Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

동물 실험 의학 (FEM, 샤리 테, 베를린, 독일)의 시설에 보관하고, 모든 실험 프로토콜을 검토하고, 국가 보건 및 지역 담당 사무소 (LAGeSo, 베를린, 독일의 승인을 하였다. 등록 번호 O 0365 / 11). 1. 간 수확 <ol><li> 수술 전 준비 <ol><li> 고정을 위해 코르크 판을 사용합니다. 접시에 의료 드레이프를 넣어. 네 바늘을 사용하여, 수술 흡입 마취의 코르크 판에 흡입 마스크를 고정한다. </li></ol></li><li> 포털 정맥 정맥의 사전 약속 <ol><li> 세 방향 꼭지에 말초 정맥 카테터 (G 20)을 연결합니다. 정맥 카테터는 약의 길이, 비스듬히 절단한다. 1.5 cm. </li><li> 드 에어 링거 용액으로 가득 10 ML의 주사기를 사용하여 시스템. 그것은 신중하게 해제 공기 가스 색전증 부정적인 관류 탈세 포화에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요하다. </li></ol></li><li> 사전 약속동맥 정맥의 <ol><li> 나비 캐 뉼러를 사용하여 5 mm의 길이로 절단 바늘. 5mm 바늘과 superglue로 수정, 5cm 튜브 (외경 0.96 mm ID 0.58 mm)를 장착한다. 더 큰 튜브에와 superglue로 수정, 2cm 길이의 튜브 (외경 0.61 mm ID 0.28 mm)를 삽입합니다. </li><li> 교대로이 공사를 통해 다른 튜브를 미끄러 superglue로 고정합니다. 드 에어 링거 용액으로 채워진 5 ML의 주사기와 동맥 정맥. </li></ol></li><li> 마취와 진통 <ol><li> 1.5 L / min의 유량으로 산소를 3.5 %의 이소 플루 란으로 마취 유도 챔버에서 래트 마취를 유도한다. </li><li> 운전시 안전 진통을 보장하기 위해, 복강 metamizol (100 ㎎ / ㎏ 신체 질량)과 저용량 케타민 / 메데 토미 (kg의 신체 질량 당 10 밀리그램 / 0.1 mg)을 주입. </li><li> 수술 마취 이후의 유지 보수를 위해 흡입 마스크를 통해 1 L / 분 산소 1.5 % 이소 플루 란를 제공합니다. </li></ol></li><li> 수술 전 약정 &lt;OL&gt; <li> 전기 전단 기계와 자유주의로 복부를 면도. 소독 용 70 % 에탄올로 복부에 면도​​ 절개 사이트를 적셔. </li><li> , 준비된 접시에 앙와위에서 동물을 배치 흡입 마스크에 머리를 삽입하고 의료 테이프와 핀 사지를 고정합니다. 거즈 압축과 초과 에탄올과 모피를 제거합니다. </li></ol></li><li> 마취 평가 <ol><li> 호흡을 보면서 마취 깊이를 평가합니다. 마취가 (40 ~ 60 호흡 / 분)만큼 깊은 것 같다 때, 진통 두 뒷다리의 발가락 사이의 피부를 꼬집어하는 수술 집게를 사용하여 발가락 핀치 반사를 트리거하기 위해 시도하여 충분한 지 여부를 확인합니다. </li></ol></li><li> 복부 접근 <ol><li> 방광 위 꼬리 복부 벽에 중간 절개를합니다. V 자형 방식으로 양측 늑골 아치에이 시점에서 잘라. 다이어프램으로 잘라 않도록주의하십시오. 가슴 위에 잘라 복부 벽을 당깁니다. </li&gt; <li> , overholt 클램프와 칼 모양의 수정 두개쪽으로 당겨과 고무 밴드로 고정합니다. 장을 대피 젖은 면봉을 사용합니다. 젖은 거즈 붕대에 장을 감싸. 또한, 젖은 붕대 모든 복부 마진을 커버합니다. </li></ol></li><li> 간 준비 <ol><li> 낫 모양의 인대를 해부하다. 두개쪽으로 다이어프램의 돔 아래 중간과 왼쪽 간 로브를 개최 젖은 거즈 붕대를 사용합니다. hepatoduodenal 인대와 상부 대망 간 로브 노출됩니다. </li><li> 로브가 이동 될 때까지 조심스럽게 상단 대망 로브에 부착 된 인대를 해부하는 두 microforceps 봄 가위를 사용합니다. 