저자는이 작품을 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 감사합니다.

미디어 및 문화 1. 준비 <ol><li> LB + 앰프를 들어 루리아 - 베르 타니 배지 (LB) 500 ml를 30 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브를 사용하여 멸균 준비한다. 필요한까지 암피실린 부록 4 ° C에서 저장 암피실린 100 ㎍ / ml의 최종 농도를 얻었다. </li><li> TB + 앰프의 경우 : 큰 (500 ㎖ 이상) 생산을 ministring의 볼륨을 준비합니다. 30 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브를 사용하여 멸균 무균 굉장 브로 쓰 (TB) 600 mL의 준비. 필요한까지 암피실린 부록 4 ° C에서 저장 암피실린 100 ㎍ / ml의 최종 농도를 얻었다. </li><li> LB 한천 + 앰프 들면 : 한천 15g / L로 보충 된 LB + 앰프 준비하여 멸균 LB 아가 플레이트를 준비한다. 나누어지는 약 15 - 거꾸로 4 ℃에서 멸균 배양 접시와 저장소에 20 ㎖ 필요한 때까지. </li><li> 에 의한 무균 W3NN [PDMS]를 질주 W3NN [PDMS]의 연속 판을 준비 LB 한천 + 앰프에 세포. 판 overni을 품어30 ° C에서 GHT, 단일 콜로니가 관찰 될 수있을 때까지. protelomerase 식을 derepressing 방지하기 위해이 온도 이상 W3NN을 배양하지 마십시오. </li><li> 무균 전송 멸균 시험관에 LB + 앰프 5 ㎖. 줄무늬 판에서 하나의 식민지로이 볼륨을 접종하여 W3NN [PDMS]의 야간 문화를 준비합니다. 230-250 rpm으로 진탕 기에서 30 ° C에서 문화 하룻밤을 품어. </li></ol> 2. 성장 단계 <ol><li> 무균 멸균 125 ㎖의 삼각 플라스크에 전송 LB + 앰프 10 ㎖와 1하게 준비 LB + 앰프에 밤새 W3NN [PDMS] 문화 100 ㎕로 접종 : 100 희석. <ol><li> 큰 볼륨의 경우, 대신 LB + 앰프로, 250 ㎖의 삼각 플라스크에 TB + 앰프의 50 ㎖로 하룻밤 문화의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 또한, 단계 2.2에서 두 번째로 &quot;대표&quot;문화로 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 막 다른 때까지 30 ° C, 250 rpm으로 진탕 배양기에서 품어600 = 0.8 : 진짜야는 광학 밀도 (OD) 또는 흡광도로 표시, 후반 로그 상 중순에 도달한다. 1-2 시간 후에, 배지를 육안으로 혼탁 나타나기 시작한다. <ol><li> 무균 전송 깨끗한 분광 광도계 큐벳에 문화 1 ㎖. </li><li> 600 nm의 파장으로 설정 - 마주 UV 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 측정한다. 세포가 빈 (LB 또는 TB)를 설정 성장했다있는 미디어 1 ㎖를 사용합니다. 선택적으로, 대신에이 단계 단계 2.1.3의 대표 문화를 사용합니다. </li><li> 배양 아직 적절한 OD에 도달하지 못한 경우, 쉐이커로 돌아가서 다시 30 분마다 체크. (600)는 0.8에 접근 더 자주 OD를 확인합니다. </li></ol></li><li> 문화 600 = 0.8로 표시 후반 로그 단계에 도달하면, 무균 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. </li><li> 10 분 동안 10,000 XG에 문화를 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 체육에 대한 검사상기 튜브의 하단에 llet. </li><li> 적절한 생물 학적 폐기물 용기에 해제 뜨는을 가만히 따르다. 세포 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 모든 세포가 수집 될 때까지 반복 2.4-2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 100 ㎕를 LB + 앰프의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 대기음 마이크로 피펫 또는 볼텍스 믹서를 사용한다. 큰 ministring 생산을 위해, 신선한 LB + 앰프 미디어 1 ㎖에 50 ㎖ TB + 앰프 문화 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 3. Ministring 생산 <ol><li> 무균 42 ° C에 125 ㎖의 삼각 플라스크 및 열에서 LB + 앰프의 20 ㎖를 추가합니다. 큰 ministring 생산을 위해 42 ° C로 예열 LB + 앰프의 500 ml의를 준비합니다. </li><li> 예열 된 배지에 재 부유를 전송합니다. </li><li> 42 ° C에서 품어 600 = 1.0로 표시 과거 로그 상까지 250 rpm으로. 1 시간지나 42 ° C에서 문화의 20 ㎖를 두지 마십시오. </li><li> 37 ° C까지 온도를 줄이고 ADDI의 문화를 남겨적인 90 분. 500㎖의 내용 (90)의 추가의 유도 기간 동안 배양두고 - 120 분, 온도를 감소시키지 않는다. </li><li> 30 ° C까지 온도를 줄이고 2 시간의 추가 온도 다운 시프트 기간 동안 200 rpm으로 진탕 문화를 둡니다. 500 ml의 경우, 4 시간 또는 야간에 온도 저단 변속을 확장합니다. </li></ol> 4. 수확 Ministrings <ol><li> 무균 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 문화를 전송합니다. 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기와 펠렛을 위해 검사합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 적절한 생물 학적 폐기물 용기에 뜨는을 가만히 따르다. 모든 세포가 수집 될 때까지 반복합니다. </li><li> 나중에 추출 -80 ° C에서 액체 질소와 상점에서 상업적 추출 및 독소 제거 키트 또는 플래시 동결과 플라스미드 추출을위한 펠렛을 유지합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다 선언합니다.

