보조금 지원이 작품은 과학 연구 (FNRS), 레 미스 드 난 연구소 보르, FNRS 조작 Télévie, 벨기에의 계획 암, 퐁 Lambeau-Marteaux, 퐁 JC Heuson과 퐁 Barsy에 대한 벨기에 기금 폴더 만.

참고 : 모든 표본은 각 환자에서 얻은 정보를 담은 서면 동의 연구소 쥘 보르 데의 의료 윤​​리위원회의 승인을 프로토콜을 사용하여 획득 하였다. 조직 파쇄 1. 준비 <ol><li> 절제된 조직 (수술실에서 절제 악성 및 정상 조직)를 해부 즉시 픽업 훈련받은 사람이 병리 실험실에 있습니다. 종양, NANT는 (가능한 한 종양에서 가장 먼 거리를 촬영) 및 정상 조직의 조각은 정기적으로 (1) 내에 처리 - 인체 조직에 대한 표준 바이오 안전성 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 수술 절제의 3 시간. 프로토콜의 흐름도는도 1에 도시되어있다. </li><li> 모든 조직편 (정상 및 종양 NANT)을 달아 길이, 폭, 높이 (길이 x 폭 x 높이)를 측정한다. 이는 세포의 개체군에 대한 후속 정규화 중요한 단계, 추출 된 RNA 등이며 NOTE : 샘플 크기의 범위는 더 지방이 가능하다면 100 10,000 mm의 3입니다. </li><li> 조직이 실제로 종양의 일부임을 확인하기 위해 H &amp; E 염색 용 유리 슬라이드에 종양 조각을 각인. <ol><li> 종양 조각에 유리 현미경 슬라이드를 누르면 몇 초 동안 손가락으로 부드럽게 압력을 적용하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 물에 세척 과정에서 다음 2 분 동안 이소프로판올과 슬라이드를 수정합니다. 마이어의 헤 마톡 실린 30 초 동안 조직을 Counterstain과. </li><li> 물 여섯 화장실에서 슬라이드를 씻으십시오. 15 초 동안 Phloxine B 2 % 얼룩. </li><li> 물 한 욕조와 이소프로판올 및 마무리의 네 화장실 의해 물 한 욕조에 씻으십시오. </li><li> 1 분 드레인에 대한 이소프로판올에 품어. 자일 렌의 두 화장실에 걸린. </li><li> 자일 렌을 기반으로 장착 매체를 마운트합니다. 종양 세포 수 (그림 2)에 대한 검사. 참고 : - 기질, 림프 또는 광고 주로 종양 세포가 각인 된 슬라이드에 충실ipose 세포는 거의 종양 세포 사이에 공간을두고, (그림 2) 남아. </li></ol></li><li> 멸균 사용 - 화학적으로, 무 혈청 조혈 세포 배지 1 ㎖를 함유하는 작은 배양 접시에서 조직 단편을 배치 작은 조각 (2 ㎜ × 2 ~ 1)로 그것을 실온에서 (이하 매체 라 함)와 주사위 메스. </li><li> 기계 dissociator의 C 관 (조직 조각 + 매체) 모두를 전송합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체의 2 ㎖로 배양 접시와 메스를 씻어 C 관 (해리에 대한 매체의 볼륨 = 3 ㎖)이 추가. </li><li> 단일 세포 현탁액에 조직 조각을 균질화 C 튜브의 기계적 dissociator 프로그램 A.01 (가장 부드러운 프로그램)를 사용합니다. (한 사이클 = 25 초) 장치에서 C 튜브를 놓고 두 번 연속으로 프로그램을 실행합니다. 참고 :이 균질화 절차는 설립과 인간의 유방 조직, 다른 다치 대한 검증되었습니다또는 또는 조직 유형이 다른 프로그램을 사용해야 할 수도 있습니다 먼저 테스트해야합니다. </li><li> 장치에서 C 튜브를 제거하고 50 ML 튜브에 앉아 40 μm의 셀 스트레이너에 직접 균질을 가만히 따르다. 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여, 셀 스트레이너로 C 튜브에 남아있는 액체를 옮긴다. </li><li> 1 ㎖의 마이크로 피펫 팁을 사용하여 15 ML 튜브에 여과 된 액체를 전송합니다. 일시적으로 셀 스트레이너 및 50 ml의 튜브를 유지. </li><li> 배지 3 ㎖로 추가로 C 튜브를 헹구고 여전히 다시 50 ㎖ 튜브에 장착 셀 스트레이너로, 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여,이 전송. 