Name: correlating gene-specific dna methylation changes with expression and transcriptional activity of astrocytic kcnj10 (kir4.1)
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1 at JoVE.com

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

모든 동물은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 처리되었다. 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 관리 및 사용위원회는 동물의 사용을 승인했다. 1. 전체 뇌 조직에서 성상 (FACS)을 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 풍부한 성상 세포 인구에서 RNA와 DNA를 얻기 <ol><li> 1 분 동안 이산화탄소 후 빠르게 목을 벨과 진정 동물. 앨버 커키 등의 알에 설명 된대로 피질을 해부, 26.; 그것은 수막을 제거 할 필요가 없다. 참고 :. S100β에서 eGFP는 (성상 세포 마커) 프로모터를 발현하는 형질 전환 쥐 이타 쿠라 등 (27)에 의해 생성 및 성상 세포의 FACS 정렬을 위해 사용되었다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 비 멸균 조건 하에서 파파인 해리 키트를 사용하여 전체 뇌 균질 물을 준비한다. 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃에서 파파인을 열 활성화합니다. 노트 :파파인 솔루션은 제조업체에서 제공 및 L 시스테인 및 EDTA를 (재료의 표 참조)이 포함된다. <ol><li> 절단 또는 튜브는 95 % O 2 반송하도록 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 구멍을 드레 멜 : 5 % CO 2는 폐쇄 원추형 튜브에 공급되는 (도 1a 참조). 해리 미디어 함유 10mm 배양 접시에 해부 피질 배치 (하여 20 mM 글루코스 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (500 U / ml)로 보충 된 95 %의 O를 평형화 MEM을 2 : 5 % CO 2) (1)에 조직을 말하다 깨끗한 면도날을 사용 X 1mm 2 개. </li></ol></li><li> 파파인 함유 용액 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 10 ㎖를 사용하여 수동 pipetman 전사 조직. 조직이 이월 해리 미디어의 양을 최소화하기 위해 배출 전에 전송 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 95 % O 2로 평형화 파파인 용액을 보관 : 5 % CO 2 항온 처리 기간 동안 표면을 통하여 가스 교환. 하지 거품 파파인 soluti를 수행에. 37 ° C의 물을 욕조에 20 분 동안 조직을 품어. </li><li> 파파인 솔루션에 다음과 배양, 씹다 조직 느린 속도로 10 ml의 전송 피펫으로 10 배. 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 흐린 세포 현탁액. <ol><li> 표면을 통한 가스 교환 (제조사에 의해 제공된)의 DNase / 억제제 알부민 용액과 평형의 DNase / 억제제 알부민 용액 3 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 제조업체의 지침에 따라 상업 불연속 밀도 기울기를 준비합니다. </li></ol></li><li> 6 분 동안 1,000 XG 불연속 밀도 구배 스핀. 피펫을 사용하여 바닥 펠렛을 흡입에 의해 튜브의 바닥에서 해리 세포를 분리. </li><li> 0.02 % 소 혈청 알부민 및 1 ㎎ / ㎖의 DNase 또는 배양 배지 HEPES 완충 바람직 DPBS로 2-3 ml 중에 해리 된 세포를 다시 일시 중지. FACS (그림 2A) 전에 40 μm의 필터를 통해 전달합니다. 정렬 될 때까지 얼음 세포를 유지합니다. <ol><li> 외과 (28)를 수행합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛 세포. 주 : 펠릿의 성상은 즉시 사용 또는 DNA 추출까지 -80 ° C에 보관 될 수있다. </li></ol></li><li> RNA와 DNA를 선호하는 분리 방법 (29) (30)를 사용하여 압축을 풉니 다. 