Name: isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
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ZG는 이스라엘 과학 재단 (부여 번호 11분의 41)의 I-CORE 프로그램에서 보조금 지원, Abisch-Frenkel 재단, Rosetrees 신뢰, 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상) 및 관심사 재단. ZGF가 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF - 연구 경력 개발 상)에서 보조금 지원, 건강의 이스라엘 정부와 이스라엘 폐 협회의 수석 과학자.

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The authors have nothing to disclose.

호중구는 모든 백혈구 가장 풍부하며, 감염 및 염증의 경우 최초 대응한다. 이와 같이, 이들은 외부 큐에 매우 민감하고 쉽게 활성화된다. 또한, 호중구는 매우 짧은 반감기 및 빠른 회전율을 갖는다. 함께, 이러한 특성은 독특한 실험적인 전략이 필요되도록 호중구, 작업에 여러 가지 어려움을 올립니다. 예를 들어, 여러 호중구 정화 전략은 자신의 장점과 단점 각이있다. 호중구 작업에서 중요한 단계는 전체 혈액에서 자신의 정화입니다. 호중구 효율적 밀도 구배 또는 항체 기반 전략 (양 또는 음의 선택)을 사용하여 정제 할 수있다. 그것은 최소 비특이적 활성화와 고순도 호중구 높은 수치를 산출 이후 우리가 선택한 방법은 밀도 구배를 사용하는 것이다. 그러나, 우리는 최근의 연구 (21)에 표시로, 재치H 종양 진행 호중구 단핵 저밀도 분획 높은 번호에 축적된다. 밀도 구배의 사용은 고순도, 고밀도 호중구 분획을 제공하는 이러한 조건에서 그 전체를 순환하는 호중구 레퍼토리와 크게 다른 단핵 세포 (림프구 및 단핵구)로 오염되는 저밀도 호중구 분획을 대표하지 않는다. 이러한 상황에서의 선택의 방법은 항체 - 기반 정제, 음성 선별 바람직하다. 호중구를 정화하는 항체의 사용은 고순도 호중구를 산출 나은 전체 순환하는 호중구 레파토리를 나타낸다. 그러나, 우리는 중성 백혈구가 항체, 비 특​​정 활성화 증가에 대한 기회와 함께 배양하는 긴 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 최선의 결과를 위해, 항체 기반 호중구 정화가 가능한 한 빨리 수행되어야하는 것이 좋습니다. 항체 - 기초 호중구 정제는 또한 PU 선택 방법조직이나 종양에서 호중구를 rifying. 에 관계없이 선택한 정화 절차, 순도, 생존 및 기능의 무결성을 엄격하게 평가해야합니다. 호중구의 순도는 호중구 표면 마커와 반응하는 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정될 수있다. 표현형 - 마우스에서 LY-6G는 CD11b를 + LY-6C 낮은 LY-6G + F4 / 80을 특징으로 호중구, 특정입니다. 인간의 호중구는 LY-6G 유사한 마커를 표현하지 않고 자주는 CD11b, CD15, CD16, 및 CD66b의 발현을 특징으로한다. 호중구의 Fc 수용체를 갖고 있으므로, 이것들은 면역 염색 전에 차단 될 필요가있다. 호중구는 더 높은 SSC를 가짐으로써 다른 백혈구 구별 될 수있다. 생존력 정제 공정의 끝에서 결정되어야한다 (청색 프로토콜 2.1 트리 판) 98 %보다 일관되게 더 커야. 기능 무결성 푸리에 의해 결정되어야한다순진 마​​우스에서 호중구의 문법 없애기. 이 호중구 활성화 및 종양 세포 (프로토콜 7)와 공동 문화 설정에서 종양이 동반 된 호중구 비 세포 독성 제어를 제공하지 않습니다. 호중구의 낮은 번호와 함께 혈액 호중구의 짧은 반감기 (~ 3-5 10 5 ×) 순진한 (6) 1 ml의 혈액에서 달성 - 8 주 이전 마우스, 마우스 혈액 호중구의 기능을 탐구하기 어렵게 만들었다 체외. 호중구 번호는 만성 염증 (7)의 상태를 나타내는 암, 꾸준히 염증의 상태에 때때로 증가. 일부 연구자들은 골수 20 호중구 대체 소스를 찾기 위해 노력했다. 