대신에 중간과 왼쪽 엽을 잡고, 거즈 압축에서 젖은 면봉을 사용하여 로브를 이동합니다. </li><li> 위 대망 간 엽의 동원 후, 왼쪽으로 배를 이동합니다. 클램프와 위장을 수정하고 microforceps 및 스프링 가위로 작은 대망을 해부하다. </li><li> 낮은 omenta를 동원L 간 엽이 이동하고 이후에 그 구멍에 다시 로브를 이동시킬 때까지. 십이지장을 유지하기 위해 박하우스 클램프를 사용합니다. 스트레칭과 hepatoduodenal 인대를 노출 왼쪽으로 십이지장을 이동합니다. 뻗어 hepatoduodenal 인대의 담관을 외접. </li><li> 지방 및 췌장 조직에서 담관을 해부하다. 담관에게 담관 분기에서 1.5 cm를 잘라. 주위의 지방 조직에서 문맥을 해부. 십이지장 정맥을 노출. </li><li> 실크 6-0로 두 번 십이지장 정맥을 결찰하고 2 합자 사이의 정맥을 나눕니다. 모든 동맥 라미가 공개 될 때까지 주변 조직에서 복강 트렁크 및 공통 간 동맥을 해부하다. </li><li> 주변 조직으로부터 십이지장 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 십이지장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 십이지장 동맥을 해부하다. </li><li> 비장 동맥을 해방주변 조직으로부터. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 비장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 비장 동맥을 해부하다. </li><li> 주변 조직으로부터 왼쪽 위 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 왼쪽 위 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 동맥을 해부하다. </li><li> 오른쪽 신장과 오른쪽 측면 간 엽 사이의 열등한 대정맥 정맥을 외접. 복막 공간에서 정맥을 해부하다. 복강 트렁크에 따라 대동맥을 노출. </li><li> 복막 지방 조직을 해부하다. 하대 정맥에 1 ml의 생리 식염수 1,000 IE의 헤파린을 주입한다. 캐 뉼러를 후퇴와 화장 솜에 절개를 닫습니다. 헤파린의 전신 효과를 1-2 분을 기다립니다. </li><li> 집게로 대동맥을 외접. 대동맥을 해부하고 쥐에게서 피를 뽑다. 또한, 신장에서 원심 하대 정맥을 해부하다. </li></ol></li><li> 포털 정맥로 (사용 섹션 1.2에서 제조 된 정맥) <ol><li> 말단 포털 정맥에 물고기 입 절개를합니다. 집게로 절개를 열고 포털 정맥을 cannulate. 간 탈색 될 때까지 20 ㎖ 링거 용액으로 간을 세척 및 합자 (실크 6-0)와 캐 뉼러를 해결. </li></ol></li><li> 동맥 캐 뉼러 (사용 섹션 1.3에서 제조 된 정맥) <ol><li> 복강 트렁크 위의 대동맥을 해부하다. 복막 공간에서 대동맥 세그먼트를 해방. 대동맥 패치를 생성하기 위해 길이 방향으로 대동맥 세그먼트를 잘라. 정적 홀더에 자체 내장 캐뉼라를 삽입합니다. </li><li> 캐 뉼러를 통해 대동맥 패치를 미끄러 2 집게를 사용합니다. 정맥을 통해 실크 6-0로 간 동맥을 결찰하고 지대치에 패치를 수정합니다. </li></ol></li><li> 간 외식 <ol><li> 다이어프램을 열고 원형 절개를 주변 구조에서 간을 해부하다. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> 스토사용할 때까지 350 ml의 링거 용액으로 가득 멸균 500ml의 탱크에 간 재. </li></ol></li></ol> 2. 세제 솔루션 <ol><li> 10 % 트리톤 X-100 원액 <ol><li> 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 100 ml의 트리톤 X-100 (99,9 %)를 추가합니다. 