부드럽게 연속적으로 용출액 오염을 막기 위해 폐기 된 깨끗한 파스퇴르 피펫 또는 1 ml의 팁을 사용하여 여과기 주위를 이동하여 50 ㎖ 튜브에 unhom​​ogenized 조직에 갇혀 잔류 액의 최대 양을 짜내. </li><li> 거꾸로 t의 셀 스트레이너를 배치그는 원래 C 튜브와 unhom​​ogenized 조직은 다시 C 튜브에 떨어질 수 있도록 매체의 3 ㎖ 씻어. </li><li> A.01 프로그램의 두 사이클 단계 1.7로 다시 균질화. </li><li> 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너를 통해이 두 번째 균질을 붓고, (단계 1.10에서와 같이) 3 ㎖ 매체를 다시 C 튜브를 씻어 다시 최대 압박 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너에 파스퇴르 피펫으로 전송 셀 스트레이너에 갇혀 잔류 결합 조직으로부터 액체의 양. </li><li> 이 시점에서, ~ 2.5 ml의 부피는 15ml의 튜브이고 ~ 50 ㎖ 튜브에서 9 ㎖의. </li></ol> 조직의 상층 액과 세포의 2. 분리 <ol><li> 실온에서 600 XG에서 15 분 동안 15 ㎖ 중의 균질 물 및 50 ㎖ 튜브를 원심 분리기. </li><li> 깨끗한 튜브에 15 ML 튜브에서 SN을 가만히 따르다 일시적으로 4 ℃에서 저장한다. 이 뜨는 = 차 종양, NANT 또는 정상 TIssue SN (최종 부피 2.5 ml)을 연속적으로 정화와 미래 분석 (아래 참조) -80 ° C에서 저장 이전에 분주합니다. </li><li> 50 ML 튜브에서 상층 액을 제거한다. </li><li> 부드럽게 1ml의 배지의 최종 부피 모두 세포 펠렛을 재현 탁. 요약하면, 첫째 부드럽게 (딱딱한 표면에 튜브를 눌러) 모두 튜브에 세포 펠렛을 휴식. 배지 500 μL와 50 ml의 느슨한 세포 펠렛을 재현 탁하고 제 펠렛을 재현 탁하는 15ml의 튜브에이 세포 현탁액을 전송. 세포의 최대 복구를위한 매체의 두 번째 500 μL 한 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고 : 작은 튜브로 전송 세포 현탁액 10 μL은 트리 판 블루 10 μL (희석 한 1)과 혼합한다. 주 :이 시점에서 세포 현탁액의 분획은 또한 셀 크기, 입도를 평가하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수 있고 더 PREC 모집단에 대한 마커의 수가 제한 원한다면이전에 광범위한 분석이나 실험에 균질의 상대적인 세포 분포의 이세 평가. 흐름에 의해 모든 분석은 세포 계측법 개체군의 정상화 CD45 라벨을 통합합니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 종양, NANT, 또는 정상 조직에서 셀은 추가의 정제 또는 분석을위한 준비가되어 있습니다. 수술과 같은 날에 수행 할 때 이러한 추가 단계가 최상이다. 주 : 유세포 분석뿐만 즉시 1 초 동안 볼 텍싱, 세포 펠렛을 적혈구 세포 용해 완충액 0.4㎖를 첨가하고 방에서 10 분의 최소 배양하여 항체 라벨링 후 용해되어야 잔류 적혈구 세포 분류되지 분석하기 전에 온도 (빛으로부터 보호). </li></ol> 조직 뜨는 3. 명확화 <ol><li> 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에서 조직 SN와 1.5 ml의 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 t 제거그는 만지거나 펠렛을 방해하지 않고 뜨는. 수와 원하는 분량의 볼륨에 따라 깨끗한 튜브 (또는 튜브)에 전송합니다. </li><li> 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 뜨는을 저장합니다. </li></ol> 4. 환자의 혈액 <ol><li> 헤파린 튜브에 정맥 천자에 의한 제어 수술 전에 일 각 환자의 혈액 샘플을 수집합니다. 혈장과 버피 코트를 얻기 위해 브레이크 오프 20 ºC에서 10 분 동안 400 XG에 혈액을 원심 분리기. </li><li> 혈장을 분리하고 20 ºC에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여이를 명확히. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 플라즈마. 매체에서 버피 코트를 희석 </li><li> 즉시 분석 모집단 분리, DNA / RNA / 단백질 추출 또는 동결에 앞서 표준을 Ficoll-hypaque 구배 원심 분리를 이용하여 단핵 세포를 분리. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법 <ol><li> 제조에 따라 라벨 세포빛으로부터 보호 4 ° C에서 R의 지침. 세포 펠렛을 세포 용해 완충액 0.4 mL를 넣은 후 표지 항체 조직편으로부터 세포 현탁액를 Lyse 적혈구. </li><li> 소용돌이는 즉시 1 초간 및 빛으로부터 보호 실온에서 10 분의 최소, 부화. 세척하지 않고 데이터 수집을위한 유동 세포 계수기에 표시된 세포를 전달합니다. </li></ol>