식염수에 1 ㎎ / ㎖ 모산 액 1 3 % 티오 글리콜 레이트 브로 쓰 용액 또는 용액 1 ml를 복강 내 주사 한 후 24 시간 - 마우스 호중구의 수가 많으면 4에서 얻을 수있다. 그러나이 유발 호중구을 발휘하지뉴욕 항 종양 활동 (게시되지 않은 관찰). . 4 주 - 40000000 혈액 호중구 쉽게 1 ml의 혈액 3에서 고립 될 수있다 - Granot 등 6 BALB / c 마우스는 그 20 시간 (그림 2A)에 악화 호중구을 개발, 마우스 4T1 유방암과 동소 접종 관찰 후 종양 접종. 이러한 호중구 항암 활동을 획득하고 이에 따라 나이브 호중구 (도 2B)과 구별하기 위해, 종양 혼입 호중구 (TEN)을 지칭하고있다. 고밀도 호중구 (HDN)이 높은 항 종양이지만, 암의 문맥에서 생성 저밀도 호중구 (LDN)은 21이 아니다. 골수 종양 - 함유 마우스의 비장에서 고밀도 호중구는 항 종양 활성 (미공개 데이터)를 갖는다. 그것은에서 함께, 종양 진행과 비장 서서히 확대 (비장)를하게 주목해야한다호중구의 양 주름. 입양 전송 다음 호중구의 운명을 추적하기 위해, 이러한 표시하여야 할 필요가있다. 호중구 2 일간 격리하기 전에 종양 베어링 또는 순진 마우스에 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)를 주입하여 생체 내에서 표시 할 수 있습니다. BrdU의 세포 증식에​​ 새로 합성 된 DNA 내로 통합된다 DNA 전구체 티미 딘의 아날로그이다. 호중구의 경우, BrdU의 성숙한 후 유사 분열 호중구로 분화 될 때 BrdU의 염색을 유지 전구 세포 증식에​​ 혼입 될 것이다. BrdU의 혼입은 특정한 항 BrdU의 형광 항체를 이용하여 염색 할 수있다. BrdU의 + 세포를 유세포 분석기로 분석 할 수있다. 또 다른 방법은 5- 카복시 N 숙신 에스테르 (CFSE)로서 셀 추적기 염료 절연 호중구 라벨이다. CFSE 생존 세포는 세포막을 통과 할 수 에스테르 화합물이다. 그것은 아미노 반응 succinimid이세포 및 세포 표면 단백질 및 기타 아미노기로 형광의 공유 결합에 이르게 일 기. CFSE 표지 된 세포는 488nm의 아르곤 레이저를 이용하여 유세포 분석 될 수있다. 두 라벨링 기술의 BrdU 라벨링 CFSE 모든 호중구 얼룩하는 반면, 표지 될 모든 순환하는 호중구를 전구 세포 증식과하지에 의존한다는 사실은 다르다. CFSE의 검출은 그러나 BrdU의 라벨은 호중구 변환을 성숙 미성숙를 수행 할 수있는 좋은 수단이다, BrdU의 염색보다 더 간단합니다. 또한 호중구의 항 종양 및 항 전이 함수를 결정하는 데 여러 가지 방법을 설명 하였다. 다음은 호중구 고갈, 호중구 입양 전송, 종양 중화 테스트 및 분석을 시드 폐 전이를 포함한다. 이러한 각각의 분석 방법은 항 종양 호중구 기능의 특정 양태를 수행한다. 예를 들어, Granot 외. (6)는 그 위에 증착 관찰호중구 letion는 4T1 종양 - 함유 마우스에서의 폐 전이의 수는 호중구의 항 - 전이성 역할을 시사 증가된다. 호중구 대체 전송하면, 종양 세포는 정제 된 HDN의 정맥 내 주사하여 4 시간 전에 주입된다. 폐 및 간 전이를 형성하는 종양 세포의 능력이 생체 내 광 이미징 시스템을 사용하여 시간 과정 연구에 따른다. HDN 수용 마우스는 대조군 마우스 (6)를보다 적은 전이성 병소를 보였다. 종양 중화 시험에서, 종양 세포는 HDN의 존재는 종양 성장을 감소시킨다 (21), 또는 HDN없이 피하로 주입된다. 전이성 시드 분석에서, GFP 표지 된 종양 세포를 정맥 내로 제어 또는 호중구 고갈 사전 전이성 종양 - 함유 마우스에 주입되고, 폐 시드 GFP 표지 된 세포의 능력이 결정된다. 사전 전이성 종양 - 함유 마우스의 폐 종양 방지 높은 호중구 침윤을 특징으로특정 기관 6 셀 시딩. 이것은 제어 담암 마우스에 비해 호중구 결핍 마우스에서 더 전이성 병소로 변환한다. 프로토콜은 암의 컨텍스트에서 호중구 기능 연구 및 시험 관내 및 생체 내 암 관련 호중구 특성을 평가하기위한 전략을 제공에 초점을 설명했다. 그러나, 호중구 정제 전략뿐만 아니라 기술 된 실험 절차의 일부는 호중구가 중요한 역할 (즉, 염증 및 감염) 재생 실험 설정의 넓은 범위에서 호중구 기능 연구에 사용될 수있다.

