Name: comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
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The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

먹이 박테리아 1. 준비 주 :이 항목은 먹이 세균 (대장균 OP50)의 제조를 설명한다. <ol><li> E.의 단일 콜로니를 분리 무균 원성 국물 (LB) 한천 플레이트에서 대장균 균주 OP50는 멸균 LB 배지 300 ml의에 접종합니다. </li><li> 포화 상태에 도달 할 때까지 접종 문화, 200 rpm으로 37 ° C에서 통에 밤새 성장하도록 허용합니다. </li><li> 6 멸균, 미리 무게를 50 ML 원뿔 튜브에 OP50을 전송합니다. 6000 RPM (5000 XG)에서 5 분 동안 원심 분리하여 세균 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 멸균 M9 50 ml의 세균을 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척 후 더 M9는 튜브에 남아 있지 않도록 보장, 나머지 M9를 제거합니다. </li><li> 박테리아 펠렛을 함유하는 튜브를 칭량 펠릿의 중량을 결정하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 무게를 뺀다. </li><li> 펠릿 난을 재현 탁M9 N 100 mg / ml의 농도로. </li><li> 이 웜 문화에 사용 될 때까지 4 ℃에서 OP50 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 선충 성장 중간 (NGM) 페트리 접시 2. 준비 주 :이 섹션은 판 C.는 NGM 페트리 접시의 준비에 대해 설명합니다 엘레 웜은 정기적으로 실험실에서 유지됩니다. <ol><li> NGM 한천 배지를 압력솥. </li><li> 무균 절차를 이용하여, 연동 펌프를 이용하여 6cm 페트리 접시에 NGM 한천 용액 17㎖의 분배. 주 : 판에서 한천의 일정 금액이 다른 하나의 판에서 전환 할 때 현미경을 재조명의 필요성을 감소시킨다. </li><li> 한천 응고하자 여분의 수분이 증발 할 수 있도록 사용하기 전에 2~3일 실온에서 접시를 남겨주세요. </li><li> 멸균 기법을 사용 NGM 플레이트 종자. OP50 액체 배양의 1-2 방울을 적용하고 유리 막대를 사용하여 확산. 확인되지판의 가장자리에 박테리아 잔디 모든 방법을 전파한다. </li><li> OP50 잔디가 벌레를 성장 판을 사용하기 전에 실온에서 1~2 일 동안 성장하는 것을 허용합니다. </li></ol> 동기 웜 인구의 3 준비 주 : C.의 수명 엘레는 배아 단계, 네 애벌레 단계 (L1-L4) 및 성인으로 구성되어 있습니다. 이 섹션에서는 웜의 시대 - 동기 인구의 준비에 대해 설명합니다. 표백제 처리 후 C.elegans과 접촉 모든 자료는 멸균해야합니다. <ol><li> 1 일 - 임신하는 웜 인구의 준비 <ol><li> 웜 인구의 대부분이 굶주린 L1 유충 구성하는 NGM 플레이트를 사용합니다. </li><li> 멸균 웜 L1 애벌레 선택 수집하고 신선한 6cm의 NGM 플레이트로 전송은 OP50 시드. 벌레의 대부분이 임신하는 성인 때까지 20 ℃에서 약 65 시간 동안 품어. 에판 혼잡을 방지하고 각 신선한 NGM 판에 L1 유충 이상의 하나 또는 두 개의 클러스터를 전송하지 않습니다, 벌레 박테리아를 파괴없이 증가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 4 일 - 동기화 된 L1 유충 인구의 설립 <ol><li> M9의 1-2 ml로를 세척하여 NGM 판에서 임신하는 벌레를 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 임신하는 웜이 약 5 ~ 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 침전 보자. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 2-4 마이크로 원심 튜브 웜 펠렛을 전송하고 표백제 / NaOH 용액 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 2 ~ 3 분 동안 품어. 모든 벌레가 죽었 확인 실체 현미경 하에서 반응의 진행을 모니터링합니다. 배아가 죽을 수 있으므로 이상 5 분 표백하지 마십시오. </li><li> 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 벌레를 수집합니다. 상층 액을 제거하고 멸균 M9의 1 ml에 추가반응을 중화. </li><li> 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 두 번 벌레를 씻으십시오. </li><li> 상층 액을 제거하고 최대 100 ~ 200 μL에 M9를 추가합니다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 웜의 드롭을 추가 사용 / M9는 배아가 부화 할 수 있도록 20 ° C에서 최소 24 시간 동안 그들을 NGM 판을 지우고 배양 혼합. 참고 : 음식없이 유충의 성장은 L1 단계에서 중단 될 것입니다. </li></ol></li><li> 5 일 - 동기화 된 L4 애벌레 인구의 설립 <ol><li> M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L1 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 약 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 죽은 성인 웜 침전물을 보자. </li><li> 새로운 원뿔 15 ML 튜브의 L1 웜은 상층 액을 수집하고, 2,600 RPM (1,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 웜을 침전. </li><li> 뜨는 르를 제거약 500 μL AVING. </li><li> 실체 현미경을 이용하여 10 μL 삭제 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 웜 용액의 농도를 결정한다. 