우리는 전형적인 박테리아 증식 및 조작에 사용되는 것을 제외하고 특별한 장치를 필요로하지 않는 단일 단계 열 - 유도 된 프로토콜을 사용하여 DNA의 LCC ministrings 생산 여기 간단한 시스템을 설명한다. DNA의 ministrings는 원핵 생물의 유전 적 요소가없는 비틀림이없는 안정적인 선형 DNA의 발현 카세트입니다. 이들은 진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현뿐만 아니라, 평가에 대한 종래의 방법 대신에 사용될 수있다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 &quot;미니&quot;벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 생체 내 생산 플랫폼 우리 강력한 한 단계가 빠르게 쉽게 여러 비용 체외 처리를 필요로하지 않고 임의의 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings를 생성한다. 몇 가지 중요한 단계가 있습니다최적의 ministring 생산 (그림 2, 3)를 확인합니다. 열 유도 생산을 ministring에 가장 중요한 단계입니다. 생산을 ministring의 전체 부족으로 인해 protelomerase 표현의 억압이 LCC의 ministring에 전구체 플라스미드의 변환을 방지 열 유도 (30 ° C로 유지 셀), 부족 가능성이 높습니다. 열 유도 프로토콜에 따라, 약 75 %의 생산 효율을 기대한다. 세포가 로그 상에있는 동안 열 유도에 최적입니다. ( &quot;자란&quot;도 3)를 고정상으로 세포를 사용할 때 PE를 ministring에서 통계적으로 유의 한 차이가 없다하더라도, 우리는 전체 플라스미드 수율은 거의 50 %의 감소를 관찰했다. 수율은 사용 된 플라스미드 추출 프로토콜에 의존 할 것이다. 세포를 로그 상에있는 동안 최적 ministring 생산 열 유도를 발생시킨다. 가난한 ministring 생산은 대부분 장기간 온도 업 시프트 또는 insufficie의 결과가 될 것입니다NT 온도 시프트. 이 E.이 활성화로 장기간 온도 업 시프트는 권장하지 않습니다 protelomerase 활성을 저해하고, 플라스미드 안정성을 방해 할 수있는 대장균 열 충격 응답 (15). 따라서, 온도 시프트 타이밍 ministring 효율적인 생산을위한 또 다른 중요한 단계이다. 30 ℃에서 추가 배양 시간없이 ministring 생산 효율이 매우 불량한 것으로 밝혀졌다 ( &quot;조기 제거&quot;,도 3). 이것은 전화 발현과 활성에 필요한 시간에 기인 할 수있다. 원래 프로 파지 PY54 인코딩 전화의 protelomerase는 일반적으로 최적 30 ° C는 전화 활동에 더 최적화 될 수 있음을 나타내는, 약 28 ° C (12)을 성장 르시 니아를 감염. DNA의 minivector 생산 시스템은 고품질의 세균 서열이없는 DNA의 minivectors를 생성하는 생체 플랫폼을 이용한다. 프로토콜에 대한 수정 난 할 수있다성장 단계에서 세포 증식 (대신 LB의 TB)을 촉진하거나, 생산 및 변환 효율 ministring 높이기 위해 플라스미드 단백질의 생산을 최적화하기 위해 성장 배지를 변경 nclude. 더 큰 문화 볼륨 (200 ㎖ 이상), 온도 하향 변속 및 30 ° C에서 배양을 위해 PE를 ministring에 심각한 부정적인 영향없이 야간 연장 될 수있다. 우리는 예를 들어 500 ml의 문화에 대한 우리의 프로토콜의 수정을 포함하고있다. DNA의 ministrings 정제 원핵 주쇄의 시험 관내 효소 분해를 통해 급송된다. 엔도 뉴 클레아 제 대상 사이트의 숫자가 있습니다 (예를 들어, PI-SceI 제한 효소, PvuI, SCAI) 개방 선을 노출 절단 할 수 전구체 플라스미드의 원핵 백본 볼 수는 원핵 백본의 체외 저하를 허용, 종료한다. 다른 벡터 종 ministrings의 분리는 음이온 교환막 크로마토 그래피 (16)를 통해 달성 될 수있다. LCC DNA 벡터 생산 시스템과 관련된 하나의 전류 제한은 다른 LCC 및 CCC에서 제품의 ministring DNA 정제에 대한 필요성이다. 쉽게 표준 플라스미드 분리 방법을 사용하여 정제이지만, 분리 공정은 여전히​​ 대규모 환경에서 불리 할 수​​있다. ministring의 분리는 시간이 많이 소요 ministring 및 LCC 원핵 세포 골격의 크기가 너무 비슷한 경우 AGE를 사용 할 수 있습니다. 선택적으로, 음이온 교환막 크로마토 그래피 CCC 벡터 종 (16)로부터의 ministrings 나은 분리를 제공 할 수있다. 고온도에서 E. 열충격 반응을 활성화 온도로 업 시프트는 다른 전위 제한 될 수있다 음의 재조합 단백질에 영향을 미치는 대장균은 17 산출 결과적으로 변환 ministring에 플라스미드의 요금을 줄일 수 있습니다. 우리는 생산 플랫폼의 최적화 회피 및 / 또는 열 충격 (18) 등의 영향을 완화하기 위해 다른 곳에서보고한다. 우리또한 현재 제거하거나 생체 내에서 LCC에게 원핵 백본 오염을 감소시키는 방법을 최적화한다. LCC의 DNA의 ministring 염색체 통합 숙주 염색체을 방해하고 아폽토시스로 세포 주제. 뿐만 아니라이 같은 종양과 인접 유전자의 침묵함으로써 안전성을 향상시키는 등의 삽입 성 돌연변이 유발의 부정적 영향을 감소 않는다; 치사 효과도 관련된 부작용 및 통합의 손상없이 노킹 인 유전자 대체 연구에 적합한 방법이 될 수있다. DNA의 ministring 벡터는 생체 내에서 주어진 목표로 치료 단백질, RNA, 항체 또는 항원에 대한 유전자의 전달과 표현으로 적용되거나 오작동 또는 비 기능적인 대립 유전자를 대체 할 수 있습니다. 간단한 단계의 열 - 유도 생체 생산 시스템은 DNA의 ministring 벡터 쉽게 임상 또는 산업용으로 제조 할 수있다.