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The authors declare that no conflict of interest exists.

이 연구는 이후의 세포 분류, 추출, 동결 보존 및 / 또는 CD45 + 개체군의 표현형 분석을위한 소화 효소없이 정상 및 악성 유방 조직 균질의 빠른 준비를위한 최적화 된 방법을 설명합니다. 이 실험적인 접근의 목표는 밀접하게 자신의 생체 상태를 반영하고 수술실에서 신선한 조직의 최소한의 조작으로 정상 조직에 비교 TIL의 이미지를 생성하는 것입니다. 지금까지, 우리의 실험실&gt; 250 신선한 BC 조직 (종양 및 NANT)&gt; 유방 감소에서 35 정상 유방 조직을 분석하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다. 원칙적으로, 이러한 프로토콜들은 다른 유형의 종양 또는 조직에 직접 적용한다; 그러나, 몇몇 최적화가 필요할 수있다 (즉, 기계적 해리 프로그램 사이클의 수, 매체 볼륨 등). necess 될 수있는 더 큰 조직 조각을 사용하여 낮은 림프구 침윤 조직에 대한우리는 림프구 수가 낮은 정상 조직을 위해 할 것입니다 진. 대안 적으로, 밀도 구배 원심 분리 단계는 백혈구 현탁액을 풍부하게 추가 될 수있다. 유방 종양 침투 인간의 T 및 B 세포 개체군의이 분석은 유동 세포 계측법에 의해&gt; 100 마커의 평가를 포함하고 특정 림프구의 정화 (74 마커 데이터 유동 세포 계측법은 보충으로 구 Trantien의 데이터, 등. (9)에서 사용할 수 있습니다) 이후 면역 학적 및 분자 분석을위한 소집단. 또한, 우리는 기본 종양 SN에서 사이토 카인, 케모카인, 면역 글로불린 및 종양 항원을 평가 한 종양 미세 환경에서 이러한 분자 매개체의 반영으로 10, 11 (NANT과 정상 조직의 SN에 비해). 우리는 또한 종양 SN 건강한 기증자로부터 말초 혈액 림프구를 치료 및 TIL 검출 유전자 발현의 변화가 많은 구체적으로 재생 될 수 있다는 것을 도시의 효과를 테스트 한 &lt;SUP&gt; 9. 이들 미세 환경에서, 종양 세포 및 기질은보다 긴밀 특징적이다 이동성 면역 세포,보다 조직 매트릭스에 유지된다. 여기에 설명 된 방법은, 단리 및 소화 효소없이 TIL 분석을위한 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 우리의 수많은 시도가 실패되었습니다 같은 종양 조각에서 실행 가능하고 수용체 양성 림프 및 상피 세포를 생산하는 짧은 소화 효소와이 기계 균질화 방법을 가입. 조직 균질화 효율적 림프구를 해제하지만, 종양 세포 생존 능력의 상당한 손실을 초래한다. 조직의 짧은 효소 소화 가능한 종양 세포 (소화 시간의 함수로서 총 수 증가)를 해방하지만 림프구, 특히 명백 많은 표면 수용체의 발현에 평행 감소의 결과를 갖는다. 따라서, 동일한 다치에서 종양 세포 및 TIL의 비교 분석또는 별도로 두 순차적 종양 단편을 처리하는 것이 여전히 필요하다. 현재, TIL을 특성화하기위한 연구의 대부분은 종종 기계적인 절개 4-8 어떤 형태의 결합 효소 소화 (O / N 시간)을 사용했다. 추가 분석 또는 치료 TIL의 확장은 일반적으로 (주 일) TIL 자극 또는 에이전트와의 종양 조직 단편의 생체 외 배양 이후 13-15을 포함한다. 여기에 설명 된 조직에 대한 빠른 해리 비 효소 적 방법은 종래들은 팽창 또는 분석 정상 및 비정상 조직편으로부터 그대로 CD45 + 세포를 추출하기위한 간단하고 재현성있는 수단을 제공한다. tumorectomy을받은 환자에서 CD45 + 세포의이 신속 인수 가능성이 예후 바이오 마커 분석에서 사용하기 위해 개발 될 수있다. 또한, 생체 외 팽창을위한 큰 잠재 고르 생성됨 immunothe 입양 이전rapy.

