The authors thank Dara Frank and Carrie Harwood for their generous contribution of strains. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation holds patent no. 8,354,451; with claims broadly directed to treating or inhibiting the progression of infection of a microorganism in a patient by administering a 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-inhibiting compound such as 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Inventors are Graham Moran and Pang He. This research was supported by the National Institutes of Health (R00-GM083147). The University of Washington P. aeruginosa transposon mutant library is supported by NIH P30 DK089507.

배양기 항생제 1. 제조, 및 2- [2- 니트로 -4- (트리 플루오로 메틸) 벤조일] -1,3- 시클로 헥산 디온 (NTBC) <ol><li> 적절한 볼륨으로 LB 액체 배지 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 %의 NaCl의 H 2 O)과 분취 액을 만든다. 오토 클레이브 소독. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 100 ㎖ LB 한천 (1 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.25 % 염화나트륨, H 2 O 1.5 % 한천) 250 mL의 플라스크를 만든다. 실온에서 오토 클레이브 및 저장에 의해 소독. 한천 플레이트에 쏟아져 전에 용융되어 있는지 확인합니다. 주 : 4 판을 수득한다 LB 한천 100 ㎖을 함유하는 플라스크. LB 한천의 양이 분석에 필요한 플레이트의 수에 대응하도록 변경 될 수있다. </li><li> (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4) (16) PBS를 확인합니다. 실온에서 오토 클레이브 또는 여과 및 저장에 의해 소독. </li><li> 겐타 마이신에 대한 항생제 재고 솔루션을 준비, 카나마이신,D 토 브라 마이신. <ol><li> 피에 대한 적절한 항생제 재고 농도를 준비 100 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신 30 ㎎ / ㎖의 카나마이신 및 10 ㎎ / ㎖의 토 브라 마이신을 함유 루기 노자 균주. 4 ° C에서 물 필터 소독 (0.2 μm의)와 저장소에 항생제를 녹인다. 연구 박테리아에 따라 항생제 농도를 변경합니다. </li></ol></li><li> NTBC 재고 솔루션을 준비합니다. DMSO 400 μL에 NTBC 10 mg을 녹이고. 이것은 75.9 mM의 NTBC의 농도를 산출한다. -20 ° C에서 보관 NTBC 스톡 솔루션을 제공합니다. 실온에서 해동 용액은 필요에 따라. 참고 : NTBC의 다른 소스는 용해도의 차이가 있습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 NTBC을 용해 단계 1.5 따라서를 조정하는 적절한 차량을 결정합니다. </li></ol> 2. 세균 균주의 NTBC 적정의를 <ol><li> 균주의 설정 하룻밤 문화를 테스트합니다. 2 ㎖의 LB 배지에 16 × 150mm 시험관 추가S (주 당 하나) 및 각 변형에서 1 절연 식민지 접종. 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기에 통기로 37 ℃에서 밤새 배양한다. </li><li> 다음 날, LB 배지에 NTBC의 적정을 준비합니다. 다른 균주 NTBC에 대한 민감도에 차이가 있기 때문에 0 ~ 900 μm의 NTBC에 초기 범위를 사용합니다. <ol><li> 변형 당 4 ~ 5 시험관 (16 × 150mm)에 1 ㎖의 LB 배지를 추가합니다. </li><li> 농도 범위에서 시험관 (16 × 150mm)에 NTBC 스톡 용액 (75.9 mm)를 추가한다. LB 액체 배지 1 ㎖에 추가 NTBC 농도 및 해당 재고 수량은 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 문화를 씻으십시오. <ol><li> 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. 뜨는 및 느슨하게 펠렛 세포를 제거micropipettor 및 1 ml의 (LB)에 고체 세포 펠렛을 재현 탁 </li></ol></li><li> OD 600 0.05 적정 튜브를 접종. 튜브에 접종하는 데 필요한 세척하고 배양의 양을 계산한다. 참고 : 존재하지 않아야 pyomelanin 때문에 예방 접종에 대한 세척 문화를 사용합니다. </li><li> 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 약 24 시간 동안 적정 튜브 부화. </li><li> 적정 튜브 사진 및 MIC 및 산화 스트레스 분석에 사용할 NTBC의 양을 결정하기 위해 내부 및 균주간에 색소 생산을 비교한다. 무 세포 배양 상층 액에서 pyomelanin의 양을 결정하고 세포 밀도를 결정하기 위해 600 OD 판독을 사용한다. 주 : 세포 배양 상청액에서 pyomelanin OD 600의 비율로 처리 후 NTBC pyomelanin 생산에서의 차이를 정량화하기 위해 계산 될 수있다. </li></ol> 3. 항생제 최소 Inhibi96 웰 플레이트에 토리 농도 (MIC) 분석 <ol><li> 균주의 설정 하룻밤 문화와 NTBC없이 LB에서 시험한다. 주 :이 프로토콜은 300 μM NTBC의 대표적인 레벨을 사용하여 설명한다. 