목표는 공유 (LCC) DNA의 minivectors 간단한 고효율 원스텝 열 유도 생체 DNA ministring 생산 시스템을 사용하여 폐쇄 선형 확장 량을 생성한다. DNA의 ministrings는 DNA를 제공하는 안전하고 효과적인 비 바이러스 성 전략을 제공합니다. 이들은 DNA를 minicircles의 효율 LCC 벡터의 안전성을 결합하고, 또한 트랜 스펙 션 효율을 손상시키지 않으면 서 바이러스 유래 벡터에 안전한 대안을 제공한다. 성공하는 유전자 전달체 위해서는, DNA 벡터는 목적 숙주 세포를 선택하고 상기 인코딩 된 유전자 (들)을 표현한다. 특히 포유류 시스템에서 실제로 극복해야 할 여러 가지 세포 장벽이있다. 세망 내피 시스템에 의해 혈청 클레아 면역 검출에 의한 열화를 방지하기 위해, DNA 벡터는 타겟 시스템과 생체 면역 대응해야한다. 보호되지 않은 DNA는 빠르게 플라즈마 클레아 제에 의해 소화DNA 벡터 빠르게 표적 세포의 세포막을 횡단 할 수 있어야하므로 상기 플라스미드 막은 고밀도 지단백질 장벽 구성된다. 셀되면, 벡터는 세포질을 통과해야하며, 유전자 발현의 핵을 입력 핵 막을 통과. 비 바이러스 성 유전자 전달 방법은 세포 조직 - 타겟팅 향상에 초점을 맞춘다. 그러나, 이러한 종래 기술과 플라스미드의 사용으로 인해 빠르게 유전자 발현을 침묵 1,2- 세균 면역 원성 서열의 존재로 형질 전환 효율을 감소시킨다. 기존의 플라스미드는 일반적으로 원핵 생물 시스템의 유지 보수를 위해 항생제 내성 유전자를 수행한다. 그러나, 이러한 인간의 호스트의 잠재적 악영향을 수평 또는 천연 유전자 전달 효과를 통해 호스트 식물 발생에 대한 저항성을 부여 할 수있다. 기존의 플라스미드는 잠재적으로 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수 뉴클레오티드의의 CpG 모티프 (2)를 포함감소 또는 유전자 발현을 침묵. 이들은 단독으로 진핵 발현 카세트로 구성되기 때문에, 이러한 DNA의 minicircles 3과 DNA의 minivectors들은 그들의 소형화 및 면역 원핵 요소의 유무에 그들이 세포 및 세포 내 생체 이용률 개선 된 유전자 발현을 향상 나타내는 한 유전자 전달을위한 더 나은 대안 4. 더 표적 부위 5 생체 내 투여와 관련된 전단력에 대한 저항에 대해 감소 된 벡터 크기 요금. 단위 질량 당 벡터의 높은 카피 수는, 따라서 독성을 감소 이하 형질 전환 시약을 필요로한다. 그러나, 숙주 염색체로 랜덤 벡터 통합의 경우, 원 공유 분자 연속성을 부여, DNA의 minicircles 종래 플라스미드 모두 포함 (CCC) 경로를 폐쇄하기 때문에 엄청난 결과를 가져올 수있다 삽입 성 돌연변이를 초래할 수있다 <s&gt; 6입니다. 비교적 선형 DNA 벡터의 통합함으로써 증식하는 세포 집단에서 돌연변이 세포를 제거하고, 삽입 성 돌연변이 7 방지 세포사 경로를 염색체을 방해하고 개시한다. 최소한의 면역 학적으로 정의 된 유전자 발현 (미지) 벡터 (8)과 마이크로 선형 벡터 9 (MiLV)는 시험 관내에서 개발 LCC DNA 벡터이다. 