분광 광도계와 bioanalyzer (31)를 통해 RNA 및 DNA 농도와 품질을 평가합니다. 주의 : 후속 단계에서 단지 고품질 RNA 및 DNA를 활용하여 각각 280분의 260 = 2.0~2.2 및 1.8-1.9를. Bioanalyzer 분석은 RNA 분해 또는 DNA 파편에 대해 평가하는 것이 필수적이다. RNA 또는 DNA는 즉시 사용하거나 또는 -20 ° C, 각각 후속 연구를위한 C °에서 -80 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 메틸화에 민감한 고해상도 용융 분석 (MS-르마)를 사용하여 유전자의 DNA 메틸화 상태를 평가 <ol><li> 유전자에 어떤의 CpG 섬을 식별하는 것이 바람직 온라인 메틸화 매핑 소프트웨어에 관심의 유전자 서열을 입력관심 (32). <ol><li> 중아 대해 디자인 된 프라이머는 DNA 서열 (33)를 변환하여 제조사의 프로토콜에 따라 바람직한 DNA 중합 효소를 이용하여 증폭한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤을 실행하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. -20 ° C에서 20 μM의 재고 농도 스토어 프라이머. </li></ol></li><li> 중아는 같은 동물 종 (34)로부터 0~100%에 이르기까지 각각의 샘플과 메틸화 된 DNA 표준 DNA의 500 ~ 1,000 NG를 변환합니다. 용출 시료 20 NG / μL의 농도를 제공한다. 분광 광도계 (31)를 통해 중아 변환 된 DNA의 농도를 확인합니다. </li><li> 표 1 및 2에 따른 5 μM 농도에서 바람직한 DNA 폴리머 라제 및 프라이머를 사용하여 MS-HRM 증폭 용 셋업 20 μL 반응. 중으로, FACS의 DNA 메틸화 및 표준을 포함하여 모든 샘플을 실행할. </li><li> 분석 소프트웨어에 따라, 미리 설정하고 시작 매개 변수를 중지 포스트용융 곡선의 천이 주위. 세트 미리 용융 개시 및 둘 사이의 차이가 0.​​2 정도로 미리 용융 정지 파라미터 - 0.5 ° C. 후 용융 시작 및 사후 용융 유사 중지를 설정합니다. 각 샘플에 대한 피크 온도 차이 데이터의 압축을 풉니 다. </li><li> 메틸화 백분율 기준 (Y 값)과 대응하는 평균 피크 온도차 (x 값)을 사용하여 선형 회귀 방정식 (도 3A-B, 표 3-4)을 생성한다. 미지 시료 (35)의 메틸화 상태를 추정하기 위해 선형 회귀 방정식을 사용합니다. </li></ol> 3. 루시퍼 라제 분석의 사용을 통해 하이퍼 메틸화 발기인 활동 평가 <ol><li> 표적 유전자 (2.1 단계)의의 CpG 섬을 식별합니다. 이 PCR의 CpG 섬 luc2-37 플라스미드를 제조 luc2 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자의 상류에 관심 36 클론의 영역을 증폭. </li><li> 제한을 통해의 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 30 μg의 선형화효소 소화 38. 제한 다이제스트에 대한 사이트를 확인하고 원하는 커터 소프트웨어 (38)를 사용하여 두 번 상처를 피할 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화를 다음과 같은 적절한 온도와 시간에 효소를 열 - 불 활성화. DNA의 최소 손실은 선형화 단계에서 발생합니다. </li><li> 30 ° C에서의 CpG 메틸화 (M.Sssl) O / N을 사용하거나 다음과 같은 조정을 제외하고 처리되지 않은 다음과 같은 제조 업체 프로토콜을 남겨 메틸화 선형화 플라스미드. </li><li> 50 μL 반응을 수행합니다. </li><li> 선형화 플라스미드 700 NG 메틸화에의 CpG 메틸화의 5 단위를 사용합니다. </li><li> 13 ~ 19 시간 동안 반응 O / N을 실행합니다. </li><li> 의 CpG 메틸화 반응에 따라, 시판되는 실리카 - 겔 막의 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 정리 표준을 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 메틸화 된 CpG 반응 30-60 %의 감소에 따라 발생한다. </li><li> HPA II 제한 다이제스트를 통해 플라스미드의 메틸화를 확인합니다. </lI&gt; <li> 메틸화 또는 비 메틸화 된 DNA 1 μg의를 가지고 제한은 37 ℃에서 1 시간 동안 HPA II 다이제스트. 