트리톤 X-100을 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지. </li></ol></li><li> 1 % 트리톤 X-100 <ol><li> 1000 ㎖의 병에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)를 첨가. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % 트리톤 X-100 용액 필터. </li></ol></li><li> 10 % SDS 원액 <ol><li> 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 과 66.99 g을 SDS (99.9 %, 밀도 0.67)를 추가합니다. SDS를 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지. </li></ol></li><li> 1 % SDS <ol><li> 1000 ml의 봇에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)을 추가TLE. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % SDS 용액을 필터. </li></ol></li></ol> 3. 탈세 포화 <ol><li> 관류 장치의 설정 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> 그림 1 :. 진동 압력 조건에서 선택적 동맥과 네 쥐 간을 포털 정맥 관류에 대한 관류 장치의 제도 (. Struecker 등에서 수정 14) <ol><li> 삼방 콕 및 충전 레벨을 조절하고 500 mL의 0.9 % NaCl로 반응기를 채우기 위해 Heidelberger 확장 드레인에 링크. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> 그림 2. (4) 포털 정맥 액세스 통해 버블 트랩 (5) (2) 또는 동맥 AC 통해 선단 관류 셋업의 반응식 관류 챔버를 연결 (1,400cm 3) (1)운 (3). 기포 트랩 (5)의 말단부에서 폐색 (4) 및 배출구 (6)를 구비한다. Heidelberger 확장 (7)에 버블 트랩 (5)를 연결합니다. 펌프 세그먼트 (8)에 Heidelberger 확장을 연결합니다. 또한, 다른 Heidelberger 확장 (9)에 펌프 세그먼트 (8)를 연결합니다. 세제 (10)의 병에 마지막 Heidelberger 확장 (9)를 삽입합니다. (관류 또는 다수의 경우에 압력 유통로) 관류 챔버에 마스크 (11)를 연결한다. 반응기 유체를 배출, 폐기물 용기 (12)에 대한 유출을 연결한다. <ol><li> 펌프로 펌프 세그먼트를 삽입합니다. PBS로주기를 채우기 위해 펌프를 시작, 버블 트랩의 선단을 닫고 환기를 엽니 다. 거품의 바닥 안전하게 PBS (2-3 CM)으로 피복되는 경우, 벤트를 닫고 버블 트랩의 말단부를 연다. </li><li> 간 설치 <ol><li> 관련 반응기 액세스 문맥 캐 뉼러의 삼방 콕 링크. C동맥 액세스 동맥 정맥 connect를. 공기가 시스템에 입력하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 진동 압력 조건의 적용 <ol><li> 15 BPM의 주파수 및 26 밀리바 (분. 4 밀리바, 최대. 30 밀리바)의 진폭 호흡기를 사용합니다. 압력 분포 챔버로 호흡기를 연결하고 반응기 챔버를 연결합니다. 압력 응용 프로그램을 시작합니다. </li></ol></li><li> 탈세 포화 프로토콜 <ol><li> / 분 5 ㎖의 유속으로 관류 단계를 수행한다. 90 분 동안 1 % 트리톤 X-100 간 관류와 탈세 포화를 시작합니다. 관류 챔버 내부 상수 및 관류 된 간 상기 오일 레벨을 유지하기 위해 관류 장치의 유출을 통해 폐기 유출 물을 허용. 90 분 후, 1 % SDS에 세제를 변경합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;P&gt; 그림 3 : 모든 실험 그룹의 관류 프로토콜.