미지 벡터는 종래의 플라스미드 DNA 벡터 (11)에 비해 생체 내에서 17 배 향상된 유전자 발현까지 발휘 한 백신 8 10 암 유전자 치료에 유망한 결과를 보여 주었다. 또한, LCC에 의한 minivector의 비틀림없는 구조 덜 형질 전환 시약 따라서 독성 7 감소 CCC 수퍼 코일 상대 비교하여 필요하다. 우리의 향상된 LCC의 DNA 벡터, DNA의 ministrings는 뛰어난 표현의 효율성과 bioavai을 증명하고있다불안정성 7. 또, DNA의 ministrings는 한 단계의 열 - 유도 생체 생산 시스템, 생체의 여러 단계를 필요로하고 미지 MiLV LCC 벡터에 합당하고 비용 효율적인 대안을 생성한다. 증명되는 DNA ministring 생산 시스템 그것을 만드는 생체 수행 간단한 열 유도 과정 모두 비용 효율적이고 쉽게 확장. 이 시스템은 예 르시 니아 enterocolitica PY54 박테리오파지 유래 텔 / PAL은 원핵 플라스미드 골격으로부터 최소 진핵 발현 카세트를 분리하는 재조합 시스템 12 protelomerase 이용한다. 우리는 열 유도 박테리오파지 λ 프로모터, CI [TS] 857 (13)의 제어하에 전화의 protelomerase을 표현하는 대장균을 대장균 세포 (W3NN)를 설계했다. 표현하면, 전화의 protelomerase는 &quot;슈퍼 순서&quot;(SS) 전구체 플라스미드에있는 사이트 내에 존재하는 친구의 표적 부위에 작용DNA의 ministring 후 (도 1)으로 정제 할 수있는 LCC 제품을 얻었다. DNA의 ministring 전구체 플라스미드 SS 사이트는 이에 한 전구체 플라스미드 동종 LCC 및 CCC에서 minivectors의 생산을 촉진 Cre 호텔 재조합 (LOX) TelN의 protelomerase (telRL) 및 FLP 재조합 효소 (FRT)를 포함하는 다른 콤비 네이즈의 대상 부위를 인코딩한다. 또한, 각 SS 사이트 핵 전좌 (14)을 개선하기 위해 게재 SV40 인핸서 (SV40e) 시퀀스에 의해 양쪽 측면된다. 우리는 SV40e의 연속 첨가가 점진적으로 형질 전환 효율 (7)에 해당 증가를 부여하는 것이 다른 곳에서 증명하고있다. 전구체 플라스미드 (pDNA에 MiniString 또는 PDMS)는 녹색 형광 기자 (GFP)와 전사 융합에 대한 관심이 원하는 유전자의 삽입을 용이하게하기 위해 폴리 링커 (그림 1)가 포함되어 있습니다. DNA의 minivector 기술 수​​도진핵 시스템에서의 유전자의 발현 효율을 향해 유전자 전달, 리포터 유전자의 발현, 및 평가를위한 종래의 방법 대신에 사용된다. DNA의 ministrings는 생체 적합성 및 선형 DNA 벡터 우수한 안전성 프로파일을 &quot;미니&quot;벡터의 형질 감염 효율 향상의 이점을 결합한다. 우리 강력한 원스텝 생산 플랫폼은 신속하고 쉽게 유전자 전달 애플리케이션 DNA의 ministrings 생산 및 높은 안전성을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

