Name: near infrared (nir) light increases expression of a marker of mitochondrial function in the mouse vestibular sensory epithelium
Uploaded: 2015-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
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저자는 mRNA의 추출 및 PCR과의 도움 폴 박사 알면서하는 씨와 제네 비브 선생을 인정하고자 및 지원에 대한 가넷 패스포트와 로드니 윌리엄스 기념 재단.

윤리 진술 : 아래에 설명 된 모든 절차는 시드니 동물 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 동물 주 : 1 8~9개월 된 마우스 (C57 / BL6)는 동물 자원 센터 (퍼스, 호주)에서 얻었다. 마우스는 시드니 대학의 보쉬 설치류 시설에 수용되었다. <ol><li> 물과식이에 액세스 할 수있는 12/12 시간 빛 / 어둠주기에 표준 마우스 케이지 하우스 마우스. </li><li> 근적외선에 각 연령 그룹에서 나누기 마​​우스 (NIR) 처리, 또는 가짜 비교를 위해 (제어) 그룹을 처리 하였다. </li></ol> 2. 근적외선 (NIR) 조사 및 위장 치료 <ol><li> 처리 체제의 완료 전에 모발의 빠른 재성장을 막기 위해 가능한 한 가깝게 전기 면도기와 마우스 두경부에 털을 면도. 마우스의 무균 상태를 유지하기 위해, 70 % 에탄올을 사용하여면도 동물과 별도의 케이지에서 동물 사이의 F10 수의학 살균제 사이에 악기를 청소합니다. 동물 오버 처리되지 않도록 치료의 시작 3 일전 -이 2 마십시오. </li><li> 꼬리의 근위 끝을 잡고 마우스를 제지 및 false 결과로 이어질 수있는 스트레스를 최소화하기 위해이 한 손 또는 벤치 탑의 손바닥에서 휴식을 취할 수 있습니다. </li><li> LED NIR (670 ㎚) (발광 다이오드) 1 장치 잡고 - 2 ㎝ 떨어져 노출 (음모) 지역에서을 90 초 (그림 1A)의 장치에 전환합니다. 참고 : 90 초 노출의 결과로서 온도 변화를 물 100ml에 0.2 ° C &lt;로서 측정 하였다. </li><li> 동물의 가짜 치료 그룹에 대해 2.3하지만 장치가 꺼져 (그림 1B)를 떠나 - 반복 2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 동물의 근적외선 차단 치료 그룹의 2.3하지만 알루미늄 호일로 장치를 커버 - 반복 2.2 단계를 반복합니다. </li><li> approximat 매일 2.5 - 반복 2.2 단계5 일 연속 전자 24 시간 간격. </li><li> 다섯째 날 후 처리에 모두 귀에서 전정 감각 상피 (3의 cristae 1 utricular의 황반)을 추출 (아래 3 항 참조). </li></ol> 3. 조직 추출 (20) <ol><li> (26)의 NaHCO3, 11 포도당, 250 글리세롤, 2.5의 KCl, 1.2의 NaH 2 PO 4, 1.2의 MgCl 2, 2.5 염화칼슘 2 : (mm 단위)로 구성된 글리세롤 기반 인공 뇌척수액 (ACSF) 300 ml의를 준비합니다. CaCl2를 첨가하기 전에, 7.4의 pH를 확립 칼슘 침전 (흐림)를 피하기 위해 carbogen (95 % O 2 및 5 % CO 2)와 용액을 기체. 얼음 슬러리가 형성되도록 45 분 동안 -80 ℃ 냉동고에서 용액을 냉각. </li><li> 표시된 나사 상단 모세관의 RNA 분리 용해 버퍼를 준비하는 것은 (뚜껑 터지는를 중지 할 때 동결 및 액체 질소에 해동 사이의 튜브 압력 변화)에 따라제조업체 또는 일반적인 실험실 관행의 지시에. 알루미늄 듀어 플라스크에 액체 질소를 준비합니다. 참고 : 액체 질소를 처리 할 때 보호 복 및 보호 eyeware을 사용합니다. 