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.
Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.
In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine is somewhat equivalent</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>or other standard table top centrifuge</td></tr><tr><td>Centrifuge 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>or other standard microcentrifuge</td></tr><tr><td>Esco Class II A2 Biosafety Cabinet</td><td>ESCO global</td><td></td><td>or other standard BSL2 hood</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>or other microscope compatible for a hemacytometer</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker Chamber</td><td>Marienfield&amp;nbsp;</td><td>640210</td><td>or other standard hemacytometer</td></tr><tr><td>Navios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>or other flow cytometer (8-10 color recommended)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine uses Filcon</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>or standard single use sterile scalpel</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 &amp;micro;m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>BD FACS Tube 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur Pipette 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>Microfuge Tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>or other non-pyrogenic plasticware</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>serum-free medium recommended</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>standard physiological PBS</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>or other vital stain</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>Fixable viability Dye eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr><tr><td>anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>for flow cytometry experiments</td></tr></tbody></table>

a simple and rapid protocol to non-enzymatically dissociate fresh human tissues for the analysis of infiltrating lymphocytes

선천성 및 후천성 면역 반응 모두에서 종양 탈출 특징으로 면역 시스템을 무력화하는 악성 세포의 능력은 지금 암의 중요한 특징으로 받아 들여진다. 유방암에 대한 우리의 연구는 종양 침윤 림프구가 종양의 진행과 환자 결과에서 재생하는 적극적인 역할에 초점을 맞추고있다. 이 목표를 향해, ​​우리는 그들의 원래 상태로 그들을 근접 평가하기위한 노력의 일환으로 정상 및 비정상 조직에서 그대로 림프 세포의 신속한 분리를위한 방법론을 개발했다. 표면 수용체 발현 비교하는 효소 - 소화 된 조직을 유지하면서 기계적 dissociator 쇼 모두 증가 된 생존율 및 세포를 회수하여 제조 균질. 또한, 나머지 불용성 물질의 소화 효소는 기본 균질의 양적, 질적 측정 가능성이 진정으로 조직 fragm에 침투 부분 집단을 반영하는 것을 나타내는 추가 CD45 + 세포를 복구하지 않았다천만에. 이러한 균질 림프 세포는 쉽게 면역 (표현형, 확산 등) 또는 분자 (DNA, RNA 및 / 또는 단백질)을 이용하여 특성화 할 수 접근한다. CD45 + 세포는 모집단 정화 시험 관내 팽창 또는 냉동 보관을 위해 사용할 수있다. 이 접근법의 또 다른 장점은 균질 물에서 뜨는 기본 조직과 정상 조직에서 악성 사이토 카인, 케모카인, 면역 글로불린 및 본 항원을 특성화하고 비교하기 위해 사용될 수 있다는 점이다. 이 프로토콜 기능을 매우 잘 인간 유방 조직 및 정상 및 비정상 다양한 조직에 적용 할 수 있어야한다.