사용될 NTBC의 적절한 수준은 단계 260에서 결정된다. <ol><li> 2 ml의 (LB) 300 μm의 NTBC 추가 더 NTBC 조건에 대해 2 ml의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 멸균 이쑤시개를 사용하여 박테리아의 하나 고립 된 식민지와 튜브를 접종. NTBC 하나의 문화와 각 변형에 대한 NTBC없이 하나의 문화가 될 것입니다. 폭기는 공기 인큐베이터에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37 ℃에서 밤새 배양한다. </li></ol></li><li> 다음 날, MIC 분석을 설정하는 LB + NTBC 및 LB + DMSO 마스터 솔루션을합니다. 접종 물이 추가 될 때,이 600 μM의 농도로 추가하기 NTBC 300 μM의 최종 농도를 산출 두 배 희석한다. <ol><li> 하나 antibi을 테스트하려면하나의 변형, 2 ㎖의 LB 600 μm의 NTBC을 추가하고 NTBC 마스터 솔루션을 만들기 위해 혼합에 대한 귀의. 2 ㎖의 LB에 차량 (DMSO)의 동등한 볼륨을 추가하고 더 NTBC 마스터 솔루션을하지 않습니다 섞는다. 항생제 원액을 만들뿐만 아니라 96 웰 플레이트에서 희석 시리즈를 설정하는 이러한 솔루션을 사용한다. 참고 : 마스터 용액 제형은 피펫 오류를 설명하는 별도의 솔루션을 얻을 것입니다. 시험 균주의 항생제와 수에 따라서 필요에 따라 마스터 솔루션은 상하 또는 축소 될 수있다. </li></ol></li><li> LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션의 항생제 솔루션을 준비합니다. 참고 :이 솔루션의 항생제 농도가 두 배 최종 원하는 농도이어야한다. 충분한 용액을 96 웰 플레이트에 웰에 네 100 μl를 전송해야한다. <ol><li> 겐타 마이신 + 64 ㎍ / ml의에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 겐타 마이신 (450)의 콘텐츠 0.288 μL (100 ㎎ / ㎖)을 추가하고,이 용액을 만드는μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션입니다. 참고 : P.에 대한 겐타 마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1는 32 μg의 / ㎖이다. </li><li> 카나마이신 + 256 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 확인하십시오. 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션 카나마이신 주식의 3.84 μL (30 ㎎ / ㎖)를 추가,이 솔루션을 확인합니다. 참고 : P.에 대한 카나마이신의 최대 농도 녹농균 PAO1 128 μg의 / ㎖이다. </li><li> 토 브라 마이신 + 8 μg의 / ㎖에서 NTBC 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션을 450 μL LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에 토 브라 마이신 주식의 0.36 μL (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 참고 : P. 들어 aeruginosa의 PAO1, 토 브라 마이신의 최대 농도는 4 μg의 / ㎖이다. 주 : 박테리아 시험되어야하는 항생제 농도가 조절 될 수있다. </li></ol></li><li> 96 웰 플레이트에서 네 개의 우물에 각각 2 배 항생제 용액 100 μl를 추가합니다. exampl에 대한 행 A의 이러한 솔루션을 배치즉, 젠타 A4 통해 A1에 배치해야 카나마이신을 통해 A8 A5에 배치되어야하고, 토 브라 마이신을 통해 A12 A9에 배치되어야한다. 설정 96 웰 플레이트의 그림에 대한 그림 1A를 참조하십시오. 주 : 다중 항생제 한 플레이트에서 시험 할 수 있지만, 단지 하나의 변형은 다른 균주에서 교차 오염의 가능성을 제거하기 위해 접시 당 테스트되어야한다. </li><li> 96 웰 플레이트의 H​​를 통해 행 B에 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액 50 μl를 추가합니다. 그 하나의 판을 확인 LB + NTBC이고 하나 플레이트 LB + DMSO입니다. 그림 1A를 참조하십시오. <ol><li> LB + NTBC에서 항생제에 대한 LB + NTBC을 사용합니다. LB + DMSO의 항생제에 대한 LB + DMSO를 사용합니다. </li></ol></li><li> micropipettor가 피펫 팁을 변경, B를 믹스에게 솔루션을 행하기 위해 행에서 용액 50 μl를 전송하여 항생제의 두 배 연속 희석을 수행하여, 및 행 (B)에서 용액 50 μl를 전송하기위한 C. 반복을 행합니다 remainiNG 행. 행 G 희석 한 후, 그 행과 폐기의 용액 50 μl를 제거합니다. 박테리아 성장을위한 항생제 컨트롤로 행 (H)를 사용합니다. 그림 1B를 참조하십시오. 참고 : G를 통해 각각의 잘 행은 지금 배에서 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 항생제의 50 μL 최종 원하는 농도가 포함되어 있습니다. 행 H없이 항생제로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO가 포함되어 있습니다. </li><li> 하룻밤 문화의 OD 600을 측정합니다. 미디어에 존재 pyomelanin을 제거하기 위해 OD 600 판독을 복용하기 전에 모든 문화를 씻으십시오. <ol><li> 2 분 동안 16,000 XG에서의 microcentrifuge에 문화 1 ㎖을 원심 분리하여 문화를 씻으십시오. micropipettor으로 뜨는을 제거하고 1 ㎖의 (LB)에있는 세포 펠렛을 resuspend </li></ol></li><li> (LB)에서 2.75x10 5 CFU / ㎖로 하룻밤 문화를 희석 참고 : 하나의 OD 600 단위 (P)에 대한 1 × 9 CFU / ㎖의 상응이라고 가정 녹농균. CFU / ㎖ 변환에 OD는 거라고 할 수있다다른 박테리아에 ifferent. </li><li> 적절한 웰에 희석 세균 배양의 50 μl를 추가합니다. 주 : NTBC 성장 DMSO 배양에서 성장 및 배양 NTBC DMSO를 함유하는 웰에 첨가한다 함유 웰에 첨가한다. 