우리는 생체 내에서 간단한 플랫폼을 통해 생성 된 비 바이러스 성 유전자 전달 벡터의 대안으로 선형 공유 폐쇄 (LCC) DNA의 minivectors을 구축 하였다. DNA의 ministrings이 높아진 안전성 프로파일을 보유하고 효율적으로 표적 세포에 DNA화물을 제공합니다. 기존의 DNA 벡터는 항생제 내성 유전자의 CpG 모티프 및 호스트 면역 반응의 자극으로 이어질 수 복제의 세균 기원을 포함 바람직하지 않은 원핵 시퀀스를 수행한다. 종래의 DNA 벡터의 생체 이용율은 또한 그들의 큰 분자 크기에 노출된다. 그들의 원형 성격도 삽입 성 돌연변이 유발로 이어지는 염색체 통합을 부여 할 수 있습니다. 세균 서열은 관심 (GOI) 필요한 진핵 발현 요소의 유전자를 떠나는 DNA의 minivectors로부터 절단된다. 우리의 LCC의 DNA의 minivectors, 또는 DNA의 ministrings는, 면역 원성 세균 서열의 결여이다; 따라서 일을 개선EIR 생체 이용률 및 GOI 식입니다. 염색체 내에 통합 벡터의 경우, LCC에 DNA의 ministring는 치명적함으로써 증식 세포 집단에서 위험한 돌연변이를 분리, 숙주 염색체를 중단한다. 바람직 벡터 통합 이벤트의 가능성을 제거하면서 결과적으로, DNA에 ministrings &#39;는 minicircle&#39;DNA의 이점을 제공한다. 기존의 플라스미드 및 동종 원형 공유 폐쇄 (CCC) 대응과 비교, DNA의 ministrings 우수한 생체 이용률, 형질 전환 효율 및 세포질 반응 속도를 보여 - 그들은 이렇게 표적 세포의 효율적인 형질 전환을위한 양이온 성 계면 활성제의 낮은 금액을 필요로한다. 우리가 사용하는 간단한 신속하고 확장 성이 대장균에서의 DNA ministrings 생산 용 생체 시스템에서 유도 한 단계를 구성하고있다.