각 μg의 DNA를 위해 HPA II의 5 ~ 10 단위를 사용합니다. HPA II 소화에 따라, 선호, 시판되는 실리카 - 겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. 시각화를위한 45 분 (그림 4B) 100 V에서 TAE 나 TBE 버퍼에 1 % 아가 로스 DNA 젤에 모두의 CpG 메틸화 및 비 메틸화 된 플라스미드를 실행합니다. </li><li> 적절한 제한 효소와 더블 소화에 따라 모두 메틸화 및 비 메틸화 플라스미드는 전체 길이 루크 2 (벡터)과의 CpG 섬 (삽입) 38 조각을 분리합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화 다음 적절한 온도와 열을 비활성화 효소에서 더블 소화 O / N을 수행합니다. DNA 농도의 손실을 최소화 이중 제한 다이제스트 동안 발생합니다. </li><li> O를 분리 할 수​​ 있도록 1 시간 동안 100 V에서 1 %의 DNA 아가 로스 젤을 두 번 소화 플라스미드를 실행F 벡터 삽입 (그림 4C). 주의. 보호 자외선 얼굴 가리개를 착용, 밴드를 시각화 탁상 블랙 라이트에 DNA 젤을 배치합니다. 깨끗한 수술 블레이드를 사용하여 크기, 소비세 메틸화 및 비 메틸화 삽입 및 비 메틸화 된 벡터 기준으로합니다. </li><li> 포화 페놀, pH가 6.6을 사용하여 젤 추출 DNA. 간단히, 벡터 또는 삽입을 포함하는 DNA 젤 무게. DNA 젤 0.1 g 당 페놀의 100 μl를 사용합니다. 유리 다운스 균질 기에서 페놀을 사용하여 DNA 겔 균질화. </li><li> 클로로포름 (페놀 량의 1/5 사용)을 추가하고 20 초 동안 샘플을 흔들. 2 ~ 3 분 동안 실온에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 최대 속도 (16.1 X 1,000 XG)에서 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 수용액을 제거하고, 3 M 아세트산 나트륨 및 에탄올 2.5 배 부피의 0.1X 볼륨. -80 ° C에서 1 시간 동안 샘플을 품어. 인큐베이션 후, 에탄올을 제거하고 바람직한 완충액 30 μL에 DNA를 다시 일시. DNA의 상당한 손실이 삽입 및 벡터의 다음 분리를 발생, 30 % ~ 50 % 싸다SS. </li><li> 재 결찰을 메틸화 및 비 메틸화 된 인서트 T4 DNA 리가 제 (38)를 이용하여 벡터를 비 메틸화. 결찰 반응에 삽입하는 벡터의 4 비율 : 1을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 설치 반응. 반응 50 μL의 총 부피를 사용하여 C ° 또는 얼음 양동이 위에 뚜껑 얼음에 -20 O / N을 품어. </li><li> 결찰 후, 선호, 시중에서 판매하는 실리카겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 연결 반응, DNA의 대략 30 % ~ 50 %의 손실에 따라 발생한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤에 실행하여 재 결찰을 확인하고 재 결찰 플라스미드 (그림 4D)의 농도를 평가합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 형질 전환 시약을 이용하여 세포 내로 D54 메틸화 또는 비 메틸화 된 플라스미드를 형질 감염. 잘 0.14 × 10 6 세포 / 12 웰 판에 씨앗 D54 셀. </li><li> 24 시간 후, 형질 세포 위스콘신(1) 비 methyated의 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 또는 (2) 메틸화 된 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 중 하나의 일 동일 농도. </li><li> 세포가 듀얼 루시 페라 제 분석을 수행하기 전에 24 시간 동안 형질을 허용합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다. 루미를 사용하여 측정을 수행합니다. 세중에서 잘 각을 읽어보십시오. </li><li> 레 닐라하는 반딧불 루시 페라 제 활동의 비율 또는 기타 제어 루시퍼 라제 활성을 계산합니다. 비 메틸화를 제어 반딧불 루시페라아제 활성 : 메틸화 반딧불 정상화 제어 루시퍼 라제 활성을 비 메틸화 된 루시퍼 라제 활성에 의해 메틸화 된 루시퍼 라제 활성을 나누어 </li></ol>