호중구는 처음에 침입하는 미생물에 대한 첫 번째 줄에 방어 역할을 타고난 면역 세포 특징했다. 오늘은, 호중구가 더 많은 기능을 광범위한 것으로 알려져있다가, 외국 항원 1, 2에 적응 면역 반응을 장착 조혈 3, 4 혈관 신생을 조절하는 5 상처 치유에 관여된다. 또한, 호중구는 프로 및 항 종양 활동 -6,7-의 덕에 의해 종양의 성장 및 전이성 진행에 영향을 미칠 수있다. 호중구는 다형성 분할 핵을 특징으로한다 (따라서 다형 (PMN) 백혈구라고합니다) 적어도 세 과립의 별개의 서브 클래스뿐만 아니라 분비 소포 8 (그림 1A-C)를 포함한다. 호중구는 식균 높은 용량 및 미생물 제거를위한 임계 높은 NADPH 옥시 다제 활성을 갖는 한에 중요한 케모카인의 다양한 분비추가 호중구 염증 8,9의 사이트에 다른 면역 세포의 견인. 호중구는 수신자와 같은 수용체 (TLR들)을 포함한 표면 수용체의 대량 발현을 특징으로, C 형 렉틴 수용기 ​​(CLRS)는, 수용체 3 (하여 CD11b / CD18)과 다른 부착 분자 (예를 들어, L 셀렉틴을 보완 LFA-1, VLA-4 및 carcinoembryonic 항원 관련 세포 부착 분자 (3) (CEACAM3 / CD66b)), 케모카인 수용체 (예, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), 화학 유인 물질 수용체 (예, PAFR, LTB 4 R 및 C5aR) 사이토 카인 수용체 (예, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR)은 수용체 (예 FPR1-3) 펩타이드를 포르 밀, 및의 Fc 수용체 (예를 들어, CD16 (FcγRIII 인간의 호중구는 CD11b를, CD15, CD16와 CD66b 백혈구 마커를 사용하여 식별되는 반면), CD32 (FcγRII) 및 CD64 (FcγRI) 10. 마우스에서 호중구는 일반적으로는 CD11b + Ly6G +로 식별됩니다. 또한 일반적으로 조직에서 호중구의 검출을위한 과립 단백질 된 myeloperoxidase (MPO) 및 호중구 엘라 스타 제 (NE)에 대한 얼룩 허용됩니다. 그것은 호중구의 다양한 기능이 동일하거나 별개의 셀에 의해 세포의 서브 모집단에 의해 매개되는지 아직 불분명하다. 축적 된 데이터는 염증성 자극과 미세 환경의 영향 11,12 가소성의 높은 정도를 나타내는 이종의 인구 호중구의 존재를 시사한다. Fridlender 등. (13)는 크게 프로 종양 특성을 가진 항 종양 특성 및 N2로 N1 불리는 두 개의 주요 하위 집단으로 암의 호중구를 분할했다. 암뿐만 아니라 만성 염증, T 세포 반응을 억제 과립 14 골수 유래 세포 억제제 (G-MDSCs)로 구성된 부가적인 서브 집단이있다. G-MDSCs이는 CD11b + Ly6C 특징으로 미성숙 골수 세포로 간주됩니다쥐 15 낮은 Ly6G 안녕하세요 표현형, 인간의 16 CD15 + / CD16 낮은 표현형을하면서. G-MDSCs 정상 순환 호중구보다 사이토 카인과 케모카인의 동안 낮은 수준을 아르 기나과 마이 엘 로퍼 옥시 다제의 높은 수준을 표현한다. 그들은 이하 식세포 및 이동성을하지만 ROS 15,17,18 높은 수준의 생산. 본 논문에서는 항 종양 특성을 가진 호중구의 분리 및 특성에 대한 몇 가지 기본적인 방법을 설명합니다. 호중구는 인간의 순환에서 모든 백혈구의 가장 큰 인구를 구성하는 동안 (45~70%; 1,800 - 6,000 / μL) -; 300-500 / μL 15 %, 생쥐에서 정상 조건 하에서, 그들은 10 (오히려 드문 드문 ). 염증에 따라 때때로 만성 염증 (7)의 상태를 나타내는 암에 지속적으로 호중구 수가 증가한다. 호중구는 다 능성 일반적인 골수 전구체 (CMP) CE에서 개발골수성의 단계 (메가 바이트), promyelocytes (오후), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) 및 밴드 세포 (BC)를 통과하는 분화 과정을 통해 골수의 재편, 8. 그들은 순환 (8)에 공개되기 전에 7 일 - 성숙, 후 유사 분열 호중구는 4 골수 내에 남아있을 수 있습니다. 염증 상태에 따라 연장 될 수있다 12 시간 - 혈중 호중구 매​​출 6의 평균 반감기 일반적으로 빠르다. 비자극 호중구는 포르 볼 에스테르 포르 볼 (12)에 노출시킴으로써 항 - 종양 활성, 케모카인 IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 및 CXCL5 6,19 또는 인위적으로 나이브 호중구를 노출시킴으로써 얻어 질 수있는 기능을 제한적 -myristate 13 아세테이트 (PMA) 6. 호중구의 낮은 번호와 함께 혈액 호중구의 짧은 반감기 (~ 3-5 10 5 ×) 순진한 (6) 1 ml의 혈액에서 달성 - 8 주 이전 마우스, 그것을 만든어려운 시험 관내에서 마우스 호중구 순환의 기능을 탐구한다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 다른 소스가 이용되고있다. 예를 들면, 호중구의 다수는 (티오 글리콜 레이트 브로 쓰 또는 자이 모산의 복강 내 주사 한 후, 예) 골수 20 무균 염증 유도 다음 복막로부터 획득 될 수있다. 이는 복강 호중구로부터 얻어지는 모든 항 종양 활성 (미공개 관찰)을 발휘하는 것은 아니다. . 40,000,000 혈액 호중구 용이 1 mL의 혈액으로부터 분리 할 수있다 - Granot 외 6은 BALB / c 마우스 (20)가되도록 종양 진행 (6) (도 2A)으로 악화 호중구를 개발 마우스 4T1 유방 암종 세포주 동소 접종 관찰 3-4주 후 종양 접종. 이러한 호중구 항암 활동을 획득하고 이에 따라 COI왔다순서 네드 종양 동반 된 호중구 (TEN)는 순진한 호중구 (6) (그림 2B)와 구별한다. 고밀도 호중구 (HDN,도 1a)가 높은 항 종양이지만, 암의 문맥에서 생성 저밀도 호중구 (LDN,도 1b) (21)는 그렇지 않다. 또한, 종양 - 함유 마우스의 골수 및 비장으로부터 고밀도 호중구는 항 종양 활성 (미공개 데이터)를 갖는다. 그것은 호중구의 양의 증가와 함께, 종양 진행과 비장 서서히 확대 (비장)을가되도록 유의해야한다. 그것은 10도 자연 (MMTV-PyMT 및 MMTV-Wnt1 유방 종양과 K-RAS 중심의 폐 종양) 모두를 포함하는 암의 다른 모델에서 생성 및 AT-3 (MMTV-PyMT)과 E0771의 유방암 (주입 주목해야한다 세포, LLC 루이스 폐 암종 세포 및 B16-F10 흑색 종 세포). 이 다치거나에서 호중구 동원하지만, 범위삼주 후 1 ml의 혈액에서 10 × 10 6 호중구 - 또는 모델 5에 도달, 4T1-접종 생쥐보다 훨씬 적습니다.

