는 매일 움직입니다.
단일 형질전환 CX3CR1/GFP 마우스는 최대 8주 동안 마이크로글리아를 따르는 데 사용되었습니다. 로다민 B의 주사, 각 이미징 세션 동안, 혈관을 라벨에 사용되었다. 혈관은 안정적으로 고정되어 있지만 마이크로글리아는 동적입니다.
CX3CR1/GFP 마우스는 심한 발작 전후에 마이크로글리아를 따르는 데 사용되었습니다. 혈관 침대 구조는 유지되었지만, 마이크로글리아 세포 네트워크, 위치 풍경은 일시적이었다. 더 큰 변화는 발작의 24 48 시간 안에 관찰되었습니다.
이중 형질전환 CX3CR1/GFP 및 NG2DS-Red 마우스는, 마이크로글리아를 추적하는 데 사용되었고, NG2에서 양성 세포에 비보. 혈관을 표시하지 않고, 마이크로글리아뿐만 아니라 혈관 관련 기생충, 및 올리고드엔드로시테 전구체 세포, 또는 OpC가 확인되었다. 기생충은 혈관 벽을 따라 가는 길쭉한 프로세스가 있고, OpCs는 전형적으로 혈관에서 멀리, 두뇌 parenchyma에 있는 더 큰 세포 바디를 보여줍니다.
로다민 B가 사용되었을 때, 기생충의 밝은 형광은 화상 진찰 도중 유사한 흥분에도 불구하고, 발광 로다민의 희미한 형광에서 구별될 수 있었습니다. 매일 화상 진찰은 기생충이 안정적으로 위치했다는 것을 보여주었습니다, OpCs와 microglia는 역동적인 동안. 시각화되는 영역을 주의 깊게 관찰하고, 가능한 한 정확한 대표맵을 그리며, 시작점에 대해 다른 위치에 도달하기 위해 취한 단계를 나타내는 것이 중요합니다.
후속 이미징 세션에서는 이러한 단계, 손으로 그린 맵 및 이전에 촬영한 이미지가 동일한 위치를 반복적으로 식별하는 데 중요합니다. 이 기술은 연구원이 신경 교반작용을 해명하는 것을 허용했습니다, 신경 면역 상호 작용, 및 건강과 병리학 둘 다에 있는 연장된 기간의 신경 세포 역학.