그림 1B를 참조하십시오. <ol><li> 각 균주와 항생제 농도 세 우물에 세균을 추가합니다. 세균 오염에 대한 제어 역할을하는 네 번째 우물에 LB의 50 μl를 추가합니다. 그림 1B를 참조하십시오. </li><li> 웰 접종 멀티 채널 micropipettor를 사용한다. 이웃하는 웰의 오염을 방지하기 위해 추가 접종 할 때 팁을 웰의 바닥 근처에 있음을 보장 피펫. 참고 : 우물에 세균 배양을 추가하면 항생제와 NTBC 농도의 두 배를 희석합니다. </li></ol></li><li> 파라 필름으로 96 웰 플레이트를 덮고, 37 ℃에서 약 24 시간 배양한다. 공기 인큐베이터에서 정적으로 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 검사우물에 세균 성장​​을위한 판. MIC는 세균의 성장에는 각 균주의 복제에 대해 세 보지되는 항생제의 최소 농도이다. <ol><li> 시각적으로 성장 판을 검사하거나 (600) 중독에 플레이트 리더 세트를 사용하여 읽기. </li></ol></li></ol> 산화 스트레스 응답 4. 스팟 플레이트 분석 <ol><li> 3.1 단계에 설명 된대로 균주의 설정 하룻밤 문화 NTBC와 LB와없이 테스트 할 수 있습니다. </li><li> 다음날, 산화성 스트레스로 H 2 O 2를 함유하는 LB 아가 플레이트를 준비한다. 0 내지 1 mM의 H의 범위는 2 O 2 농도는 좋은 출발점이다. <ol><li> LB 한천 플라스크 용융. 실온에서 약 50 ° C로 냉각 매체. </li><li> 원하는 농도로 냉각 된 미디어에 직접 O 2 H 2를 추가합니다. 소용돌이 플라스크 혼합합니다. H의 농도는 표 2를 참조하십시오 2 O 2농축 H 2 O 2의 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 이러한 값은 LB 한천 100 ㎖에 기초한다. </li><li> 바로 거품을 제거하기 위해 H 2 O 2 불꽃을 표면을 추가 한 후 번호판을 붓고. 수율은 LB 한천의 100 ㎖ 당 4 판입니다. H 2 O 2 농도가 판을 표시합니다. </li><li> 플레이트에서 과도한 수분을 제거하는 30 분 동안 실행 팬 생물학적 흐름 후드에서 발견 판을 놓습니다. 참고 : 판들이 준비되어 같은 날을 사용합니다. 그렇게하지 ​​않으면 일치하지 않는 데이터가 발생할 수 있습니다. 참고 사항 : 파라쿼트 같은 산화 스트레스는이 분석에서 H 2 O 2를 대체 할 수 있습니다. 다른 산화성 스트레스에 사용 농도는 H 2 O 2에 사용되는 것과 다를 수있다. </li></ol></li><li> 세척 단계 3.7에 설명 된대로 외경에게 하룻밤 문화 (600)을 측정한다. </li><li> 모든 하룻밤 CU의 OD 600 정상화균주의 집합의 가장 낮은 값 ltures 테스트중인. P. 녹농균은 일반적으로 LB + NTBC 또는 LB + DMSO에 하룻밤 성장 약 2.5의 OD 600이 있습니다. <ol><li> 1 ml의 총 부피에서 낮은 OD 600 문화를 희석하는 데 필요한 배양의 볼륨을 결정한다. 배양 OD (3)의 600 균주의 세트는 낮은 OD (600)가있는 경우, 예를 들면 2.5 인, 다음의 계산을 수행 (2.5) (1 ㎖)을 = (3) (X). X는 = 0.833 ml의. 문화의 0.833 mL의 미세 원심 분리 튜브에 배치됩니다. </li><li> 1 ml의 배양 부피를 가지고 필요 LB + NTBC (300 μM) 또는 DMSO LB +의 양을 계산한다. 단계 4.4.1에서 예를 들어, LB + NTBC 또는 LB + DMSO의 양이 0.167 ㎖ (- 0.833 ml의 문화 1 ml의 총 부피) 될 문화에 추가됩니다. LB + NTBC 및 LB + DMSO의 재고 솔루션은 모든 균주를 희석에 필요한 볼륨 근거로이 희석에 사용합니다. </li><li> 문화와 LB + N 믹스텍싱에 의해 TBC 또는 LB + DMSO. </li></ol></li><li> NTBC 또는 DMSO의 일정한 농도의 문화를 유지하기 위해, PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 정규화 하룻밤 문화의 열 배 연속 희석을 수행합니다. <ol><li> PBS + NTBC과 PBS + DMSO의 재고 솔루션을합니다. 하나의 균주에 대한 희석 한 세트의 경우, 720 ㎕의 총 부피를 수득 300 μM의 NTBC 또는 PBS와 DMSO의 동등한 양을 혼합한다. 테스트 얼마나 많은 균주에 따라 위 또는 아래로이 주식을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 10-7 연속 희석을 통해 10 -1에 대한 라벨의 microfuge 튜브. 적절한 튜브에 PBS + NTBC 또는 PBS + DMSO의 90 μl를 추가합니다. LB + NTBC에서 재배 변종에 대한 PBS + NTBC를 사용하여 LB + DMSO에 성장 균주에 대한 PBS + DMSO를 사용합니다. </li><li> 해당 10-1 희석 관에 문화의 10 μl를 추가합니다. 텍싱하여 혼합하고 10 -2 희석 튜브에 10 -1 희석의 10 μl를 전송합니다. 모든 희석이 PERFO 때까지 반복rmed. 희석 사이에 피펫 팁을 변경합니다. </li></ol></li><li> 각 변형에 대한 중복에 LB + H 2 O 2 판에 10-7 희석을 통해 10 -3의 자리는 5 μL. 관광 명소 도금하는 경우 대부분은 적어도 희석 (10-7 -3 10) 희석에서 한 피펫 팁을 사용합니다. 팁 또는 액체가 플레이트에 건조 될 때까지 판을 기울이지 마십시오. </li><li> 변형에 따라 37 ° C (공기 인큐베이터)에서 24 ~ 48 시간 동안 접시를 품어. 참고 : P. 녹농균 PAO1는 배양 24 시간 후 LB에 좋은 크기의 식민지를해야합니다. 그들은 콜로니를 PAO1 대략 동일한 크기를 가질 때까지 균주를 배양한다. </li><li> transluminator 위의 CCD 카메라를 사용하여 번호판을 사진. 선택적으로, 같은 크기 대비 및 작물에 대한 사진을 편집 할 수 있습니다. 산화 스트레스에 대한 민감도에서의 변화를 결정하기 위해 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 카운트. </li></ol>