The authors have no disclosures.

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge in studying the epigenome of the CNS is the diversity of cell populations. As genes of interest may be expressed to varying degrees with both temporally and spatially unique patterns in the CNS, the use of whole tissue often confounds data from both transcription and DNA methylation studies. 
Kir4.1, the protein of interest, is spatially and temporally regulated in astrocytes, oligodendrocytes, and ependymal cells 13,14,40-47. Thus, the use of eGFP-S100&#946; transgenic animals 27 for FACS provided an enriched population of astrocytes 15, and therefore a more accurate assessment of the level of gene transcription and DNA methylation specific to this cell population. Despite this advantage, the use of FACS sorted astrocytes presents several challenges. Preparation of a cell suspension for FACS requires significant disruption of whole tissue and several changes in the temperature and external media environment. While pH and temperature are maintained to promote cell viability and stabilize cellular machinery, it is reasonable to assume that some changes in DNA methylation occur subsequent to the mechanical and enzymatic disruption of cells. Additionally, in comparison to the use of whole tissue, FACS sorting of astrocytes yields significantly lower amounts of RNA and DNA for downstream molecular studies. This low ratio of yield to labor/reagent may limit the feasibility of some studies depending on the number and complexity of subsequent molecular applications as well as brain regions under study. Taking time to maintain proper pH and temperature as well as working efficiently to reduce total protocol time will aid in isolating healthy cells and thus high quality DNA/RNA. 
In regards to methylation studies, a variety of applications are currently available for detection of DNA methylation 48,49. Methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) was utilized to study KCNJ10, the gene of interest. MS-HRMA is useful in screening changes in DNA methylation of any given region of a gene of interest. This technique incorporates many of the same basic concepts and procedures as standard PCR amplification 50. Thus, reactions can be setup using a number of thermal cyclers and data analysis performed in most laboratories familiar with standard molecular techniques. One caveat to MS-HRMA is that the method provides estimates of the methylation status of a given region of DNA. This is in contrast to pyrosequencing which provides exact percentages of methylation of specific CpG sites. Additionally, depending on the number of CpG sites assessed within one region, using a linear regression may skew results for those regions with limited numbers of CpG sites. 
In studying the ability of DNA methylation to regulate KCNJ10 gene expression, we supplemented correlative studies with a dual luciferase assay to directly assess changes in the transcriptional activity of the KCNJ10 gene following hypermethylation. Use of the luciferase assay allows for alteration of the methylation status of a specific region of the gene and subsequent assessment of transcriptional activity directly related to these changes. Two major challenges of the luciferase assay are the laborious nature of the protocol and the loss of DNA input through each sequential step. Validation of the quantity and quality of DNA following each reaction as well as starting with a sufficient amount of DNA is essential to acquiring adequate amounts of DNA for transfection. Overall, the use of these techniques can be performed using tools found in most molecular laboratories and be can performed without the use of a large genomic sequencing facility, making these techniques widely accessible to investigators interested in DNA methylation.

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2. 
Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.
As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

<table><tbody><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Applied Biosystems</td><td>online</td><td>software to localize CpG Islands</td></tr><tr><td>EZ DNA methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Rat Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Methylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&amp;nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Used for gel extraction and DNA cleanup</td></tr><tr><td>Restriction enzymes</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>verify restriction digest sites</td></tr><tr><td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vector, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>renilla vector, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometer</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX and Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, saturated pH 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS software v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Getting Started Guide&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Fast Real-Time System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlating gene-specific dna methylation changes with expression and transcriptional activity of astrocytic kcnj10 (kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