<table><tbody><tr><td>CELL LINES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse 4T1 breast carcinoma cells</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Tissue Culture Plate&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>100 mm Tissue Culture Plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Tissue Culture Flask</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>90 mm Bacterial Grade Culture Dish&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835015-40-111</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5&amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>White 96-Flat-Bottom Well Plate&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 mm)&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>20G x 1.5&quot; Needle</td><td>BD Microlance 3&amp;nbsp;</td><td>301300</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>23G x 1&quot; Needle&amp;nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>25G x 5/8&quot; Needle&amp;nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>9 mm Clips&amp;nbsp;</td><td>BD, AutoClip&amp;nbsp;</td><td>427631</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>EasySep Magnet&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Separation Column&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator Magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Glass Slide&amp;nbsp;</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser Superfrost&amp;nbsp; Plus Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker&amp;nbsp;</td><td>Sky line, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&amp;nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU)&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Highly toxic, handle with care</td></tr><tr><td>Thioglycollate powder&amp;nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;reg; I reduced serum medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin x 1000 solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) without Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>PBS x 10 without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-5A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>HPLC grade water&amp;nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>SOLUTIONS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &amp;ndash; Ammonium-Chloride-Potassium</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Heparin, 20 mg/ml in PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>Luciferase cell culture lysis buffer x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilute 1:5 in sterile water just before use.</td></tr><tr><td>Luciferase assay solution</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)</td></tr><tr><td>Mayer&#039;s Hematoxylin solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0.5% BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>5x PBS with 2.5% BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS&amp;nbsp; and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>Saline (0.9% NaCl)</td><td></td><td></td><td>Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave</td></tr><tr><td>0.2% NaCl solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave</td></tr><tr><td>1.6% NaCl solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave</td></tr><tr><td>2 % Sodium azide</td><td></td><td></td><td>Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. Highly toxic.</td></tr><tr><td>3% Thioglycollate solution</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Boil until solution becomes yellow and autoclave.</td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.</td></tr><tr><td>Trypsin solution B&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1 mg/ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.</td></tr><tr><td>KITS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE selection kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE selection cocktail&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>the EasySep magnetic nanoparticles&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>FITC BrdU flow kit</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>559619</td><td></td></tr><tr><td>MACS Neutrophil isolation kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytosis Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical Company&amp;nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>ANTIBODIES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking antibody&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Purified rat anti-Ly6G antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>551459</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>551460</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G&amp;nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G&amp;nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553310</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553127</td><td>Clone RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE-conjugated rat anti-mouse CD45</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553081</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD66b&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>Purified rat isotype control antibody (IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt;, k)&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553927</td><td>Clone R35-95</td></tr><tr><td>LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11</td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties

호중구 순환 모든 인간 백혈구의 가장 풍부한는 침입 미생물에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을한다. 또한, 호중구는 종양 세포의 면역 감시에서 중심적 역할을한다. 이들은 어느 과산화수소 또는 항체 - 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 통해 관련된 세포 의존성 접촉 메커니즘을 통해 종양 세포의 사멸을 종양 세포를 인식하고 유도 할 수있는 능력을 가지고있다. 항암 활성을 갖는 호중구 암 환자의 종양 - 함유 마우스의 말초 혈액으로부터 분리 할 수​​있다. 이러한 호중구는 현저한 종양 세포 상해 활성을 보여 정상인 또는 나이브 마우스의 호중구 구별하는 종양 혼입 호중구 (TEN)를 지칭한다. 다른 백혈구에 비해 호중구 밀도 구배 실시 때 실현&gt; 98 % 순수 호중구 집단을 얻을 수있다 다른 부력을 나타낸다. 그러나, 또한통상 고밀도 호중구 인구 (HDN)에, 암 환자에서 종양 - 함유 마우스에서뿐만 아니라 만성 염증성 조건 하에서 구별 저밀도 호중구 인구 (LDN)는 순환 나타난다. LDN는 단핵구 분획 공동 정제 및 양성 또는 음성 선별 전략을 사용하여 단핵 세포로부터 분리 될 수있다. 절연 호중구 순도 유동 세포 계측법에 의해 결정되면, 이들은 시험 관내 및 생체 기능 분석에 사용될 수있다. 우리는 호중구의 항 종양 활성을 모니터링하는 능력 마이그레이션 및 반응성 산소 종을 생성 할뿐만 아니라 생체 탐식 능력을 모니터링하는 방법을 설명한다. 우리는 또한 생체 내 추적 호중구 레이블을 기술을 설명하고 생체 내에서 자신의 안티 전이성 용량을 확인할 수 있습니다. 이러한 모든 기술은 획득 및 항 종양 호중구를 특성화하는 방법을 이해하는데 필수적기능.