DNA 추출 잔류 전구체 플라스미드 LCC 원핵 백본 및 DNA의 ministring 후에 회수한다. 전체 플라스미드 수율 및 순도는 분광 광도계를 사용하여 평가 될 수있다. 순도는 260 nm에서 1.9-2.0의 비율이 최적 파장 280nm (A260 / A280)에서의 흡광도의 비율을 이용하여 추정된다. 모든 LCC 및 CCC 제품은 아가 로스 겔 전기 영동 (AGE) (도 2)을 통해 분리 될 수있다. AGE 전에 정제 ministring에 열 유도 후 생산 ministring 결과를 시각화. ministring 생산 성적 평가 상위 플라스미드 (5.6 KB) (도 2)에 ministring (2.4 KB)의 밴드 강도를 비교하는 단계에서 이루어질 수있다. Ministring DNA는 다음과 같은 표준 플라스미드 AGE 겔 추출 프로토콜을 통해 회수 될 수있다. (3)이 반송 중에 발생할 다양한 조건 하에서 생산 효율 ministring 요약 도표프로토콜을 보내고. Ministring 생산 효율은 제조의 분석 프로그램을 이용하여 DNA 밴드 강도에 기초하여 결정 하였다. 유사한 농도계 프로그램 AGE의 결과를 분석하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1 :. 생산을 ministring의 개요 (A)는 부모 벡터는 두 SS 사이트에서 액자 리포터 유전자와 전사 융합 폴리 링커를 포함한다. 백본은 암피실린 내성에 대한 베타 - 락타 마제를 인코딩하고 또한 체외 소화 백본에 고유 한 여러 컷 사이트가 포함되어 있습니다. 주요 프로토콜의 (B) 개요. 단계 2) 성장 단계 및 3) Ministring 생산 프로토콜의 단순함을 강조하는 단계의 전체 설계도를 제공하는 다이어그램으로 표시됩니다. (C) Ministring 유도. 열 유도 부모 플라스미드의 SS 사이트에 전화 활동 다음에 전화 식을 수 있도록, 온도에 민감한 리프레을 비활성화합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> 그림 2 : 프로토콜의 편차 후 생산을 Ministring. 1 : 제어, 2 : 유발되지 않은, 3 : 자란, 4 : Overinduced, 5 : 조기 제거. DNA의 ministring는 LCC 백본 3 KB입니다, 약 2.4 킬로바이트를, 그리고 pNN9 부모 플라스미드는 5.6 KB입니다. ministring 및 LCC 백본 밴드의 밴드 강도가 낮은 ministring 수율을 나타내는, 프로토콜의 편차에 놓습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 뉴 잉글랜드 바이오 랩스에서 1킬로바이트 사다리; 제어 프로토콜 다음; 유도되지 않은, 아니 온도 업 시프트; 자란, 온도는 두린 상향 변속g 정지상; Overinduced, 확장 된 온도 업 시프트; 조기 제거, 아니 온도 다운 시프트. 플라스미드는 오메가 Biotek EZNA 플라스미드 미니 키트를 사용하여 추출 하였다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> 그림 3 :. 생산 효율 (PE)을 ministring에 프로토콜 편차의 효과 결과는 3 시험의 평균이다. PE는 AGE 후 AlphaImager HP를 사용하여 측정 상대 밴드 강도 추정된다. 편차는 다음 단계에서 발생 제어 프로토콜 다음; 유도되지 않은 2 단계에서 어떤 온도 업 시프트; 자란, 온도 업 시프트 단계 1.6에서 고정 단계에서 시작했다; 단계 2.3에서 Overinduced, 넓은 온도 업 시프트; 초기 제거 세포를 제거하고, 추출단계 2.3에서 온도 하향 변속없이. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

이중 가닥 DNA Ministrings의 생산

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K 조회수.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

비디오: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>DNA 커튼은 상동 재조합 중 복잡한 분자 시스템을 조명합니다.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

DNA 커튼은 상동 재조합 중 복잡한 분자 시스템을 조명합니다.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

연구

유전학

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Tract Growth에서 관찰된 CMG 매개 DNA 풀기

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Dynamics of Eukaryotic DNA Replication Through Single-Molecule Visualization (단일 분자 시각화를 통한 진핵생물 DNA 복제의 역학 규명)

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

생화학

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

DNA 복제 분기점

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

교육

JoVE Core

분자생물학

Unit 1

DNA Replication

주요 용어 및 개념

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

두 가닥 절단 복구

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA 복구/회복과 재조합

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

원핵생물의 복제

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이중 가닥 DNA Ministrings의 생산

요약

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