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	<li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction,+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection.">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li><li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate.">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li><li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Pyomelanin,+a+Second+Type+of+Melanin,+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus.">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li><li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E., Elnashar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+Function+of+Pyomelanin.">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. , 449-472 (2010).</li><li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined:+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles.">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li><li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin.">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li><li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds.">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li><li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Homogentisate+Pathway:+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine,+L-Tyrosine,+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida.">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li><li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis.">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li><li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell.">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li><li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Putative+ABC+Transporter,+HatABCDE,+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li><li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress.">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li><li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+(4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations.">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li><li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6.">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections.">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li><li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li><li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection.">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li><li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin's+Chemical+Structure+and+Paramagnetism.">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092 (2011).</li><li>Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hancock Laboratory Methods. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates12 (Figure 2). Therefore, it is necessary to test a range of NTBC concentrations for each strain being assayed. It is advisable to start with lower concentrations and increase to higher concentrations as needed because the user will most likely want to determine the lowest concentration of NTBC that inhibits pyomelanin production in a particular strain. Our titration assay describes a qualitative method to determine inhibition of pigment production. Depending on the objective of the study, it may be necessary to determine pyomelanin levels. This could be accomplished through HPLC3 or electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy19, which could be used to detect the presence of pyomelanin in the samples. Melanin produces a characteristic EPR spectrum, and samples lacking melanin should not produce that spectrum20.
Modifications can be made to the titration assay by using minimal medium supplemented with tyrosine instead of LB. If a minimal medium (such as Defined minimal media21) is used, tyrosine must be supplemented in the medium since pyomelanin production will not occur in the absence of tyrosine. Minimal medium supplemented with tyrosine provides the advantage of having a defined concentration of tyrosine in the media and may eliminate some variation between biological replicates. The titration technique works quite well when one is looking for a change in pigment production, but will not work if the bacterium does not produce pigment. Other compounds could be substituted for NTBC in a titration series, provided there is a visual output to determine if the compound has an effect on the bacteria, such as reduction or enhancement of pigment production. In our assay, once the concentration of NTBC needed to eliminate or reduce pyomelanin production has been determined it is possible to use this concentration in other assays, including antibiotic MICs and oxidative stress response, in order to test the effects of NTBC on other bacterial phenotypes.
The antibiotic MIC method described in this paper will allow the user to determine antibiotic sensitivity of bacteria. Additionally, the incorporation of NTBC in the assay will allow the user to determine the effects of NTBC treatment on antibiotic sensitivity in pyomelanin producing bacteria (Table 3). Antibiotic sensitivity in bacteria can be quite variable and there are several techniques that can be used to determine MICs. Common techniques include agar dilution plates and large and small scale broth dilutions14. The microtiter plate broth dilution method described here is an easy way to determine MICs for various antibiotics, and it uses fewer resources than other methods since the protocol is designed to use small volumes. The most critical steps in the procedure are setting up the initial antibiotic stock solutions and performing accurate two fold dilutions in the 96-well microtiter plate (Figure 1A). It is important that the antibiotic stocks are two fold higher than the final desired concentration, since the antibiotics will be diluted two fold when the inoculum is added to the wells. The range of antibiotic concentrations used must be determined experimentally since different strains of bacteria have different sensitivities to antibiotics, and sensitivities are dependent on the antibiotic. The concentration of NTBC used in the assay must also be two fold higher than the final desired concentration since it will be diluted two fold when the inoculum is added. Accuracy in performing serial dilutions will help ensure that there is a two-fold difference in antibiotic concentration in each row of the plate.