시판 티슈 해리 용액 또는 콜라게나 제의 다양한 실험 혼합물의 DNase 및 / 또는 히알루로니다 제 억제제 중 하나와 조직 절편의 소화 효소는 세포 표면 수용체의 다양한 절단. 최초 유방 종양 침윤 CD4 + T 세포에 대한 우리의 연구가 집중, 신속 인해 소화 효소 표준 프로토콜을 사용하여 4-8 표면 CD4 수용체의 절단에 중요한 기술적 문제를 제시 하였다. 우리는 높은 생존 성 림프구 (도 3a)에도 불구하고, I 및 II 완전히 세포 표면 CD4로부터 제거하는 콜라게나 제를 구하고, 또는 DNase의 저해제 및 히알루없이 콜라게나 제 효소의 다양한 테스트. 동일한 환자의 소화 혈액 및 골수 (비교 소화 림프절 및 종양 조직에서 검출 낮은 CD4 항체 라벨링 - (2- HR 1) CD4에 적당한 효과는 짧은 배양 시간에서 콜라게나 제 IV으로 관찰그림 (b); 우리는 우리가 소화 및 소화되지 않은 림프절과 종양 조직)을 비교 할 수 없습니다받을 인해 조직에 제한이 있다는 점 유의. CD4의 이러한 손실은 건강한 혈액 공여자로부터 단리 소화 분해 및 CD4 + T 세포를 비교하여 콜라겐 IV 소화 기술 부산물 인 것으로 확인되었다 (데이터는 미도시). 이러한 CD4 LO T 세포는 자성 비드를 이용하여 콜라게나 제 IV 소화 조직편으로부터 단리 될 수있는 반면, 정제 된 개체군 자주 종양 미세 환경에서 다른 세포에 의해 오염 다양한 양 함유하고, 따라서 우리의 실험 목적 차선이었다. 더 나은 방법에 대한 지속적인 검색에서, 2008 년에 우리는 효소를 사용하지 않고 새로운 기계 dissociator을 테스트했다. 이 장치는 신속하고 표면 수용체의 무결성과 유방 조직 균질 생산 (9)를 유지했다. 종양 세포 균질의 FOLLO의 도트 플롯 세포 계측법 대표 흐름상피 세포 (는 EpCAM) 및 백혈구 (CD45)에 대한 특이 항체와 날개의 분리 및 표시는 그림 3C에 표시됩니다. 이러한 이미지는 유방 종양 균질 일반적인 일상적인 관측이다. 이 프로토콜은 크게 CD45 + 세포 (4 % 죽은 세포)의 생존을 변경하지 않습니다; (도시 종양의 38 % 죽은 세포, 종양 사이에서 변화) 그러나, 생존는 EpCAM + 세포의 상당한 손실이있다. 이 손실에도 불구하고, 실용적인는 EpCAM + 및 CD45 + 서브 세트들은 많은 상피 세포 (= 종양 세포), 작은 상피 세포 및 큰 CD45 + 세포 및 작은 CD45 + 세포 (대부분의 세포 내로의 크기와 구조에 근거하여 분리 될 수있다 주로 림프구있는 아르도 3C). 이 방법을 사용하여 얻은 가능한 CD45 + 세포의 유의 한 증가는 재생 가능한 여러 가지 빛깔의 인수 사용 (데이터 유동 세포 계측법 허용최대 10 색)보다 충분히 유방암 TIL 서브셋을 특성화. 주요 TIL 서브 세트의 도트 플롯 계측법 주제 유동은 최근 우리의 실험은 표준 T 및 대 세포 염색을 포함한 종양 10-12 침투 부 T 및 B 세포의 서브 세트를 검출하고 정량화하는 것이 가능하다는 것을 증명하여,도 4에 나타낸다 B 세포 전사 12 요인. 림프구에 대한 게이팅 전략은 생존 얼룩으로 식별 가능한 CD45 + 세포를 기반으로 (참고 :. 종양이 크게 세포 파편과 BC 하위 유형, 등급 등에 따라 죽은 상피 세포의 양이 다를 수 있음). 이 접근법은 성공적 마이크로 어레이 또는 9 QRT-PCR을 이용한 유전자 발현 해석에 대해 선별 또는 자성 비드와 세포 파쇄로부터 림프구 아 집단을 정제하는데 사용되었다. 사이토 카인과 면역 글로불린을 포함하여 SN,에 용해 매개체, bead-를 사용하여 정량화 된<html> 조직 단편의 크기로 정규화 결과 데이터를 기반으로하는 면역. 