성상 세포의 풍부한 인구는 eGFP는-S100β 형질 전환 동물 (27)의 FACS 정렬을 통해 인수되었다. 때문에 P0-P40 세 세포와 출생 후 하루 50 (P50)보다 오래된 동물에서 분리 된 분자 분자, 동물의 품질을 감소 그러한 실험에 최적이다. 대뇌 피질 조직을 다음 실험에 사용 하였다. 2-6 동물의 피질 함께 모았다. FACS는 UAB 종합 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 수행되었다. 정렬은 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FacsAria II 시행 하였다. eGFP는 음원은 488 nm의 레이저를 사용하여 얻었다; 보상은 필요 없었다. 게이트 인구는 앞으로 및 측면 산란 (그림 1B)를 기반으로 대상으로 하였다. 생균 인구 티듐 브로마이드 사균 표시기를 사용하여 측정하고 (도 1C)을 게이팅 하였다. 두 개의 다른 개체군은 eGFP는 프로파일 (도 1D)에 기초하여 관찰 하였다. 경험적 테스트 높은 eGFP는 함께 세포 집단 스루프로파일은 eGFP는 양성 세포 인구 (그림 1 층-F &#39;&#39;)로 확인되었다. 낮은 eGFP는 프로파일을 사용하여 두 번째 인구의 시각적 분석을 가능성이 성상 세포 프로세스 (그림 1G-G &#39;&#39;)에서 파편을 대표 eGFP는 표현 세포 조각을 공개하지만, 핵없는. 해리 다음 해리 eGFP는 긍정적 인 성상 세포의 대표 이미지하지만 (그림 2A)를 정렬 및 (그림 2B)가 표시되어 정렬 후 사전. 고립 된 eGFP는 양성 세포 인구는 ALDH1L1의 mRNA, 성상 세포 특정 마커 (39) (그림 2C)의 40 배의 증가를 보여 주었다. 또한, NG2 + 개 OPC 및 성상 39 S100β의 공유 표현에도 불구하고, 우리는 풍부한 성상 세포 인구 (그림 2C-D)의 분리를 나타내는, NG2의 mRNA의 4 배 감소, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (39)에 대한 마커를 관찰했다. RNA및 FACS로부터 단리 DNA가 메틸화 아스트로 후속 연구에 사용될 수있는 충분한 양 및 품질로 분류 하였다. 다양한 연령과 동물의 수에서 분리 된 총 RNA와 DNA는 FACS (표 5) 다음과 같은 분자 분자의 기대 수익률에 대한 참조로 표시됩니다. 이것은 수율이 또한 이용 동물 수, 잠복기 및 연구원의 경험에 따라 달라질 수 있음을 유의해야한다. 표 6은 이벤트의 가변성이 사용될 동물 및 인큐베이션 기간의 개수에 따라 획득 보여준다. 메틸화 연구의 경우, 높은 품질과 DNA의 충분한 양으로 시작하여 성공적으로 다운 스트림 애플리케이션에 필수적이다. RNA 또는 DNA 추출을위한 조직의 충분한 용해를 보장하기 위해, 조직 또는 세포의 모든 균질화은 용해시 거품을하지 않도록주의하면서, 23G 바늘의 7 배를 이용하여 분쇄으로 이어졌습니다. 일단 높은 품질의 DNA를 추출 중아 변환된다ED는, 관심 영역은 MS-르마 대상이 될 수있다. 품질과 중아 변환 된 DNA의 농도를 평가할 때, 분광 광도계는 중아는 DNA를 단일 가닥이다 환산 (33)의 외경 요인에서 읽기 전용으로 설정해야합니다. 중아 변환 된 DNA의 280 분의 260 값은 2.20-2.70였다. 메틸화 연구를 시작하기 전에, 그것은 적절하게 선택하고 MS-르마 연구에 열 자전거 타는 사람을 교정하는 것이 중요합니다. 또한, 하나는 MS-르마에서 생성 된 원시 데이터를 수출하고 활용하는 방법을 결정해야합니다. 어플라이드 바이오 시스템즈 고해상도 녹는 가이드가 7900HT 열 자전거 타는 사람을 보정을 지원하기 위해 사용 하였다 시작하기. 마지막으로, 데이터를 추출하고, 후속 데이터 분석 HRM 분석 소프트웨어로 반입 하였다. 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 전후의 시작과 매개 변수가 용융 곡선의 전환 근처에 설정 한 중지합니다. 피크 온도차가 알려지지 SA의 메틸화 상태를 추정하는 데 사용 된mples. MS-르마로부터 취득한 기준 메틸화 데이터 (pyrosequencing 데이터가 MS-HRM 프라이머와 동일한 영역을 대상으로 프라이머를 사용하여 집에서 생성) (도 3c)에서 생성 된 15 pyrosequencing 메틸화 데이터에 대응 밀접. 이중 루시페라아제 분석법이자 (도 4a)의 유전자의 메틸화 하이퍼 영역의 전사 활성을 평가하기 위해 사용 하였다. 각각의 CpG 섬 - luc2 플라스미드를 선형화하고 메틸화했다. 그러나 삽입 (의 CpG 섬) 및 벡터 (luc2) 모두 반응 중에 메틸화되어 있기 때문에, 하나는 메틸화 삽입을 절제해야하며, 재 결찰을 비 메틸화 벡터에. 때문에 플라스미드의 광범위한 조작에 상당한 손실이 발생 하나는 충분한 원료로 시작해야합니다. HpaII 소화 HpaII는 단지 비 메틸화 DNA (도 4b)를 소화 각 플라스미드의 메틸화 상태를 확인하는 데에 이용 하였다. 