The 96-well microtiter plate MIC assay can be easily modified to incorporate as many antibiotics or bacterial strains as needed. While more than one antibiotic can be tested in a plate, only one bacterial strain should be tested per plate to avoid cross contamination from other bacterial strains. No more than three antibiotics should be tested in one plate to allow for testing of one bacterial colony in triplicate with one control column containing medium only for each antibiotic (Figure 1B). The medium only column will test for contamination in the antibiotic stocks. It is also advisable to include an LB only row inoculated with bacteria in the plate to test for bacterial growth in the absence of antibiotics. This will ensure that the bacteria is growing properly and in the event that there is no growth in any of the antibiotic concentrations tested, the possibility that there was something wrong with the inoculum can be ruled out. In addition, this will provide a turbidity control for unimpaired growth, should a plate reader be used to determine the optical densities of each well. The majority of issues arise in determining the MIC, which is defined as the lowest concentration of antibiotic in which no growth occurs in all three technical replicates. It is possible that technical replicates may have slightly different MICs. Differences in MIC within technical replicates for a strain should be no more than two fold. We found that placing the pipet tips in the antibiotic containing medium while adding inoculum helps reduce some of the MIC differences for technical replicates, as it eliminates some of the potential for inoculum splashes into adjacent wells. The MIC assay should be done with at least three biological replicates to determine that the MICs and trends are consistent between replicates. The assay as described gives a very clear method for setting up a 96-well plate with different antibiotics and strains of bacteria. A large range of antibiotic concentrations can be tested, as well as a variety of different antibiotics, which can be adapted as appropriate to the bacterium being tested. This technique can be modified to test the antibiotic sensitivities of a large range of bacteria, as well as to test sensitivities to non-antibiotic compounds.
Several oxidative stress response assays have been described in the literature, including viable counts after exposure to oxidative stress1 and disc diffusion assays15. The spot plate assay described here determines bacterial sensitivity to oxidative stress when the oxidative stressor is in an agar plate. This technique allows low concentrations of H2O2 to be tested instead of the high concentrations typically used in the other assays. The spot plate technique has less variation between biological replicates than viable counts and disc diffusion methods. Trends in the spot plate assay tend to be very consistent, although there is still some variability between biological replicates. The variability is usually seen as slight differences in the H2O2 concentration that allows a clear difference in bacterial growth and sensitivity to oxidative stress to be observed. Sources for these inconsistencies are likely due to either pipetting errors when adding H2O2 to the plates or natural variations in sensitivity to oxidative stress in different colonies of bacteria. Technical replicates consistently show the same results. It is important that a range of H2O2 concentrations be tested, as different strains of bacteria may have different sensitivities to oxidative stress (Figure 3). It is also critical that the same dilutions be plated for all conditions so comparisons can be made between strains and test conditions. Additionally, a plate containing no H2O2 must be included as a control to ensure that a proper dilution series was created and to provide a comparison for bacterial growth in the absence of oxidative stress. If bacteria are treated with a compound, such as NTBC, it is necessary to include a no treatment control so a comparison can be made between the two conditions. This will allow the user to determine if the compound has an effect on oxidative stress response (Figure 3).
The spot plate protocol can be modified to include other oxidative stressors such as paraquat. However, the type of oxidative stress to be generated in the bacteria must be determined before adding the oxidative stressor, since different compounds generate different types of oxidative stress. This assay could also be modified to test bacterial sensitivity to other compounds. In that case, the compound would be included in the agar plates at various concentrations and the bacteria would be spotted onto the plates as described in the protocol. Differences in colony numbers and size in different dilutions compared to a control plate without the compound would indicate sensitivity to the compound.
We describe three methods to test the effects of NTBC on pyomelanin producing strains of bacteria. First, we use a titration containing various concentrations of NTBC to determine if NTBC will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria, and then determine the minimum concentration of NTBC necessary to do so. The concentration of NTBC that eliminates or reduces pyomelanin production will be used in other assays to determine the effects of NTBC on antibiotic MICs and oxidative stress response. The MIC assay will allow the user to test the effects of NTBC on antibiotic sensitivity. Finally, the spot plate oxidative stress response assay will be used to test the effects of NTBC on sensitivity to oxidative stress.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway10. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin11. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)12, which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway13. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin11. 
We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.
The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa12. Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction. 
The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent12. Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.
Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions14. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.
Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time1, or oxidative stress disc diffusion assays15. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H2O2 and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Also called nitisinone.&amp;nbsp; Soluble in DMSO.</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Stabilized.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr></tbody></table>