그 가스 형태의 볼륨이 약의 액체 형태의 700 배이며, 질식의 원인이 될 수 있습니다 액체 질소는 환기가 잘되는 방에서 사용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 깊이 복강 내 주사를 통해 케타민 (400 ㎎ / ㎏)와 쥐를 마취시키다. 뒷다리 반사가 완전히 마우스가 완전히 마취되어 있는지 표시로 가라 앉을 수 있습니다. </li><li> 날카로운 스테인레스 스틸 가위로 마우스를 목을 벨과 면도날을 사용하여 두개골의 시상 피부를 따라 절개를 (# 22 반올림). 이 시점에서과를 통해 3.5 단계 - 3.9, 조직을 통해 얼음처럼 차가운 ACSF의 일반 응용 프로그램에서 가능한 한 멋진 두개골 금고, 뇌 및 기본 전정 장치를 유지합니다. </li><li> 에 작은을 표준 패턴 가위의 뾰족한 팔을 사용하여리터 람다의 두개골 절개 및 시상 봉합을 따라 잘라. </li><li> 부드럽게 뇌를 끌어없이 뼈의 하부 표면에 가능한 한 가깝게 블레이드를 유지 정수리 뼈 아래에 얕은 rongeurs의 한 팔을 밀어 넣습니다. 안전하고 뇌가 노출 될 때까지 후방 측면 정수리 뼈와 후두골을 당깁니다. </li><li> 작은 스테인레스 스틸 주걱을 사용하고 vestibulocochlear 신경 (CN VIII)을 노출 멀리 전방 및 중간 두개골 포사에서 뇌를 들어 올립니다. 직접 전정 모발 세포에 분포 일차 구 심성 축색에 불필요한 장력 않도록 신경을 횡단면. </li><li> CN VIII의 절개 후 토토의 뇌를 제거합니다. </li><li> 달팽이관 중간 두개골 포사의 주변 전정 기관을 포함하는 뼈 미로를 관찰합니다. 각각의 뼈 미로 옆에 두 개의 작은 절개를 확인하고 앞쪽에 반원형 운하를 누른 후 잡아 당겨 전체 구조를 절제동맹. </li><li> 즉시 지속적으로 carbogen와 관류 동안 (3.1 단계에 설명 된대로) 얼음처럼 차가운 ACSF 솔루션을 포함하는 해부 접시에 절제된 미로를 체험. </li><li> 실체 현미경에서 달팽이관으로 미로를 누른 상태에서 집게로 접시의 바닥에 고정합니다. <ol><li> 전방 반원의 운하 (SSC) 팽대부 위의 뼈에 작은 구멍을 긁어 직선 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 즉시 뼈 아래에 도달 바깥쪽으로 멀리 팽대부에서 쓸어 넘겨이 개방을 확대. 구멍에 집게를 밀어 아래 깨지기 쉬운 막성 미로를 손상하지 않도록 여기에주의하십시오. 난형 낭, 전방 및 측면 ampullae 모든 노출 될 때까지 이런 식으로 계속합니다. 가능하면 또한 후방 팽대부를 제거합니다. </li></ol></li><li> 미세 집게를 사용하여 부드럽게 난형 낭을 들어 올려가 완전히 분리 될 때까지 뼈 미로에서 멀리 ampullae. 가능하면 그들을 붙잡아관련 반원의 운하에 의해 감각 상피의 손상을 방지합니다. 어떤 경우에는, 반원형 멤브레인 덕트의 기단 부분은 뼈 ampullae를 해제 홍채 가위로 절단 할 필요가있다. </li><li> 안전하게 단계 3.2에서 이전에 제조 된 용해 버퍼에 포셉의 팁과 장소 사이의 전정 기관을 파악. 부드럽게 전정 기관이 집게에서 분리 한 보장하기 위해 버퍼에 주위에 집게를 소용돌이 친다. 이 실체 현미경 집게를 가져 와서 경우가 확인합니다. <ol><li> 미세 소관 뚜껑에 나사 즉시 액체 질소에 샘플을 동결. </li></ol></li></ol> 4. RNA 추출 및 RT-PCR <ol><li> 제조업체의 지침 또는 선호하는 실험실 프로토콜에 따라 메신저 RNA (mRNA의) 추출의 표준 방법을 따르십시오. 참고 : mRNA의 작은 수율을 분리 할 수​​ 있도록 캐리어의 RNA를 활용 한 상용 키트이 사용되었다프로토콜입니다. 낮은 용출 볼륨은 mRNA의 최종 농도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 참고 : 음 &quot;아니오 효소&quot;컨트롤 (NECs)와 &quot;아니오 DNA 템플릿&quot;컨트롤 (NTCS)도 관찰 효과의 유효성을 확인하기 위해 완료해야합니다. </li><li> 표적 유전자 21-23 보완 DNA (cDNA를) 증폭에 mRNA를 역전사의 표준 방법을 적용합니다. </li></ol>