최근의 연구에서 우리는 호중구 6 항 전이 기능을 확인 하였다. 종양 베어링 마우스에서 호중구는 세포 독성 표현형을 획득하고 종양 세포 (6)를 죽일 수있는 능력을 가지고있다. 이는 현저한 항 종양 효과가없는 6 나이브 마우스의 호중구는 대조적이다. 프로토콜 절에 설명 된 여러 기술은 시험 관내 및 생체 내 6 항 종양 호중구 기능 연구를 위해 사용되어왔다. 종양 세포 독성은 호중구 종양 - 함유 마우스 (6)로부터 획득 될 수있다. 이 목적을 달성하기 위하여, 생쥐는 동소 좌측 서혜부 유방 지방 패드로 4T1 세포 (1 프로토콜)로 주입 하였다. 2 CM 3 (도 3 - - 종양 좌하 복부 분명) 21 일 후 종양 접종하여 1 차 종양의 크기에 도달 하였다. 이때, 마우스를 안락사시키고, 1 mL의 혈액 (마우스 당) 그려진심장 천자 (그림 3)에 의해. 이와 병행하여, 나이브 비 담암 마우스로부터 혈액을 그려졌다. HDN 후 호중구의 고순도 (&gt; 98 %)을 수득 인구 밀도 구배에 (2.1 프로토콜 및도 4)로 정제 하였다. 호중구 생존력은 트립 판 블루 염색법 (프로토콜 2.1)에 의해 결정 하였다. 호중구이어서 2 × 106 호중구 / ㎖에서 0.5 % FBS를 포함하는 최적화 된 혈청 감소 배지에 재현 탁 하였다. 호중구 세포 독성의 정도를 테스트하기 위해, 우리는 96 평면 바닥 흰색 4T1 표적 세포를 (5,000 세포 / 웰 100 μL)에 표현 루시 페라하기 (2 × 10 6 호중구 / ㎖ 원액에서 50 μL) (10) (5) 호중구 추가 - 글쎄 플레이트 (프로토콜 7). O / N 항온 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고, 수동적 세포 용해 완충액에 용해하고, 각 샘플에서의 루시퍼 라제 활성은 호중구의 세포 독성 정도 (평가하기 위해 시험 하였다 <strong&gt; 그림 2B) (프로토콜 7). 루시퍼 라제 활성은 생존 종양 세포의 수와 상관 관계 및 종양 세포의 단독 배양 대조군 웰에서 루시퍼 라제 활성과 비교되어야한다. 우리는 다음과 같은 수식을 사용하여 종양 세포의 사멸 정도를 계산하려면 % 종양 세포 살해 = (1 - [호중구와 샘플의 발광] / [제어 샘플의 발광]) × 100 %. 데이터는, 단독 배양 된 대조군 세포가 우리가 호중구 종양이없는 마우스로부터 정제 동안 (도 2B를 종양 세포를 향해 세포 독성이 없어야한다는 발견이 실험 절차를 이용하여 킬링 % = 0이 서로 다른 조건 하에서 살해 세포의 %로 표현 종양이없는), 호중구 담암 마우스로부터 정제는 상당한 독성 (도 2B, 종양 베어링)을 나타낸다. LDN 및 HDN에 면역 억제 특성을 시험하기 위해, 우리는 (프로토콜 9) T 세포 증식 분석을 사용 하였다. 우리는 평가LDN의 존재 또는 HDN의 존재 (도 5A-D)에서 배양 하였다 CD8 + 배양 혼자 미처리 비장 세포와 αCD3 항체로 처리 된 비장 세포와 세포의 수. 항 CD3 자극 다음 CD8 + CFSE + 세포의 극적인 증가를 참고 억제의 극적인 억제 효과 (오른쪽 상단의 패널와 B를 비교) LDN (B와 C의 오른쪽 패널을 비교) 및 HDN의 억제 효과의 부족 (패널 D). 우리는 또한 핵 확산에 대한 표시로서, CFSE 보유의 정도를 평가 하였다. 도 5E에서, 오렌지 곡선 α로 자극 미처리 CD8 + 세포, αCD3 항체로 처리 파란색 곡선 CD8 + 세포, CD8가 + 세포 LDN 및 녹색 곡선의 존재 αCD3 자극 적색 곡선 나타내는 CD8 + 세포를 제시; HDN의 존재 CD3. αCD3 처리 된 세포에서 왼쪽으로 이동 (파란색 곡선)과 αCD3는 CD8 + 세포의 증식을 표시 HDN (녹색 곡선) 배양 세포를 처리합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52933/52933fig1.jpg" /> 도 1 호중구 형태. 박층 셀 제조 다음 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)으로 염색 고밀도 (A) 및 저밀도 호중구 (B)의 광학 현미경 이미지. (C) 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지 고밀도의 호중구. 