적어도 5 방울을 계산합니다. </li><li> 20 ~ 25 웜 / μL로 웜의 농도를 조정하고 OP50 시드 NGM 판에 웜 / M9 믹스의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 그들은 L4 단계에 도달 할 때까지 L1 동기화 된 인구가 성장 할 수 있도록 (주말을 통해 배양 용) 15 ° C에서 65 시간 동안 품어. </li></ol></li></ol> 96 웰 플레이트에서 화학 물질에 웜의 4 노출 참고 :이 섹션은 Pxol1의 사용에 대해 설명 :: C를 포함하는 GFP 전사 기자 엘레 변형은 이수성의 유도를위한 화면으로 이동합니다. <ol><li> M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L4 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 하단에 L4 웜 침전물하자15 ml의 약 5 ~ 10 분 동안 원뿔 튜브. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> M9의 3-5 ml에 첨가하고, 실체 현미경을 이용하여 10 ㎕의 방울 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 용액 웜의 농도를 결정한다. 각 샘플에 대해 적어도 5 방울을 계산합니다. </li><li> M9 1,000 웜 / ml의 농도로 재현 탁 웜. </li><li> 섹션 1에서 OP50 박테리아 희석 M9와 10 배. 낮은 온도는 웜 개발에 영향을주기 때문에 재 부유 세균은 실내 온도에 도달해야합니다. </li><li> 제 (단계 4.4) 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 추가하고 2ml의 깊은 환저 96- 웰 플레이트의 각 웰에 (단계 4.5)으로 희석 OP50 세균 400 μL를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용. 마지막에, 각 웰은 500 μL 100 웜이있을 것이다. </li><li> 최종 제안 CONCENTR을 달성하기 위해, 목적하는 웰에 시험 물질 또는 적절한 제어 중 0.5 μl를 추가100 μM의 ATION는, 농도는 일반적으로 C. 화학 화면에 사용 엘레 (12). 최종 농도 0.1 % DMSO 또는 에탄올 용매 컨트롤을 노출. 참고 : 우리는 긍정적 인 제어와 같은 nocodazole (100 μM)의 사용을 권장합니다. </li><li> 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 우물 사이에 교차 오염을 방지하기 위해 잘 판을 밀봉해야합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시를 감싸. </li><li> 시간의 적당한 길이 (24 또는 65 시간)에 적합한 온도의 셰이커 (170-180 RPM)에 접시를 전송합니다. 실내의 온도는 웜의 성장에 영향을 미친다; 20 ° C의 주변 온도를 유지한다. </li></ol> 384 웰 플레이트에서 임신하는 웜 5. 이미지 획득 참고 :이 섹션은 성인 자웅 동체의 자궁 내 배아에서 GFP의 발현을 시각화, 이미지 노출 Pxol1 :: GFP 벌레에 함량이 높은 현미경의 사용에 대해 설명합니다. 용각 384 웰 플레이트가 상영 될, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용합니다. <ol><li> 셰이커 화학 물질에의 노출 후 10 ~ 15 분 동안 96 웰 플레이트 나머지는 어른 벌레가 판의 바닥에 침전 수 있도록 할 수 있습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 매우 조심, M9의 350 μl를 제거합니다. </li><li> M9 1 ml의 단계를 반복 5.1 벌레를 씻으십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 참 조심, M9 1 ㎖를 제거합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 나머지 M9에 웜을 재현 탁하고, 96 웰 플레이트에서 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 모으고 검은 벽 / 클리어 바닥 384- 웰 플레이트의 웰에로드. 384 웰 플레이트의 모든 우물이로드 될 때까지, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용하여 프로세스를 반복합니다. 주 : 중요을 증가시키기 위해 모든 웰은 동일한 볼륨을 갖도록위한이미지 획득 과정의 효율성 및 오토 포커스의 속도. 각 웰은 80-100 웜 사이에 포함해야합니다. </li><li> 각 웰의 levamisole (100 μM)의 1 μl를 추가하고 벌레가 약 30 분 동안 품어 보자. 주 :의 levamisole가 아세틸 콜린 수용체 작용 물질로서 작용하고 벌레를 고정화. </li><li> 자동화 된 영상을 제공 할 수있는 위드 함량이 높은 현미경으로 접시를 전송합니다. </li><li> 이미지 수집의 경우, 제조업체의 지침에 따라 높은 함량의 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 사용합니다. 물론 당 1 영상을 획득 할 수 4X 목표를 선택합니다. </li><li> 화상 취득을 시작하기 전에, 2160 X 2160 노출 이미지의 해상도가 45 밀리 초에 GFP 촬상 파라미터를 조정한다. </li><li> 웰 벌레의 총 수로 나눈 GFP 양성 벌레의 수와 데이터를 수집, 측정, 후자는 웰 사이의 일관성이 비교적. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 기재된 방법은 생식선 독성의 식별을위한 제 대규모 전략을 구성한다. 그것은 충실하게 생식 기능 장애에 대한 프록시로 사용되는 초기 배아에서 이수성의 유도를보고 GFP 형질 전환 Pxol-1 :: GFP 포함하는 변형의 사용을 필요로한다. 방법 C. 동기화의주의를 포함 엘레 웜 인구와 자동화 된 고 함량 현미경으로 GFP 긍정적 인 웜의 영상 다음 96 웰 형식의 화학 물질에 웜 &#39;...