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Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin.</a> Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).</li><li>Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+metabolic+adaptation+promotes+mesenchymal+stem+cell+therapy+for+ischemia:+a+hypoxia-induced+and+glycogen-based+energy+prestorage+strategy.">Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

여기에 설명 된 대표 결과 근적외선 간략한 두개 납품 (오일을 90 초 / 일) 가성 처리 한 마우스와 비교했을 때 이전 마우스에서 항산화 제의 발현 수준을 인상하기에 충분한 것으로 나타났다. NIR에 의해 방출되는 열을 우리의 측정 장치가 &lt;0.2 ° C 초 90이었다 LED와 같은을 일으킬 가능성이 - 방출되는 열이 미토콘드리아 및 / 또는 신경 활성화의 소스를 나타낼 수 있지만, 쥐의 전정에 대한보고는 24 구 심성 변화는 여기에 설명. 보고서는 위의 강조 달리 또한, 여기서 사용되는 근적외선 치료 감각 상피 전정 심성 뉴런에 직접 적용되지 않았으며 등 또한 감열 채널 (예 TRPV4)에 영향을 미칠 가능성이있다. 마지막으로, 다른 뇌 영역에서 동일한 NIR 장치를 사용한 이전의 연구는 열이 관찰 된 차이 7,9의 소스가 아니라는 것을 제안했다. 이 resu 동안LTS 유전자 수준에서 노화 관련 산화 스트레스에 대한 세포 반응의 상향 조절 (up-regulation)을 보여, 그것은 이들이 마우스의 전체적인 성능 균형에 반영되어 있는지 이러한 변경은 또한, 중요한 단백질 수준으로 발현하거나되는지 명확하지 않다. 또한, 업 - 레귤레이션은 단일 편재 항산화 위해 도시된다. 그것은 세포 대사의 여러 마커이 치료 정권에 영향을받을 가능성이 높습니다. 또한, mRNA의 (즉, 유모 세포,지지 세포, 전정 구 심성과 상피 모든 현재)는 특정 전정 머리에 근적외선 치료에 대한 반응에서 세포 대사에서 관측 된 변화를 연관 할 수 없습니다 토토에 전정 장치로부터 추출 된 이후 세포 또는 기본 심성 유형입니다. 중요하지만, 기술 준비 충분한의 mRNA를 사용하는 세포 대사와 균형 PERFO의 행동 분석과 미래의 상관 관계 연구를 할 수 있도록 하나의 마우스에서 추출 할 수 있습니다rmance. 여기에 사용되는 고휘도 LED 소자는 약 5 J / cm 5 일 동안 에너지 25 J 총 2 초 90에 따라 치료 -을 방출한다. (NIR 포함)이 장파장 광을 이용의 이점은 투과도이지만,이 근적외선의 전체가 25 J 전정 감각 상피로 전달되는 것으로 가정 할 수 없다. 마우스에서 빛이 주변 전정 장치와 뇌를 보호 연부 조직과 뼈의 레이어를 통해 적어도 1mm를 통과해야합니다. 인간이 센티미터로 확장합니다. 따라서 빛의 투과도는 임상에 근적외선 빛 치료 전략의 번역에 관해서 설명 된 기술의 한계를 나타냅니다. 최근 연구는 그러나 기저핵 (25), 그리고 달팽이관 (26)를 포함하여 감각 기관을 포함하여 깊은 뇌 구조에 근적외선 빛을 제공하는 광학 섬유를 사용했다. 이것을 기초로하고 전정 주변 장치의 위치에 인접유사한 인공 와우 (27) - 달팽이관 (및 유양 돌기 과정을 통해 임상 액세스), 이것은 인간에서, 전정 감각 상피의 직접적인 자극은 외부 장치에 의해 트리거 작은 광섬유를 통해 달성 될 수 있음을 제안 가능하다 . 몇 가지 조건은 연구자들의 관심에 적응하기 위해 상기 프로토콜에서 변형 될 수있다. 우선, 여기에 사용 파장 (670 nm의 두께) 이전에 다른 감각 시스템 및 동물 모델에서보고 된 적외선 범위에서 긴 파장을 포함하도록 확장 될 수있다. 둘째, 치료 체계는 단기 또는 장기 질문 응답에 있는지 여부에 따라 변화 될 수있다. 여기서 매우 짧은 치료 체제들이 이용되었지만, 이것은 근적외선 유도 변화의 역학을 측정하는 기간 이상, 또는 심지어 더 짧은 기간으로 확장 될 수있다. 이 프로토콜의 주요 과제는 조직의 생존을 유지하는 것이다조직 추출시. 미로 뼈를 제거하고 이로부터 멤브레인 미로 절제하는 데 필요한 시간을 고려할 때 대사 분해를 줄이기 위해 중요하다. 이 전체 과정에 걸쳐 얼음처럼 차가운 ACSF의 조직을 목욕과 carbogen와 함께 지속적으로이 솔루션을 관류에 의해 달성된다. 또한, 박리 과정의 끝에서, 상기 조직 추출 열화 조직을 동결 깜박 액체 질소의 사용을 중단 할 수있다. 해당되는 경우 냉동 조직을 해동 mRNA의 추가 유전자 분석을 위해 추출 할 수 있습니다. 여기에 기술 된 방법은 전정 감각 상피 세포 대사에 근적외선 처리 완료 영향을 설명하지 못하지만,이 전략의 추가적인 적용은 미토콘드리아 기능 (28, 29) 및 / 또는 세포 대사의 다른 연령 - 관련 마커를 포함하도록 수정 될 수있다 저산소증 30 모욕. 궁극적으로, 기능을 설명하기 위해 V개인 마우스의 estibular 세포 대사 프로파일은 노화 동안 균형 성능과 세포 내 프로세스 사이의 상관 관계를 조사하고, NIR 처리를 포함 치료제의 영향을 수 있습니다.