methods to inhibit bacterial pyomelanin production and determine the corresponding increase in sensitivity to oxidative stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

NTBC 적정 NTBC가 경찰에 pyomelanin 생산을 줄일 수 있다면 NTBC 적정을 결정하는 데 사용되었다 애 루기 노사, 또한 제거 또는 추가 분석에 사용하기 위해 생산을 감소 pyomelanin NTBC의 농도를 확인한다. 이 다른 복제에서 생성 pyomelanin의 수준에서 변화 될 수 있지만 일반적인 경향은 일정하게 유지 될 수 있습니다. NTBC 적정 분석은 다른 세균 안료 생산에 영향을 미칠 수있는 다른 화합물을 시험하기 위해 수정 될 수있다. 시각적으로 결정되거나 정량화 될 수 표현형 변화가있는 경우에만, 그러나 작동 할 것이다. P.의 pyomelanin 생산 균주의 치료 NTBC와 aeruginosa에 안료 생산 (12)의 농도 의존적 감소의 결과. 그림 2하여 보여줍니다 P.의 다른 균주 이영표의 수준으로 표시된 바와 같이 녹농균은 NTBC에 대한 민감도에 차이가멜라닌 생성. NTBC의 높은 농도는 실험실 변형 hmgA : TN (18) (워싱턴 대학의 PAO1의 트랜스포존 돌연변이 라이브러리)에 비해 (다라 프랭크에서 얻은) 임상 분리의 PA1111 17 년에 생산을 pyomelanin 줄이기 위해 필요했다. NTBC 치료와 색소 침착의 변화를 보이지 않았다 pyomelanin [18 (워싱턴 대학의 PAO1의 트랜스포존 돌연변이 라이브러리) 테네시 (캐리 우드에서 얻은) PAO1 및 HPD :]를 생성하지 않는 균주. 생산을 pyomelanin하는 것은 실질적으로 실험실 변형 hmgA 감소 되었기 때문에 :: TN을 그 농도를 (300 μm의 0 μm의 NTBC 비교)을 사용하여 우리는 우리의 분석 300 μm의 NTBC를 사용하기로 결정했다. 본 연구에 사용 된 모든 균주는 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 저장 하였다. 항생제 MIC가 항생제에 대한 MIC는 여러 가지 방법을 사용하여 시험 할 수있다. 여기에 설명 된 미세 적정 플레이트의 사용 방법을 허용R 항생제 농도 범위를 테스트 및 자원의 최소 사용. 결과를 쉽게 복제 및 분석은 시험 될 유기체의 항생제 감수성의 차이를 허용하도록 변경 될 수있다. 일부 변화는 독립적 인 실험의 사이 볼 수 있으나 경향 상당히 일치한다. 복제 기술은 동일한 MIC를 발휘한다. 표 3은 다른 P. 대한 결과를 나타낸다 aeruginosa의 균주와 NTBC 다양한 아미노 글리코 사이드 항생제없이 치료. 3 개의 독립적 인 콜로니 기재된 방법에 따라 중으로 시험 하였다. MIC가이 세 가지 기술 복제에 박테리아의 성장을 억제 항생제의 가장 낮은 농도로 기록되었다. NTBC 처리 시험 균주에 대한 MIC는 아미노 글리코 사이드에 아무런 영향을 미치지 않았다. 산화 스트레스 자리 플레이트 분석 테스트 산화 스트레스에 대한 현장 플레이트 분석은 reproducibl을 제공합니다H 다른 분석에서 사용 된 것보다 2 O (2)의 낮은 레벨을 사용하여 전자 결과. H 2 O 2가없는 플레이트는 각 균주 희석 시리즈의 정확도를 결정할뿐만 아니라, 응력을 산화하는 세포를 실시하지 않고 콜로니 크기 및 각각의 스폿에서의 콜로니 수를 결정하는 제어 판이다. 첫 번째 자리는 H 2 O 2 무료 매체에 식민지의 셀 수없는 수를 가지는 동안 적절한 희석 시리즈, 마지막 자리는 거의 식민지가 있어야합니다. 희석 시리즈 내의 각각의 지점에서의 콜로니 수의 10 배 차이가 있어야한다. 모든 균주는 시험을 위해, 콜로니의 유사한 숫자는 H 2 O 2 자유 제어 플레이트에 동일한 희석으로 이해되어야한다. 박테리아의 다른 변종은 산화 스트레스에 다른 민감도, 2 O 2 농도가 시험되어야한다 H의 범위를 가질 수있다. H 2 O의 농도를 증가시키는 <suB&gt; 2는 박테리아가 2 O 2에 의한 산화 스트레스 H에 민감한 가정 각 자리에 식민지의 크기와 숫자의 감소로 표시된 바와 같이 성장의 감소 금액을, 보여 주어야한다. 다른 균주의 성장 특성은 특히 H 2 O 2 농도 하에서 산화 적 스트레스에 대한 감도를 결정하기 위해 비교 될 수있다. 분석은 세균이 산화 스트레스에 노출되는 경우에 단일 균주, 예컨대 NTBC 같은 특정 화합물 또는 시약의 효과를 결정하기 위해 수정 될 수있다. 콜로니는 박테리아 콜로니가 다른 실험 조건 형성 유닛 사이의 % 감소를 결정하기 위해 계산 될 수있다. 그림 3은 경찰의 pyomelanin 및 비 pyomelanin 생산 균주의 자리 플레이트 분석을 보여줍니다 aeruginosa에 함께하고 NTBC없이 처리 및 H 2 O 2에 의한 산화 스트레스에 노출. 명확한 differe가있다산화 스트레스에 대한 민감도 생산하는 박테리아를 pyomelanin에 NCE는 NTBC으로 처리하고, 또한 안료를 생산 할 것들에 비해 pyomelanin 생성하지 않는 박테리아 사이에있다. pyomelanin, 자연적 또는 인해 NTBC 처리에 생산하지 않은 균주는 pyomelanin 생산 균주보다 산화 스트레스에 더 민감했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig1.jpg" /> 그림 1 :. 항생제 MIC 분석 96 웰 플레이트의 도식은 설정 (A)를 시작하는 최고 농도의 2 배 항생제 100 ㎕는 H를 통해 B는 LB + NTBC 또는 LB 중 50 μL로 가득 행 A. 행에 + 항생제없이 DMSO. (B) 두 배 희석액을 각각 웰 배속 원하는 최종 농도로 희석 된 50㎕의 항생제의 결과, G의 행을 통해 수행된다. 