사이토 카인의 발현 (TH1 /은 Th2 / Th7 / TH9 / Th17 풀) 또는 정상 유방 조직에서 SN 기원전 SN 총 면역 글로불린 (의 IgA, IgE 항체, IgG의, IgM 항체)의 비교는 종양 조직과 관련된 모두의 증가를 보여준다 (그림 5). 이러한 기본 조직 SN 년대 효과적으로 항원 10-12을 분석하여 실험적으로 구 정상 세포에서 표현형 TIL 재생, 건강한 공여자 림프구를 치료하는데 사용되어왔다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52392/52392fig1highres.jpg" width="700" /> 그림 1. 프로토콜 흐름도. 신선한 사람 조직이어서 인체 조직을 침윤 림프구를 평가하는데 사용될 수있는 분석 방법을 처리하기위한 절차는 우리 나타낸다. YS &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52392/52392fig2highres.jpg" width="700" /> 그림 2. H &amp; E는 유방 종양 조직 인쇄물의 이미지를 스테인드. 신선한 유방 종양 조직 조각에서 촬영이 인쇄물은, 전송되지 않았습니다 영역을 반영하는 열린 공간으로 종양 세포의 존재를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52392/52392fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52392/52392fig3highres.jpg" width="700" /> . 림프구 분석을위한 유방 조직 해리의 그림 3. 최적화 유세포 분석 : 소화와 콜라게나 제 I / II에서 림프구에 (A) CD4 표면 발현은 종양 조직을 절단; (B) 림프절 종양 조직 분해 재치 CD4 림프구에서 발현같은 환자에서 소화되지 않은 혈액과 골수 세포에 비해 시간 콜라게나 제 IV와; 총 백혈구 (CD45 +)과 종양 조직에서 상피 세포 (는 EpCAM의 +) 및 (C) 분석 급속 기계적 프로토콜이 여기에 기술하여 해리. 상피 세포 및 우리의 프로토콜을 사용하여 CD45 + 세포의 생존 능력 고칠 가능성 염료의 결합을 통해 평가된다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52392/52392fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52392/52392fig4highres.jpg" width="700" /> 도 파쇄 림프구 서브 세트들을 제 종양 침윤. 빛깔 유세포 분석은 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 기계적 해리 후에 수술 당일에 수행 하였다. 가능한 세포 및 주요 림프구 소집단그림 제목 : Re : CD3는 팬 T 세포 마커, CD4 및 CD8 주요 T 세포 하위 집합 마커이며, CD19는 팬 B 세포 마커입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52392/52392fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52392/52392fig5highres.jpg" width="350" /> 뜨는 그림 5. 가용성 매개체. 사이토 카인의 패널 (TH1 /은 Th2 / Th7 / TH9 / Th17) 및 면역 글로불린 (의 IgA, IgE 항체, IgG의, IgM 항체는) SN 정상 및 BC에서 파생 된 분석 비드 기반 면역 분석법을 이용하여 평가 하였다 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 조직.