미국에서 상업에 등록 된 약 87,000 화학 물질이이 건강에 미치는 영향 1 테스트 한의 또 적은 수 있습니다. 테스트 한 것들 중에서 일부만 특히 여성 생식 세포 발생과 분화 동안 포유류 이른 생식 이벤트의 변경을 결정하는데 어려움으로 인해 일부 생식 건강에 미치는 영향에 대해 평가되었다. 사실, 첫 번째 감수 이벤트는 여성 포유 동물의 배아 발달의 초기 단계 동안 자리를 차지할 때문에 액세스 및 심사 목적에 맞는 숫자를 수집하기가 어렵습니다. 생식 세포는 세대 간의 중요한 연결을 제공하고, 그것의 적절한 기능은 세포의 염색체 분열의 복잡한 프로그램의 정확한 실행이 감수 분열이라에 따라 달라집니다. 감수 과정의 조절 곤란 저감 다산 및 생산 될 수있다염색체의 이상 수의 생식 세포 및 배아는 조건 이수성 불린다. 감수 분열 염색체 편석 에러는 인간의 건강에 매우 적합하다. 염색체 이상은 1 (150) 출산의 주파수, 삼 염색체 21, 18, ​​13뿐만 아니라 가장 흔한 유형 2,3 인 X와 Y 염색체 오류, 일반적이다. 또한, 염색체의 기원을 포함한 선천성 기형이, 미국 4 환경의 영향이 염색체 분리와 행동에 영향을 미칠 수 있다는 생각 유아 사망의 주요 원인이되는 5 개의 새로운 것이 아니다,하지만 여전히 제대로 이해된다. 그것은 인간의 불임, 초기 개발 및 전반적인 생식 건강을 방해 우리의 환경에 도입 된 화학 물질의 어떤 조사하는 것이 중요하다. 포유 동물 모델의 이러한 한계의 관점에서, 우리는 &lt;회충 생식 독성을 테스트하기 위해 높은 처리량 스크린 분석법을 개발EM&gt; C. 엘레. 우리는 작은 크기, 낮은 비용, 짧은 재생주기, 생식 세포의 비율이 높은 및 조작 (6)의 용이성으로이 일반적으로 사용되는 유전자 모델 시스템에서 제공하는 여러 가지 중요한 기능을 동원했다. 웜 96- 웰 플레이트 또는 대량의 액체 배양 물에서 성장 될 수 있고, 투명성 때문에 직접 형광 리포터 검출 용 플레이트 상에 이미징 될 수있다. 후술 분석은 이러한 특성을 활용하고 및 배아 생식 세포 분열 이수성의 유도를 검출하는 형광 리포터에게 Pxol :: GFP-1을 함유하는 웜 변형을 이용한다. 이 리포터 균주의 사용은 주로 암수 웜 인구 남성 일반적 드문에 기초한다. 이 남성은 (&lt;0.2 %)이 자연스럽게 X 염색체 7의 분리에 오류를 발생. 그러나 생식 세포 분열로 자주 염색체의 분리의 오류로 연결과 heterochromosomes, 그것은 남성의 표현형 (X의 missegregation)뿐만 아니라 배아 치사 (염색체의 missegregation)의 높은 발병률을 모두 상관 관계. 배아 치사의 문제를 회피하면서 쉽게 수컷의 유도를 검출하기 위해, 남성 특이 프로모터 (XOL-1) 여전히 웜의 자궁 내에 포함 된 초기 배아에서 GFP의 발현을 구동하는 데 사용된다. 이와 같이, GFP 발현의 배아 외관 aneuploid 배아의 존재에 대한 프록시로서 사용된다. 이 방법은 이전 생식계 정비 및 감수 8,9에 관여 유전자를 동정하는데 사용되어왔다. 화학적 선별하도록 구성된,이 균주는 높은 처리량 스크린 매체에 사용된다. 중요한 것은, 변형 충실 화학 물질의 aneugenicity를보고하고 포유 동물의 생식 엔드 포인트 (10)에 따라서 관련이있다. 여기에 설명 된 분석은보고 제약 및 화학 산업 설정에서 독성 학자들에게 특히 유용 할 것입니다빠르게 생식 엔드 포인트에 대한 화학 물질의 독성을 평가합니다. 또한,이 분석은 완전히 21 세기 보고서 11 독성에 강조 정부의 우선 순위로 정렬합니다.