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	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. 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Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

쥐의 간 수확 및 탈세 포화에 대한 발표 기술은 쉽게 재현 할 수 있지만, 고려해야 할 중요한 특정 단계가 있습니다 : 이 혈액 응고를 활성화하고 간 내 혈전 형성으로 이어질 수 있기 때문에 간 수확을 준비하는 동안, 그것은 심한 출혈을 방지하는 것이 중요하다. 우리의 의견으로, 그 문맥을 통해 관류 동안 간동맥을 통해 혈액의 유입을 방지하기 위해 포털 정맥 삽관 직전 복부 대동맥을 절개하는 것이 바람직하다. 간이 삽관 명확 관류되면, 혈전 형성이 더 이상 문제가 없다. 관류 원형으로 가스 기포의 유입 가스 색전증을 방지하기 위해 회피되어야하기 때문에 관류 장치 간 교통 수확 후 관류 장치 간 연결의 특히 중요한 공정이다. 또한, 삼방 밸브를 미리 기입하는 것이 유용하다 IPBS를 관류 시스템에 밸브를 연결하기 전에 직접 주사기 및 얇은 캐뉼라를 사용하여, 캐 뉼러 간 접속 s는. 관류가 설립 된 후, 모든 튜브 커넥터 여부, 밸브 및 튜브가 완벽하게 연결되는 세 방향을 다시 확인해야합니다. 간은 더 이상 기간에 대한 관류하는 경우 (예 :., O / N)는 관련도 작은 오류 따라서 치명적인 관류 결과로 이어지는, 관류 시스템에 빨아 공기로 이어질 수 있습니다. 제시된 데이터는 최선의 탈세 포화 결과에 대한 진동 압력 변화의 최적 압력과 주파수가 불분명한다는 사실에 의해 제한된다. 또한, 압력 제어 관류 흐름 제어 관류가보다 더 더 안정적인 결과를 초래할 수있다. 압력 제어 관류는 동일한 결과와 다른 크기 및 무게의 간 한 관류 프로토콜의 응용을 가능하게 흐를 자동 B 때문에전자는 적응. 간동맥과 문맥 크기와 생리적 흐름 속도면에서 크게 다르다. 따라서, 일정한 관류 레이트 (5 ㎖ / 분)를 확실히 두 혈관 시스템 내의 다른 관류 압력을 초래할 것이다. 마찬가지로, 일정한 관류 압력이 다른 관류 요금 발생합니다. 두 경로를 통해 관류 탈세 포화 효능을 비교하기위한 한 가지 방법은 두 경로를 통해 생리 관류 압력 또는 관류 속도로 관류를 수행하는 것이다. 그러나, 본 연구의 결과를 비교하기 위해, 우리는 두 경로에 대한 일정한 관류 속도를 선택했다. 불행히도, 우리의 장치를 사용하여, 우리는 관류 된 간 내의 관류 압을 측정 할 수 없었다. 차세대 관류 장치는 필요한 관류 매체의 양을 최소화하기 위해 작아야한다. 또한, 펌프 장치는 압력 제어 관류를 사용한다. 목전자 제시된 기술은 재현성, 균일 한 쥐의 간 탈세 포화에 매우 유용 나타납니다. 제시된 기술은 체외에서 recellularization 및 장기 숙성에 적합 여부는 추가로 해결해야합니다. 진동 압력 조건이 다시 채워 셀에 영향이 있는지 추가 실험의 대상이 될 것이다. 제시된 기술은 다른 쥐의 간 관류 장치보다 더 정교하고 몇 가지 분명한 장점을 보여줍니다 진동 압력 조건이 적용되는 경우 1) 균일 한 탈세 포화가 좋은 결과로 재현. 2) 관류 장치 밀봉하고 매트릭스 다시 채우기 장기 관류를위한 필수 조건이다 멸균 탈세 포화를 가능하게한다. 3) 제시된 프로토콜은 다른 프로토콜로 출판보다 짧다 여전히 매우 효과적이다. 문맥과 간동맥 4) 선택적 관류가 서로 다른 시스템을 통해 선택적 세포 다시 채우기가 가능한 렌더링,하는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 관류 장치 다듬고 쥐 간 탈세 포화를 최적화하기 위해 상기 탈세 포화 실험에서 적용된다. 압력 제어 관류의 효과는 실험적으로 평가 관류 흐름 제어와 비교한다. 상기 원소의 첨가 (예., &quot;투석 장치」열교환 형산) 다시 채우기, 성숙 배양 실험은 상기 표시 장치를 개발하는 것이 가능하고 합리적인 나타난다.