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A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K 조회수.  Université Libre de Bruxelles. This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

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Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of cancer cell populations typically generate a single endpoint measurement that does not distinguish between cancer cell subpopulations with different invasive potential. Also, the tumor microenvironment consists of different resident stromal and immune cells that alter and participate in the invasive behavior of cancer cells. Invasion into tissues also plays a role in immune cell subpopulations fending off microorganisms or eliminating diseased cells from the parenchyma and endothelial cells during tissue remodeling and angiogenesis. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) that utilizes impedance biosensors to monitor cell invasion was a major step forward beyond endpoint measurement of invasion: this provides continuous measurements over time and thus can reveal differences in invasion rates that are lost in the endpoint assay. Using current RTCA technology, we expanded dual-chamber arrays by adding a further chamber that can contain stromal and/or immune cells and allows measuring the rate of invasion under the influence of secreted factors from co-cultured stromal or immune cells over time. Beyond this, the unique design allows for detaching chambers at any time and isolating of the most invasive cancer cell, or other cell subpopulations that are present in heterogeneous mixes of tumor isolates tested. These most invasive cancer cells and other cell subpopulations drive malignant progression to metastatic disease, and their molecular characteristics are important for in-depth mechanistic studies, the development of diagnostic probes for their detection, and the assessment of vulnerabilities. Thus, the inclusion of small- or large-molecule drugs can be used to test the potential of therapies that target cancer and/or stromal cell subpopulations with the goal of inhibiting (e.g., cancer cells) or enhancing (e.g., immune cells) invasive behavior.

We describe an approach to detect and capture invasive cell subpopulations in real-time. The experimental design uses Real-Time Cellular Analysis by monitoring changes in the electric impedance of cells. Invasive cancer, immune, endothelial or stromal cells in complex tissues can be captured, and the impact of co-cultures can be assessed.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

암 연구학

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

의학

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

생체공학

Optimized Protocol for Mouse Wound Healing Model with Stem Cell-Derived Exosomes

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions 

The management of acute full-thickness skin injuries presents a considerable challenge in clinical practice. The complexity of wound healing, involving diverse cell populations and the intricate wound microenvironment, complicates the assessment of treatment effects and their interactions using traditional experimental approaches. Single-cell transcriptome sequencing technology has revolutionized the understanding of cellular functions and mechanisms during wound healing. However, the variability in methodologies for creating mouse wound models introduces confounding factors that can impact experimental results. Furthermore, the process of dissociating mouse skin tissues presents significant technical hurdles, highlighting the critical need for high-quality single-cell suspensions for accurate transcriptome sequencing. Therefore, this study aims to optimize the construction of mouse wound models to accurately assess changes in wound closure while eliminating variables that could influence the subsequent sequencing result. Additionally, the preparation of single-cell suspensions was performed using both enzyme preparation protocols and test kit protocols to optimize cost and effectiveness.

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

This study presents two crucial experimental techniques: the construction of a murine wound model for assessing wound closure and the preparation of single-cell suspensions from murine skin to preserve cellular viability.

The management of acute full-thickness skin injuries presents a considerable challenge in clinical practice. The complexity of wound healing, involving ...

Mechanical Dissociation: A Method to Obtain Viable Cells from a Tissue

Source: Garaud et. al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52392/a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human">A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (2014).
This video describes the non-enzymatic dissociation of fresh human tissue to obtain viable cells. The technique is used for qualitative and quantitative analysis of CD45 positive cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues.

기계적 해리: 조직에서 생존 가능한 세포를 얻는 방법

Source: Garaud et. al., A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. J. ...

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

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산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

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다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

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