행 H는 B 잘 제어 할 수 있습니다항생제없이 acterial 성장. LB 또는 접종 물 50 ㎕의 최종 농도로 항생제 두 배 희석 적절한 웰에 첨가한다. LB는 항생제의 세균 오염에 대한 제어 역할을합니다. GM, 겐타 마이신; km, 카나마이신; 돕, 토 브라 마이신. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig2.jpg" /> 그림 2 : pyomelanin 생산자와 P.의 비 생산의 NTBC 적정 녹농균. NTBC 실험실 및 임상 pyomelanin 생산자에 용량 의존적으로 생산 pyomelanin 감소하지만 pyomelanin를 생산하지 않는 균주 안료 생산에 아무런 영향을 미치지 않았다. 참조 (12)로부터 수정. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53105/53105fig3.jpg" /> 그림 3 : 산화 스트레스 반응에 대한 스팟 플레이트 분석 박테리아 균주가 희석했다.동일한 OD 600 (D), 직렬 10 배 희석하고, H 2 O (2)의 여러 농도를 포함하는 LB 플레이트 상에 발견. 0 mM의 H 2 O 2 판의 결과는 다른 균주에 대해 동일한 희석 지점의 각 식민지의 비슷한 숫자로 나타낸 바와 같이 모든 균주가 제대로 희석 ​​된 것으로 나타났다. 균주는 H 2 O 2 농도의 산화 스트레스에 더 민감했다 H 2 O 2 표시를 포함하는 플레이트를 증가시켰다. 이것은 아니오 H 2 O 2 조건뿐만 아니라, 콜로니 크기의 감소에 비해 스폿의 감소 집락에 의해 표시된다. 참조 (12)로부터 수정. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NTBC (μM)의 최종 농도 </td><td> NTBC (75.9 mM)을 추가 (μL)의 볼륨 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 50 &lt;/ TD&gt; <td> 0.659 </td></tr><tr><td> (100) </td><td> 1.318 </td></tr><tr><td> (200) </td><td> 2.64 </td></tr><tr><td> (300) </td><td> 3.95 </td></tr><tr><td> (600) </td><td> 7.91 </td></tr><tr><td> (900) </td><td> 11.86 </td></tr></tbody></table> 표 1 :이 표는 다양한 NTBC 농도와 NTBC 주식의 해당 금액을 제공합니다 (LB)에 적정을 설정하는 NTBC 농도는 1 ml의 (LB)에 추가 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> H의 최종 농도 2 O 2 (MM) </td><td> 9.79 MH 2 O 2 (30 % 중량)의 양 추가 (μL) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 2.04 </td></tr><tr><td> 0.4 </td><td> 4.09 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 6.13 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 8.17 </td></tr><html><tr><td> 1 </td><td> 10.21 </td></tr></tbody></table> 표 2 :. H 2 O 2의 농도는 산화 스트레스 자리 플레이트 분석을 위해 LB 한천에 추가 할이 표는 다양한 H 2 O 2 농도 및 2 O 2 주식은 100 ㎖ LB 한천에 추가 할 집중 H의 해당 금액을 제공합니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td class="xl63"></td><td class="xl65"> PAO1 - NTBC </td><td class="xl65"> PAO1 + NTBC </td><td class="xl66"> hmgA : TN - NTBC </td><td class="xl66"> hmgA : TN + NTBC </td><td class="xl66"> HPD : TN - NTBC </td><td class="xl66"> HPD : TN + NTBC </td><td class="xl65"> PA1111 - NTBC </td>&quot;L65&gt; PA1111 + NTBC </td></tr><tr><td> 겐타 마이신 </td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> (2) </td><td class="xl64"> (2) </td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 1 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td></tr><tr><td> 카나마이신 </td><td class="xl64"> (16) </td><td class="xl64"> 8 </td><td class="xl64"> (32) </td><td class="xl64"> (32) </td><td class="xl64"> (32) </td><td class="xl64"> (32) </td><td class="xl64"> (16) </td><td class="xl64"> (16) </td></tr><tr><td> 토 브라 마이신 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.25 </td><td class="xl64"> 0.25 </td><td class="xl64"> 0.5 </td><td class="xl64"> 0.5 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 항생제 MIC 결과 3 개의 독립적 인 식민지 각 STRA에 대한 중으로 시험 하였다.인치 기준 (12)로부터 허가를 재 인쇄.