밸런스 성능을 떨어지는 이후의 폭포는 일반적인, 자연 노화 하나의 불행하게도 종종 정의하는 기능을 제공합니다. 이 감소의 영향은 신체적, 사회적인, 그리고 크게 노인을위한 삶의 질을 줄일 수 있습니다. 응답에서, 물리적 치료와 재활 폭포에 연구의 초점이되어왔다하지만 반복 폭포의 유병률 일관된 감소와 연관되지 않았다. 동시에, 작업은 말초 또는 중추 전정 시스템 (균형을 유지할 책임이있는 시스템) 부족, 및 이러한 시스템을 대상으로 잠재적 인 치료 전략의 변경 및 한정 불균형의 근본 원인을 조사. 연령 관련 황반 변성 2-4, 알츠하이머 병 모델 5-8, 파킨슨 병 9-12 포함하여 연령 관련 퇴행성 신경 질환에 대한 최근 연구는시의 신경 보호 효과를 보여 주었다근적외선 (NIR) 빛의 mple 비 침습적 응용 프로그램입니다. 또한, 전정 시스템에서, NIR 시험관 13 전정 일차 구 심성 뉴런의 활성을 증가시키는 데 사용되어왔다. 근적외선의 메카니즘은 잘 이해되지 않지만, 근적외선을 사용하여 대부분의 연구는 근적외선 세포 대사를 촉진하는 미토콘드리아 복잡한 IV (사이토 크롬 c 산화 효소) 14-17을 자극한다고 제안했다. 전정 감각 상피에서 I 형 머리 세포의 표피 하 판은 미토콘드리아 (18)의 조밀과 같은 치료 근적외선 치료를위한 행동의 사이트를 나타낼 수있다. 여기서, transcranially의 간단한, 비 침습성 치료 체제는 세포 대사를 측정하는데 사용될 수있다 (그리고 암시 미토콘드리아 기능에 의해) 마우스 전정 감각 상피 설명 NIR을 적용했다. 또한 논의 전정 감각 상피 제제이며 근적외선 ubiquito의 발현을 증가 시킨다는 것을 나타낸다우리는 항산화 감각 상피 (슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1) - 이전에 와우 헤어 세포 생존 (19)에 대한 중요한 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Quantum WARP 10</td><td>Quantum Devices</td><td>2070N030-A</td><td></td></tr><tr><td>Screw top microtubules</td><td>Quality Scientific Plastics</td><td>520-GRD-Q</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Parnell, Alexandria Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern scissors</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Carbon steel surgical blades #22</td><td>Livingstone</td><td>SBLDCL 22</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF forceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II RNA Micro Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52075</td><td></td></tr></tbody></table>

near infrared (nir) light increases expression of a marker of mitochondrial function in the mouse vestibular sensory epithelium