<table><tbody><tr><td>60 mm Vented, sharp edge Petri dishes</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 well plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole hydrochloride</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress High Content Image Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rayon films for biological cultures</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>This microscope has a total magnification form 3.35X to 300X. Any microscope with similar characteristics will work.</td></tr><tr><td>TY2441 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;Pxol-1::GFP&lt;/em&gt; reporter strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cbs.umn.edu/cgc&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cbs.umn.edu/cgc&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

우리의 환경에 존재하는 화학 물질의 수천의 생식 독성을 확인하는 것은 환경 보건 분야에서 가장 밝히는 과제 중 하나가되었습니다. 이것은 척추 동물의 높은 번호를 필요로하지 않고, (1) 정확하게 (2) 높은 처리량 방식으로 중간에서 이렇게 생식 과정 키 기능 요점을 되풀이하고있다 모델 시스템의 소수에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다. 우리는 선충 C. 여기에 분석을 설명 aneuploid 배아의 유도를 모니터링하여 생식 세포 독성 물질의 신속한 식별 할 수 간스. GFP 리포터 라인을 이용하여, 배아 파괴로 인한 염색체 분리에 오차가 용이하게 시각화 및 자동화 된 형광 현미경에 의해 정량화. 따라서, 그 독성에 대한 화합물의 특정 세트의 스크리닝은 수일 384 96- 웰 플레이트 형식으로 수행 될 수있다. 긍정적 인 시간의 차 분석그는 염색체 이상은 감수 분열 또는 초기 배아 염색체 분리에 유래 오류 여부를 판단하기 위해 수행 될 수있다. 전부,이 분석 결과 화학 물질에의 노출 다음과 생식 기능 장애의 신속한 평가를위한 빠른 첫 번째 패스 전략을 나타냅니다.

이러한 미세 소관 독 Nocodazole 등의 화학 약품에 Pxol-1 :: GFP 기자 균주의 노출 (그림 1) DMSO 제어에 비해 노출 성인 자웅 동체의 자궁에 GFP를 발현하는 배아의 높은 비율의 유도에 이르게. GFP 양성 배아 다른 배아뿐만 아니라 동물의 소화관에서 관찰 자동 형광 관찰 약한 배경 형광보다 상당히 밝습니다. 웜 직접 노출 384- 웰 플레이트 상에 결상 및 적어도 하나 GFP 양성 배아를 함유 ...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K 조회수.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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연구

생화학

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

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환경과학

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

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Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

암 연구학

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

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Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

발생학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

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High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

생물학

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

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Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

의학

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

신경과학

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, pesticides, and a wide variety of toxic substances. These nematodes are easy to work with and can be used to generate novel research findings, even in the undergraduate biology laboratory. A multi-week laboratory series of authentic, student-driven research projects trains students in a toolkit of techniques and approaches in behavioral measurements, cell biology, and microscopy that they then apply to their projects. One technique in that toolkit is quantifying the percentage of neurons exhibiting neurodegenerative damage following exposure to a chemical toxicant like a pesticide. Young adult C. elegans nematodes can be exposed to different concentrations of commercially available pesticides or other types of toxicants for 2-24 h. Then, undergraduate students can visualize different neuron subtypes using fluorescent-expressing strains of C. elegans. These techniques do not require sophisticated image processing software and are effective at even low magnifications, making the need for expensive confocal microscopy unnecessary. This paper demonstrates how to treat the nematodes with pesticides and how to image and score the neurons. It also provides a straightforward protocol for the microscopy and analysis of neuron morphology. The materials used for this technique are inexpensive and readily available in most undergraduate biology departments. This technique can be combined with behavioral measures like locomotion, basal slowing, or egg-laying to conduct a potentially publishable series of experiments and give undergraduate students an authentic research experience at a very low cost.

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Young adult Caenorhabditis elegans nematodes are exposed to different concentrations of commercial pesticides or other toxicants for 2-24 h. Then, different neurons can be visualized using fluorescent-expressing strains. This paper demonstrates how to expose nematodes to pesticides and assess neuron damage.

Caenorhabditis elegans Neurons에 대한 살충제의 영향 조사

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가

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