또한 주목해야한다O / N 메틸화가 불충분하면, 메틸화 된 CpG의 추가적인 SAM의 1X 및 1X는 30 ° C에서 배양 한 다음, 1 시간에 첨가 될 수있다. 추가 샘과의 CpG 메틸화의 또한 다음과 같은 O / N 배양을 계속합니다. 메틸화 및 비 메틸화 된 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 생성은 루시 페라 제 활동의 측정을 통해 DNA 메틸화 및 전사 활동 사이의 변화를 직접 평가를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig1.jpg" /> 그림 1. 외과 정렬은 eGFP는 + 세포 popoulation을 분리합니다. 구멍 잘라 50 ML 원뿔 튜브 (A)를 사용하여 상단 파파인 소화하는 동안 표면 가스를 교환 할 수 있습니다에. (B) 세포를 분류 전방 및 측면 산란 플롯에 기초하여 게이팅 하였다. (C)에 티듐 브로마이드 기반 사균 표시 게이트 생균 인구 (적색)를 이용 하였다. (D) 라이브 CEL높은 eGFP는 프로파일 (녹색) 및 낮은 eGFP는 프로파일 (보라색)과 한 - L 인구는 두 집단을 보여 주었다. 모든 그래프에 대해, y 축은 측 분산 영역 (SSC-A)를 나타내고; x 축은 전방 측 분산 영역 (FSC-A), 녹색 형광 단백질 영역 (GFP-A), 또는에 티듐 브로마이드 (EtBr로)를 나타낸다. (EG) 훽스트 해리 된 세포와 함께 배양하고, 해리 된 세포의 20 μL는 커버 슬립에 배치하고 이미지화 하였다. 광범위한 프로세스와 EE ( &#39;&#39;) eGFP는 + 성상 세포는 (NS)를 정렬하기 전에 가시화되었다. 정렬, 높은 eGFP는 + 인구 (POS) 다음 (FF는 &#39;&#39;) 훽스트 염색과-지역화 공동 eGFP는 + 세포 소마를 보여줍니다. (GG는 &#39;&#39;) 낮은 eGFP는 인구. 가능성 (모든 이미지, 규모 = 20 μm의) 성상 세포 파편을 나타내는, 훽스트 염색과 협력 지역화하지 않았다 eGFP는 + 염색을 보여 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52406/52406fig1large.jpg" target="_blank">주십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig2.jpg" /> eGFP는-S100의 β 형질 전환 동물의 분류 그림 2. 외과는 성상 세포의 풍부한 인구를 제공합니다. FACS (NS) 전에 해리 세포의 20 μL가 표시됩니다 (A)는, 프로세스가 그대로 유지 (규모 = 50 μm의). (B) 대표 화상이 후 FACS (FACS)는 세포를 나타낸다; 성상 세포 프로세스를 제거하고 세포 소마 남아 (규모 = 20 μm의)된다. (C) qPCR에 데이터가없는 분류 인구 (NS)에 비해 외과 세포를 분류에 ALDH1L1의 mRNA에 40 배 증가 (FACS)를 보여줍니다. (D) NG2의 mRNA가 외과에서 4 배 감소는 세포가 정렬되지 인구 (NS)에 비해 소트. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52406/52406fig2large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a><html> 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig3.jpg" /> MS-HRM 연구 그림 3. 샘플 데이터 및 분석. 메틸화 표준에서 발생하는 온도 차이 플롯의 (A) 예. 해당 %의 메틸화는 쥐 메틸화 표준에서 생성 된 선형 회귀 방정식의 각 곡선 (B)의 예를 들어 레이블이 붙어 있습니다. (pyroseq, 녹색 막대) 및 MS-르마 (회색 막대) pyrosequencing로부터 취득 퍼센트 메틸화 (C) 비교 KCNJ10의 영역을 변화시키는 메틸화 비슷한 수준을 보여준다. MS-HRM으로 동일한 영역을 대상으로 프라이머를 사용하여 집에서 생성 Pyrosequencing 데이터 분석. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52406/52406fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 항상 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;십t <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52406/52406fig4.jpg" /> 그림 4. 듀얼 루시 페라 제 분석은 차별적 메틸화 유전자 영역의 전사 활동의 평가를 할 수 있습니다. (A) 다이어그램 루시퍼 라제 전사 활성 분석의 프로토콜의 흐름을 보여줍니다. HpaII 소화 다음과 같은 비 메틸화 플라스미드 대 메틸화 (b)에서 DNA 젤 표시 차이. 