연령이 증가함에 따라 밸런스 기능에 감소를 감쇠위한 전략 밸런스 작업과 운동을 포함하여 물리 치료에 주로 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 이러한 접근 방법은 균형 하락의 근본 원인을 해결하지 않습니다. 마우스를 사용하여, 전정 감각 상피 세포의 대사에 근적 외광의 영향 (NIR)을 평가 하였다. 수집 된 데이터는이 간단하고 안전 개입이 자연 노화의 해로운 영향으로부터이 취약한 세포를 보호 할 수 있음을 보여줍니다. 의 mRNA는 격리 된 주변 전정 감각 상피 (크리스타의 ampullaris 및 utricular의 황반)에서 추출 이후 cDNA 라이브러리로 전사했다. 이 라이브러리는 다음 유비쿼터스 항산화 제 (SOD-1)의 발현을 조사해서되었다. 항산화 유전자 발현 후 세포 대사를 정량화하는 데 사용되었다. 젊은에서 NIR의 두개 배달 (4 주) 이상 사용 - 5 D (8 9 개월) 마우스 및 간단한 치료 정권 (90 초 / 일AYS),이 작품은 전정 감각 상피 세포에서 미토콘드리아의 기능을 개선하기에 충분할 수있다 혼자 NIR을 제안한다. 전정 모발 세포 기능을 개선하기위한 치료의 사용 가능한 저렴한, 비 침습적 방법은 없기 때문에, 외부 근적외선의 애플리케이션은 전정 감각 상피 기계가 세포 대사에 노화의 영향을 상쇄 할 가능성 전략을 제공한다.

젊은에서 NIR 처리의 영향 (4 주) 이상 비교하기 - 쥐 (8 9 개월) 우리는 (N = 20) (N = 16) 젊은에서 항산화 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD-1)의 발현을 측정 이상 가짜 처리, NIR 처리, 또는 근적외선 차단했다 쥐.이 그림은 젊은 가짜 처리 된 동물에 비해 NIR 처리 어린 동물에서 2 개 이상의 배의 β - 굴지 정규화 SOD-1의 발현이 크게 증가를 보여줍니다 (P &lt;0.01) 및 젊은 근적외선 차단 동물 (P &lt;0.01). 이전 근적외선 처리 된 동물은 또한 이상 상향 조절이 배 SOD-1를 이전 근적외선 차단 된 동물 (p &lt;0.05)와 비교 하​​였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52265/52265fig1highres.jpg" /> 1. NIR 치료 그림. 조사 누에서 연속 5 일 동안 하루에 90 초 동안 마우스의 머리에 2 ㎝ 면도 영역 위에 - (A) NIR 1 휴대용 장치를 LED테드 마우스는. (B) NIR 같은 방법으로하지만 90 초 동안 해제 장치와 가짜 처리 된 마우스 위에 개최 LED 장치. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52265/52265fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52265/52265fig2highres.jpg" /> NIR 처리 연속 5 일 후 SOD-1 유전자 발현의도 2. 분석 (90 초 / 일). 전정 감각 상피는 RT-PCR를 사용하기위한 프로브 다섯째 일 특정 항산화 유전자에 수확 하였다. SOD-1 유전자는 β - 굴지하는 ImageJ에의 v1.48를 사용하여 실시 기준 및 농도계를 정상화했다. 에 비해 SOD-1 발현의 중요한 상향 조절 (p &lt;0.01)이 젊은 근적외선 처리 된 동물에서 관찰되었다 둘이 젊은 가성 처리 한 어린 근적외선 차단 컨트롤 (4 주). 유의 한 증가 (P &amp;# 60; 9 개월) - 이전 근적외선 차단 된 동물 (8과 비교할 때 SOD-1 발현 0.05)도 NIR 처리 이전 동물에서 관찰되었다. 모든 그래프는 젊은 가짜 처리 제어에 비해 SOD-1 유전자 발현의 배의 변화를 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SD 나타냅니다. 모든 데이터는 단방향 ANOVA를 이용하여 분석하였고, 통계적 유의성은 사후 테스트 Tukey의 다중 비교를 사용하여 결정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52265/52265fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Near Infrared NIr Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

미토콘드리아 기능 장애는 세포 노화의 특징이다. 이 논문은 노화 마우스 전정 감각 상피의 미토콘드리아 기능을 개선하기 위해 비 침습적 근적외선 (NIR) 치료를 사용합니다.