탈세 포화하고 recellularization 시험관에 1 작용 성, 이식 가능한 장기의 생성을 가능하게 할 수있다. 제거 세포와 항원 물질에 의해 (예., DNA는 알파 - 갈 에피토프)에서 기관은 이하 비 - 면역 세포 외 기질 (ECM)을 얻을 수있다. 이 행렬은 기관의 입체 microanatomy을 보존하고 다른 가능성이 이종 기원의 세포 다시 채우기위한 이상적인 biomatrix로서 역할을 할 수있다. 따라서, 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스는 인간 간 세포 증식을 할 수있다. 이 인간화 마이크로 간 질환 (예., 선천성 대사 질환, 바이러스 성 질환 또는 악성 종양) 또는 전임상 제약 테스트 3에 대한 연구를위한 생체 모델이 될 수 있습니다. 쥐의 간 관류 탈세 포화에 대한 몇 가지 다른 프로토콜은 이미 4-13 발표되었다. 모든 프로토콜에서, decellular화는 유관 간문맥 통해 알칼리 이온 성 또는 비이 온성 세제의 관류에 의해 달성 하였다. 우리가 아는 한, 우리는 문맥 및 / 또는 쥐 간 동맥 (14)를 통해 선택적 관류에 의해 쥐의 간 탈세 포화를보고 첫 번째 그룹이었다. 간에서 서로 다른 혈관 시스템의 선택적 관류 활성화 셀룰러 다시 채우기에 중요한 역할을 할 수 있고, 또한, 더 나은 결과 탈세 포화를 가능하게하고있다. 여기에서 설명 된 연구에서, 간은 진동 압력 조건 하에서 관류있게 주문품 독점 관류 장치로 관류 하였다. 이러한 압력 조건은 간 생리적 호흡기 의존 관류 모방 : 시츄, 간은 호흡 운동시 간 혈류에 직접적인 영향을 다이어프램의 접합부 아래에 건다. 영감은 특히 최적화, 다이어프램의 저하 및 간 압박에 이르게간세포 정맥 유출 반면 만료 간 상승 및 포털 정맥 유입 15을 최적화하기 복강 내 압력의 저하로 연결. 우리의 목표는 진동 압력 조건은 복강 내 조건 생체를 모방하여 쥐의 간 관류 탈세 포화의 동질성에 영향이 있는지 여부를 알아보고자 하였다. 탈세 포화 과정의 균질성 관류 탈세 포화의 과소 평가 요소 일 수있다. 알려진 모든 에이전트는 ECM에 간 탈세 포화 원인 변경에 사용됩니다. 다른 영역이 이미 완전히 탈세 포화되는 반면 저조한 관류 영역의 세포는 ECM 내에 남아있다. 남아있는 세포를 용해, 관류 시간 또는 압력은 잘 관류 부위에 더 많은 변경을 일으키는 상승되어야한다. 따라서, 탈세 포화에 대한 세제는 기관 내에서 균일하게 분산되어야한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