비 메틸화 DNA 용이 플라스미드 DNA의 메틸화 성공을 보여주는, 메틸화 된 DNA와 비교하여 다음 HpaII 소화 분해된다. (C) DNA 젤 더블 소화 다음 삽입에서 벡터의 분리를 보여줍니다. DNA 분리, 벡터 및 삽입 후 젤이 추출됩니다. (D) DNA 젤 벡터와 삽입의 성공적인 재 결찰을 보여줍니다. 다시 결찰 플라스미드 비슷한 분자량 치료 플라스미드로 (untx)를 보유하고있다. 뉴 멕시코, 비는-충족hylated; M, 메틸화; RL, 다시 라이 게이션; untx는, 치료. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52406/52406fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> . </td><td> 볼륨 (μL) </td><td> X3 + 10 % 초과 </td><td> 샘플의 X # </td></tr><tr><td> MeltDoc MM </td><td> 10 μL </td><td> 33 μL </td><td></td></tr><tr><td> 프라이머 1 </td><td> 1.2 μL </td><td> 3.96 μL </td><td></td></tr><tr><td> 프라이머 2 </td><td> 1.2 μL </td><td> 3.96 μL </td><td></td></tr><tr><td> gDNA를 </td><td> 1 μL </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> DH 2 0 </td><td> 6.6 μL </td><td> 21.78 μL </td><td></td></tr></tbody></table> MeltDoctor Mastermix 표 1. 샘플 계산. 각각의 MS-HRM의 REA를 실행10 %를 초과와 세중 ction의는 피펫 오류를 보상한다. 마지막 열은 샘플의 여러 숫자에 필요한 계산을 나타냅니다. 각 반응의 총 부피는 20 μL이다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 주기 </td><td> 온도 (℃) </td><td> 시간 (초) </td><td> 램프 비율 (%) </td></tr><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> : 15 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 40 배 </td><td> 95 ° C </td><td> : 15 </td><td> (100) </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> : 60 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 녹는 매개 변수 </td><td> 95 ° C </td><td> : 10 </td><td> (100) </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> : 60 </td><td> (100) </td></tr><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> : 15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> : 15 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 보유 </td><td> 4<html> 76, C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 증폭을위한 샘플 프로토콜은 용융 곡선의 증폭 및 발생의 40주기 다음에 10 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성. 녹는 매개 변수 테이블에서 나열되어 있습니다. 고해상도 용융 온도의 취득을 허용 램프 속도의 변화를합니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 백분율 메틸화 (쥐 표준) </td><td> 피크 온도 차이 </td></tr><tr><td> Y </td><td> 엑스 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 5.670116 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 10.70448 </td></tr><tr><td> (10) </td><td> 15.5044 </td></tr><tr><td> (25) </td><td> 25.52295 </td></tr><tr><td> (50) </td><td> 34.43047 </td></tr><tr><td> (75) </td><td> 43.80894 </td></tr><tr><td> (100) </td><td> 53.88717 </td></tr></tbody></table>NT &quot;피크 온도차 데이터&gt; 표 3 예. 