근적외선 (NIR) 빛은 마우스 전정 감각 상피 세포에서 미토콘드리아 기능의 마커의 발현을 증가

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

near-infrared-nir-light-increases-expression-marker-mitochondrial

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

9.9K 조회수.  University of Sydney.  미토콘드리아 기능 장애는 세포 노화의 특징이다. 이 논문은 노화 마우스 전정 감각 상피의 미토콘드리아 기능을 개선하기 위해 비 침습적 근적외선 (NIR) 치료를 사용합니다. 

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Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

노화 마우스 전정 시스템의 행동 평가

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

연구

행동분석학

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

유전학

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

신경과학

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

마우스의 조영 증강 MRI에 의한 시신경 섬유 무결성의 생체 내 이미징

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Investigating Migraine-Like Behavior Using Light Aversion in Mice

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as photophobia. Whilst it is impossible to confirm that a mouse is experiencing migraine, light aversion can be used as a behavioral surrogate for the migraine symptom of photophobia. To test for light aversion, we utilize the light/dark assay to measure the time mice freely choose to spend in either a light or dark environment. The assay has been refined by introducing two critical modifications: pre-exposures to the chamber prior to running the test procedure and adjustable chamber lighting, permitting the use of a range of light intensities from 55 lux to 27,000 lux. Because the choice to spend more time in the dark is also indicative of anxiety, we also utilize a light-independent anxiety test, the open field assay, to distinguish anxiety from light-aversive behavior. Here, we describe a modified test paradigm for the light/dark and open field assays. The application of these assays is described for intraperitoneal injection of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in two mouse strains and for optogenetic brain stimulation studies.

Rodents are not able to report migraine symptoms. Here, we describe a manageable test paradigm (light/dark and open field assays) to measure light aversion, one of the most common and bothersome symptoms in patients with migraines.

마우스에서 가벼운 혐오감을 이용한 편두통과 같은 행동 조사

Migraine is a complex neurological disorder characterized by headache and sensory abnormalities, such as hypersensitivity to light, observed as ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

생화학

A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide range of neurological and psychiatric disorders, and memory enhancement in age-related cognitive decline and neurodegenerative diseases. We describe a laboratory protocol for transcranial photobiomodulation therapy (PBMT) in mice. Aged BALB/c mice (18 months old) are treated with a 660 nm laser transcranially, once daily for 2 weeks. Laser transmittance data shows that approximately 1% of the incident red light on the scalp reaches a 1 mm depth from the cortical surface, penetrating the dorsal hippocampus. Treatment outcomes are assessed by two methods: a Barnes maze test, which is a hippocampus-dependent spatial learning and memory task evaluation, and measuring hippocampal ATP levels, which is used as a bioenergetics index. The results from the Barnes task show an enhancement of the spatial memory in laser-treated aged mice when compared with age-matched controls. Biochemical analysis after laser treatment indicates increased hippocampal ATP levels. We postulate that the enhancement of memory performance is potentially due to an improvement in hippocampal energy metabolism induced by the red laser treatment. The observations in mice could be extended to other animal models since this protocol could potentially be adapted to other species frequently used in translational neuroscience, such as rabbit, cat, dog, or monkey. Transcranial photobiomodulation is a safe and cost-effective modality which may be a promising therapeutic approach in age-related cognitive impairment.

Photobiomodulation therapy is an innovative noninvasive modality for the treatment of a wide range of neurological and psychiatric disorders and can also improve healthy brain function. This protocol includes a step-by-step guide to performing brain photobiomodulation in mice by transcranial light delivery, which can be adapted for use in other laboratory rodents.

마우스에 Transcranial Photobiomodulation 치료에 대 한 프로토콜

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

생물학

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...