바 1,000 nm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52933/52933fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52933/52933fig2.jpg" /> 그림 2. 혈액 호중구 수는 종양 P 증가rogression 및 호중구는 세포 독성 표현형을 획득. (A) 1 mL의 순환 호중구 수는 BALB / c 마우스에서 종양 세포 접종 다음 다양한 일 FACS에 의해 계수 하였다. 개수 순환는 CD11b + Ly6G + 호중구 연속적 4T1 종양 진행에 따라 증가한다. (B) 4T1 유방 암종 세포가 어느 나이브 마우스의 고밀도 호중구 (종양 무료) 또는 4T1 종양 - 함유 마우스 (종양 베어링) 마우스 또는 배양으로 공 배양했다 호중구의 부재 (계속.) 37 ℃에서 20 시간 동안 중간에. 종양 베어링 마우스에 대한 호중구 수 있지만 종양 무료 쥐로부터는 4T1 종양 세포를 향해 중요한 세포 독성을 보여줍니다. 오차 막대는 학생의 T-test를 이용하여 ± SEM ** P &lt;0.01를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52933/52933fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52933 / 52933fig3.jpg&quot;/&gt; 심장 구멍을 통해 쥐의 혈액 3. 컬렉션 그림. 마우스가 느린 이산화탄소 흐름에 따라 유도 챔버에서 안락사되었다. 마우스가 터미널 숨을 촬영 한 직후, 그것은 그것의 뒷면에 배치하고 1 ml의 헤파린 주사기는 심장에 도달 할 때까지 흉골의 기지에 삽입됩니다. 천천히 혈액을 흡인하는 플런저를 잡아 당깁니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52933/52933fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52933/52933fig4.jpg" /> 전체 혈액 4. 호중구 정화 그림. (A) 3 ㎖ 1.077 g / mL의 슈 크로즈 신중 불연속 구배를 형성하기 위해 3 ㎖ 1.119 g / mL의 슈 크로즈의 상단에 적층된다. 6 ㎖의 최종 부피로 PBS-BSA (0.5 %)로 희석 항목 뮤린 혈액은, 1.07의 위에 다음 계층 인7g / mL의 슈 크로즈 (B) (700)와 절단없이 XG에서 30 분간 스핀 후, 3 별개 분획이 관찰 될 수있다.; R - 펠렛, G 적혈구 - 고밀도 호중구 M 함유 과립 분획 -. 단핵 세포 및 저밀도 호중구가 포함 된 단핵 분획물을 (C) 갓 그려진 사람의 혈액 덱스 트란 500 (동량 혼합 3 %), 30 분 동안 RT에서 배양한다. . 백혈구 (버피 코트)를 포함하는 상부 분획은 / mL의 슈 크로즈 절단없이 400 XG에 30 분간 스핀 이하의 (D)는,이 별개의 분획이 관찰 될 수있다 g 10 ml의 1.077의 상부에 적층되고; R + G - 적혈구 및 고밀도 호중구, M 함유 펠렛 -. 단핵 세포 및 저밀도 호중구가 포함 된 단핵 부분을 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52933/52933fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52933/52933fig5.jpg" /> T 세포 증식의도 5 진압. 계측법 흐름이 부재 (B) 또는 LDN의 존재 αCD3 항체 자극 이후, 자극 (A)의 부재하에 배양 CFSE 표지 된 CD8 + 세포의 수를 나타내는 분석 (C) 또는 HDN (D) 패널에서 CD8 + 세포 CFSE 강도 (E) 히스토그램 프리젠 테이션 -.. D는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52933/52933fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.7K 조회수.  Hebrew University Medical School. Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo. 