균질성 따라서 다른 탈세 포화 프로토콜의 효과를 육안 관찰, 조직 학적 분석, 탈세 포화 간 매트릭스 내의 나머지 DNA 함량 분석에 의해 평가 하였다. 또한, 부식 주조 탈세 포화 후 간 손상의 microanatomy을 시각화 하였다. Macroscopy 탈세 포화 동안, 간 세포는 콘텐츠의 제거를 나타내는, 루슨트된다. 문맥을 통해 관류 된 간을 탈세 포화 동안 및 (흰색 화살표) 후에 육안 가시 나머지 세포, 불균일 해명 (따라서 탈세 포화)를 보였다. 간동맥을 통해 관류 간은보다 균일 한 탈세 포화 코스와 눈에 보이는 남아있는 세포를 보였다. 간은 진동 압력 조건의 적용을 관류 한 경우, 나머지 세포는 무관 관류 경로 보이지 않았다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> 그림 4 : 압력 조건을 진동없이 쥐 간 탈세 포화의 육안 결과. 왼쪽 : 간동맥을 통해 탈세 포화 된 쥐의 간. 간은 거시적으로 볼 남아있는 세포없이, 루슨트 나타납니다. 오른쪽 : 포털 정맥을 통해 관류 간. 간은 비균질 거시적으로 볼 수 세포, 탈세 포화 나타납니다 <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig5.jpg" /> 그림 5 : 진동 압력 조건에서 쥐 간 탈세 포화의 육안 결과. 왼쪽 : 간동맥을 통해 탈세 포화 된 쥐의 간. 오른쪽 : 포털 정맥을 통해 관류 간. 모두 간은 눈에 보이는 나머지 세포없이, 루슨트 나타납니다. 조직 학적 평가 탈세 포화 간 매트릭스 지지체의 조직 학적 평가ED는 거시적 인 결과. 간동맥을 통해 관류 된 간을 상관없이 그들이 진동 압력 조건 하에서 관류 여부, 더 남은 세포가 없었다. 문맥을 통해 관류 된 간을 그들이 진동 압력 조건의 적용을 관류 하였다하더라도, 나머지 셀의 영역을 나타내었다. 그러나, 진동 압력 조건의 적용은 문맥을 통해 관류 된 간에서 나머지 셀 질량을 감소시켰다. 간의 ECM은 모든 적용 프로토콜에 걸쳐 눈에 보이는 차이없이, 보존되었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig6.jpg" /> 그림 6 : H / 탈세 포화 간 매트릭스의 E 염색. AP : 압력 조건을 진동없이 간동맥을 통해 관류 탈세 포화 간 매트릭스. + P : 진동 압력 조건 하에서 간동맥을 통해 관류 탈세 포화 간 매트릭스. PA-P : 탈세 포화 간 MATRIX 압력 조건을 진동없이 간문맥 통해 관류. PA + P : 진동 압력 조건에서 문맥을 통해 관류 된 간 탈세 포화 된 매트릭스. 화살표 : 세포 클러스터를 남은. DNA 콘텐츠 차이는 통계적으로 유의 한 진동 압력 조건 (; + P 태양 광 발전 + P)에서 관류 그룹에 있었지만 간 매트릭스의 건조 중량 당 DNA 함량은 기본 간에 비해 모든 실험군에서 감소했다. 건조 중량 당 DNA의 가장 낮은 금액은 진동 압력 조건에서 간동맥을 통해 관류 간에서 발견되었다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig7.jpg" /> 그림 7 : (. Struecker 등 14 수정) 간 매트릭스의 DNA 콘텐츠 당 건조 중량. 간동맥 쇼를 통해 탈세 포화 간 적은 그 관류보다 DNA가 남아있는포털을 통해 d를 할 정 맥. 진동 압력 조건에서 관류 간은 할이 조건없이 탈세 포화 된 것보다 적은 나머지 DNA를 보여줍니다. 따라서, 진동 압력 조건 하에서 간동맥을 통해 관류 된 간은 최소 잔존 DNA 함량을 나타낸다. 부식 주조 탈세 포화 간 행렬들의 부식 캐스팅 (포털 정맥 시스템의 단백질 골격, 동맥 시스템 및 담즙 시스템 포함)의 간 microanatomy 탈세 포화 과정이 보존되어 있음을 확인. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig8.jpg" /> 그림 8 : (. Struecker 등 14 수정) 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스의 부식 주조의 사진. 모든 셀의 제거에도 불구하고, 포털 정맥 (청색) 동맥 (적색) 시스템을 포함한 기관의 microanatomy는 보존된다. REMA담즙 시스템의 ining 주요 지점은 노란색으로 주조된다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /> 표 1 : 진동 압력 조건의 효과 및 쥐 간 탈세 포화에 관류 경로를 평가하기위한 실험 그룹.

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Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Bioengineering

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

생화학

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

공학

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

쥐 포탈 섬유아 세포의 분리에 의한<em&gt; 현장에서</em&gt; 간 재관류

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

생물학

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

의학

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...