백분율 메틸화 표준. 피크 온도차 데이터 x 좌표로 표시된다. y 좌표로 표시되는 대표적인 피크 온도차 데이터는 한 유전자 영역에서 MS-HRM을 사용하여 획득 하였다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 피크 온도 차이 </td><td> 예상 메틸화 </td></tr><tr><td> 엑스 </td><td> Y </td></tr><tr><td> 샘플 1 (N = 4) </td><td></td></tr><tr><td> 47.450 </td><td> 81.115 </td></tr><tr><td> 46.​​292 </td><td> 78.657 </td></tr><tr><td> 41.694 </td><td> 68.894 </td></tr><tr><td> 47.292 </td><td> 80.779 </td></tr><tr><td> 샘플 2 (N = 4) </td><td></td></tr><tr><td> 29.925 </td><td> 43.904 </td></tr><tr><td> 24.269 </td><td> 31.894 </td></tr><tr><td> 25.061 </td><td> 33.575 </td></tr><tr><td> 25.389 </td><td> 34.272</td></tr></tbody></table> 표 계산 추정 퍼센트 메틸화 4 실시 예. 미지의 메틸화 상태의 샘플 피크의 온도차가 선형 회귀 식을 사용하여 메틸화 백분율을 측정하기 위해 사용된다. 두 가지 조건, 샘플 1과 샘플 2에서 대표 데이터가 도시되어있다; N = 각 조건 4. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 나이 </td><td> 동물의 수 </td><td> 총 RNA (NG) </td><td> 총 DNA (NG) </td></tr><tr><td> P4-P10 </td><td> 3-6 </td><td> 455-868 </td><td> 265-1523 </td></tr><tr><td> P19-P22 </td><td> 1-2 </td><td> 220-680 </td><td> 583-1483 </td></tr><tr><td> P40-P50 </td><td> 3-4 </td><td> 198-260 </td><td> 578-1700 </td></tr></tbody></table> 외과에서 획득 한 표 5. 총 RNA와 DNA는 세포를 분류. 나이와 동물의 수는 FA에 사용CS 실험이 나열됩니다. 참고 두 피질은 각 N. 전체 RNA를 이용하고, DNA를 예상 수익률에 대한 참조로 표시됩니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 나이 </td><td> 동물의 수 </td><td> 순위 이벤트 </td><td> NEG 이벤트 </td><td> 배양 시간 (37 ° C에서) </td></tr><tr><td> P26 </td><td> 1 </td><td> 2.18X10 ^ 6 </td><td> 1.15X10 ^ 6 </td><td> 20시 분 </td></tr><tr><td> P26 </td><td> (2) </td><td> 4.4X10 ^ 6 </td><td> 2.78X10 ^ 6 </td><td> 20시 분 </td></tr><tr><td> P26 </td><td> (2) </td><td> 9.2X10 ^ 6 </td><td> 3.3X10 ^ 6 </td><td> 30:00 분 </td></tr></tbody></table> 긍정적 인 (eGFP는 +) 이벤트와 부정적인 사건의 P26 번호에서 출생 후의 일 26시 외과에서 획득 한 이벤트 표 6. 번호는 사용 동물과 잠복기의 수에 따라 달라집니다.

Watch this Scientific Journal Video about Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1 at JoVE.com

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

7.9K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression. 

비디오: Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

연구

유전학

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

생화학

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

신경과학

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

발생학

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

생체공학

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터