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

연구

면역학 및 감염병학

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved in various disease processes, such as autoimmune disease, thrombosis, and tumor metastases. Here, we show a detailed in vitro technique to detect NET activity during the trapping of free tumor cells, which grow after attachment to NETs. First, we collected low density neutrophils (LDN) from postoperative peritoneal lavage fluid from patients who underwent laparotomies. Short-term culturing of LDN resulted in massive NET formation that was visualized with green fluorescent nuclear and chromosome counterstain. After co-incubation of human gastric cancer cell lines MKN45, OCUM-1, and NUGC-4 with the NETs, many tumor cells were trapped by the NETs. Subsequently, the attachment was completely abrogated by the degradation of NETs with DNase I. Time-lapse video revealed that tumor cells trapped by the NETs did not die but instead grew vigorously in a continuous culture. These methods may be applied to the detection of adhesive interactions between NETs and various types of cells and materials.

Here, we present a method in which human low-density neutrophils (LDN), recovered from postoperative peritoneal lavage fluid, produce massive neutrophil extracellular traps (NETs) and efficiently trap free tumor cells that subsequently grow.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

암 연구학

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the tumor milieu can possess pro- or anti-tumor capacity. One of the important cytokines regulating neutrophil functions in a tumor context are type I interferons. In the presence of interferons, neutrophils gain anti-tumor properties, including cytotoxicity or stimulation of the immune system. Conversely, the absence of an interferon signaling results in prominent pro-tumor activity, characterized with strong stimulation of tumor angiogenesis. Recently, we could demonstrate that pro-angiogenic properties of neutrophils depend on the activation of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) signaling pathway in these cells. Inhibition of this pathway in tumor-associated neutrophils leads to their potent anti-angiogenic phenotype. Here, we demonstrate our newly established model allowing in vivo evaluation of tumorigenic potential of manipulated tumor-associated neutrophils (TANs). Shortly, pro-angiogenic tumor-associated neutrophils can be isolated from tumor-bearing interferon-deficient mice and repolarized into anti-angiogenic phenotype by blocking of NAMPT signaling. The angiogenic activity of these cells can be subsequently evaluated using an aortic ring assay. Anti-angiogenic TANs can be transferred into tumor-bearing wild type recipients and tumor growth should be monitored for 14 days. At day 14 mice are sacrificed, tumors removed and cut with their vascularization assessed. Overall, our protocol provides a novel tool to in vivo evaluate angiogenic capacity of primary cells, such as tumor-associated neutrophils, without a need to use artificial neutrophil cell line models. vc

Here, we show therapeutic potential of anti-angiogenic tumor-associated neutrophils after their transfer into tumor-bearing mice. This protocol can be used to manipulate neutrophil activity ex vivo and to subsequently evaluate their functionality in vivo&#160;in developing tumors. It is an appropriate model for studying potential neutrophil-based immunotherapies.

조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

생물학

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood

Source: Sionov, R. V., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52933">Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of cytotoxic high-density neutrophils and low-density neutrophils from the blood of a tumor-bearing mouse by discontinuous sucrose gradient centrifugation.

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood(종양을 지닌 쥐 혈액에서 세포독성 호중구의 분리)

Source: Sionov, R. V., et al., Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Systems and Components

Cell Isolation and Culture

Generating Anti-Angiogenic Tumor-Associated Neutrophils

For tumor-associated neutrophil isolation, place five tumors per well into individual wells of a sterile six-well plate, as they are harvested, and use sterile scissors to mince the tumors into 2- to 3-millimeter pieces. Next, digest the tumor fragments with 1 milliliter of disk-based collagenase, DNase I solution for 45 minutes at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide with humidity, mixing the samples with a 10-milliliter syringe every 15 minutes.
At the end of the incubation, filter the cells through 100-micrometer strainers into one 15-milliliter tube per well to remove the undigested fibers, and add PBS to a final volume of 15 milliliters. Collect the dissociated cells by centrifugation, and lyse the red blood cells with 1 milliliter of lysis buffer per tube.
After mixing, combine the contents from each tube into a single 15-milliliter tube, stopping the reaction after two minutes with 11 milliliters of complete 4 degrees Celsius medium. After centrifugation, resuspend the pellet in 1 milliliter of PBBS, and block any nonspecific binding with three microliters of FC-blocked antibody for 15 minutes on ice.
At the end of the incubation, label the cells with anti-CD11b and Ly6G antibodies and any other antibodies of interest plus DAPI for a 30-minute incubation on ice protected from light. At the end of the incubation, wash the cells in 14 milliliters of PBS, and resuspend the pellets at a 1 x 107 cells per milliliter of fresh complete medium concentration on ice.
Then, sort the CD11b-positive Ly6G-high DAPI-negative neutrophils on a fluorescence-activated cell sorter according to standard sorting protocols, checking the purity of the isolated neutrophils on the flow cytometer at the end of the sort. For in vitro tumor-associated, neutrophil inhibition, seed 1.5 times 10 to the fifth sorted neutrophils into each of two wells of a 96-well U-bottom plate, and add FK866 to a final concentration of 100 nanomolar in complete medium into one well and an equal volume of complete medium alone to the other well. After two hours in the cell culture incubator, wash the cells two times with PBS, and resuspend the pellets in PBS at the appropriate concentration for the subsequent injection.