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Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

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Immunology and Infection

8.1K 조회수.  University of Wisconsin Milwaukee. Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

연구

암 연구학

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

생화학

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1 receptor, a Gs-coupled signaling protein found on the surface of melanocytes. Mc1r stimulates adenylyl cyclase and cAMP production which, in turn, up-regulates melanocytic production of melanin in the skin. In order to study the mechanisms by which Mc1r signaling protects the skin against UV injury, this study relies on a mouse model with "humanized skin" based on epidermal expression of stem cell factor (Scf). K14-Scf transgenic mice retain melanocytes in the epidermis and therefore have the ability to deposit melanin in the epidermis. In this animal model, wild type Mc1r status results in robust deposition of black eumelanin pigment and a UV-protected phenotype. In contrast, K14-Scf animals with defective Mc1r signaling ability exhibit a red/blonde pigmentation, very little eumelanin in the skin and a UV-sensitive phenotype. Reasoning that eumelanin deposition might be enhanced by topical agents that mimic Mc1r signaling, we found that direct application of forskolin extract to the skin of Mc1r-defective fair-skinned mice resulted in robust eumelanin induction and UV protection 1. Here we describe the method for preparing and applying a forskolin-containing natural root extract to K14-Scf fair-skinned mice and report a method for measuring UV sensitivity by determining minimal erythematous dose (MED). Using this animal model, it is possible to study how epidermal cAMP induction and melanization of the skin affect physiologic responses to UV exposure.

Epidermal melanin is induced by topical application of forskolin in a murine model of the fair-skinned UV-sensitive human. Pharmacologic manipulation of cAMP levels in the skin and epidermal darkening strongly protect against UV-mediated inflammation (sunburn) as measured by the minimum erythematous dose (MED) assay.

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

의학

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as UV protective agents, skincare, cosmetics etc. A marine Pseudomonas stutzeri produces melanin without the addition of tyrosine. The feedback inhibition was observed by melanin in the culture of a melanin-producing marine bacterium, Pseudomonas stutzeri. Melanin also demonstrated microbial growth inhibition. The Han-Levenspiel model-based analysis identified uncompetitive type product inhibition of melanin on the cell growth. Tyrosinase enzyme, which produces melanin, was inhibited by melanin. The double reciprocal plot of the enzymatic reaction in the presence of different melanin concentrations revealed uncompetitive product inhibition. An adsorbent-based adsorptive bioprocess was developed to reduce the feedback inhibition by melanin. Different adsorbents were screened to select the best adsorbent for melanin adsorption. Dosage amount and time were optimized to develop the adsorptive bioprocess, which resulted in an 8.8-fold enhancement in melanin production by the marine bacteria Pseudomonas stutzeri (153 mg/L to 1349 mg/L) without supplementation of tyrosine and yeast extract.

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Here we present a protocol on adsorptive bioprocess to produce a biological product, especially a pigment that inhibits its own biosynthesis and inhibits the growth of the microorganism that produces it.

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as ...

공학

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

생물학

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

A Spot Plate Assay for Evaluating Oxidative Stress Responses in Bacterial Strains

Source: Ketelboeter, L. M. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53105">Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a spot plate assay tailored to assess the oxidative stress responses of bacterial strains. Some strains produce pyomelanin, an antioxidant pigment. Conversely, strains treated with a test agent, leading to reduced pyomelanin production, exhibit increased susceptibility to oxidative stress, resulting in decreased cell viability compared to pyomelanin-producing strains.

박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

1. Preparation of Culture Media, Antibiotics, and 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)

	Make Luria-Bertani (LB) broth (1% ...

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay