Name: detection of true ige-expressing mouse b lineage cells
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells at JoVE.com

DRW는 NIH 보조금 AI089972과 AI113217,에 의해 점막 면역학 연구 팀에 의해 지원하고, 버로우즈 웰컴 기금 의료 과학자에 대한 경력 상을 보유하고있다.

참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다. 시약 1. 준비 <ol><li> 1000 배 스톡 IL-4 : H 2 O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다. </li><li> 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ / ㎖, 가게에서 제조 업체에서 얻습니다. </li><li> B 세포 자극 미디어 : RPMI-1640 배지 425 mL의 추가, 75 갓 해동 소 태아 혈청의 ㎖ (FCS), 1.0 M HEPES 버퍼, 5 ML의 L 글루타민 재고 10 ㎖, 5 ml의 페니실린 : 스트렙토 마이신 주식, 5 2- 머 캅토 에탄올 ml의 최소 필수 중간 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA), 3.5 μL. 일주일에 최대 4 ℃에서 둡니다. IL-4 (20 NG / ㎖) 및 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖)에 사용 직전에 추가단지 필요한 미디어의 볼륨. </li><li> 2 % FCS-FACS 버퍼 : 1X PBS의 490 ml의 FCS의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 배 트립신 EDTA 용액 : 1X PBS 20ml에 10 배 트립신 EDTA 원액 (5.0 g 트립신, 리터 당 2.0 g의 EDTA) 5 mL를 희석. 저장 트립신 EDTA는 2 배에서 4 ° C에서 분주 작업. 사용하기 전에 실온으로 가온시킨다. </li><li> 태아 혈청은 : 최대 2 주 동안 4 ℃에서 해동 FCS를 유지합니다. 세포질 염색 절차 전에 얼음 15 분에 놓습니다. </li><li> 중성 완충 포르말린 : 10 % 포르말린 용액 (3.7 % 파라 포름 알데히드)를 준비한다. 포르말린은 독성이 적절한 PPE를 착용하는 동안 따라서 실험실 흄 후드를 처리 할 수​​ 있습니다. 화학 스토리지 캐비닛을 실온에서 보관 포르말린. </li><li> 메탄올 : -20 ° C에서 보관 절대 메탄올 (100 %)의 세포 투과 가능하게 할 준비가 될 때까지. 그 메탄올이 가연성 적절한 냉동실에 보관해야합니다. </li></ol> 2.정제 된 B 세포의 활성화 <ol><li> 갓 수확 된 마우스의 비장에서 부드럽게 3 ㎖ 주사기의 플런저와 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 장기를 눌러 단일 세포 현탁액을 제조. 15 ml의 원추형 원심 분리 관에서, 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 10ml에 세포를 수집하고 원심 분리기. </li><li> 5 분 동안 적혈구 용혈 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 펠렛을 따르다. 5 분 동안 300 XG에서 1X PBS 13.5 ml의 원심으로 중화. </li><li> (선택 사항) 자기 (磁 气) 제조업체의 지침에 따라 MACS 정화 프로토콜 다음, 구슬을 방지 CD45R (B220)를 사용하여 B 세포를 표지 된 구분합니다. </li><li> 37 ° C에서 IL-4 (20 NG / ml) 및 오일에 대한 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖) 함유 가온 B 세포 자극 배지에서 1.0 × 106 세포 / ml으로 정제 된 B 세포를 자극한다. 6 웰 배양 판 (4 ml의 각)의 두 우물로 나누어 문화의 8 ml로 시작합니다. </li><li> cultu 확인1.0 × 106 세포 / ml로 유지하기 위해 매일 재. 다른 웰로 분할 신선한 IL-4와 항 CD40을 함유하는 B 세포 자극 매체 배양을 희석하여 농도를 조정한다. </li></ol> 3. 트립신, 고정 및 투과성으로 <ol><li> 트립신 <ol><li> 5 분 300 XG에, 15 ML 원뿔 튜브에 원심 분리기를 배양 세포의 최대 1.0 × 10 (7)를 수집, 상층 액을 가만히 따르다. </li><li> 셀 수집 미디어에서 잔류 단백질을 제거하기 위해 PBS의 10 ml로 세척 할 것. 원심 분리 단계를 반복하여 상층 액을 가만히 따르다. </li><li> (약 100 μL)을 경사 분리 한 후 잔류 체적의 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 조심스럽게 세포에 실온 0.1 % (2 배) 트립신 EDTA의 800 μl를 추가합니다. 원추형 튜브의 측면 아래로 45 ° 각도로 천천히 디스펜스. </li><li> 튜브를 닫고 액체가 관 5-6 시간의 길이를 따라 실행되도록 튜브를 기울여 부드럽게 혼합의. 힘줄, 백색 침전물은 용액 중에 형성 할 수있다. 분 아래에 트립신 시간을 제한합니다. </li><li> 감기 FCS 1ml의 트립신 처리로 반응을 켄칭. 즉시 차가운 PBS 10 ㎖를 첨가하여 희석 FCS. </li><li> 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리 한 후 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 튜브를 반환합니다. </li></ol></li><li> 정착 <ol><li> 경사 분리 후 잔류 체적의 세포를 재현 탁. 필요한 경우, 차가운 PBS 100 μL에 볼륨을 가져. </li><li> 흄 후드에서, 세포에 10 % 중성 완충 포르말린 용액 800 μL를 추가하고 상하 피펫. 튜브는 포르말린 첨가시 따뜻하게. 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol></li><li> 투과성으로 <ol><li> 부드러운 흔들림 속도로 벤치 탑 와류 믹서를 설정합니다. </li><li> 10 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 추운 (-20 ° C) 메탄올 9 ml에 그립니다. </li><li> 와류 믹서를 통해 세포를 포함하는 튜브를 잡고 부드럽게 흔들리는 시작g 세포. </li><li> 튜브는 여전히 떨고 메탄올을 지속적으로 혼합되는 동안이 세포에 적가 쓰러 튜브에 냉 메탄올을 추가합니다. 메탄올 2ml의 제 후에 분배 속도가 느린 스트림으로 증가 될 수있다. </li><li> 30 분 투과성으로를 완료 할 때 튜브가 얼음에 앉아 보자. 대안 적으로, 세포는 개월까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 의 IgG1과 IgE의 클래스 전환 4. 형광 염색 <ol><li> 원심 분리기에서 5 분 동안 300 XG에 샘플은 메탄올 용액 캔트. 백색 침전물을 세포 펠릿있다. </li><li> 5 분 세포를 씻어 300 XG에서 객실 PBS 1X 온도와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. 한 번 반복합니다. 참고 : 실온 PBS와 펠렛을 세척하는 단계 4.1 이후에 형성 할 수있다 여분의 침전물을 용해. </li><li> 2 % FCS-FACS 완충액 10 mL로 추가 세척을 수행합니다. </li><li> 바닥 판 라운드 96 웰에 샘플을 배포5 분 동안 원심 분리기 (300) XG. 상층 액을 가만히 따르다과 얼음에 접시를 넣어. </li><li> 다음과 같은 항체를 희석 잘 2 % FCS-FACS 버퍼의 60 μL에 얼룩 : 안티 IgM 항체 RPE / Cy7, 1 : 200, 안티의 IgG1 PE, 1 : 600, 안티 IgE에 FITC, 1 : 100, 안티 - CD45R (B220)를 PerCP-Cy5.5, 1 : 200 </li><li> 5 분 염색 한 후, 300 x g에서 5 분 동안 2 % FCS-FACS 완충액 원심 150 μL로 플레이트를 세척한다. </li><li> 5 ML의 FACS 튜브에 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 2 % FCS-FACS 버퍼와 피펫 400 μL에 재현 탁. </li></ol> 5. 다음 게이팅 전략을 사용합니다 : <ol><li> FSC / SSC 플롯 (그림 1)에있는 발파 림프구 인구에서 CD45R (B220) 양성 세포를 분리합니다. </li><li> B220 양성 세포에서 해당 인구를 나타 내기 위해 IgE 항체와의 IgG1 플롯을 사용합니다. </li></ol>

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The authors have no disclosures.

항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 5 T 도우미 2 형 (T H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 12 또는 정제 된 비장의 B 세포 (11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이다. CD45R (B220)를 사용하여 B 세포의 양성 자성 비드 분리가 여기에 사용된다 -labeled. 분리 후, B 세포 농도를 적절한 항체 및 사이토킨 자극에 1.0 × 106 세포 / ml로 조절 될 수 있도록하여 FACS 세포 순도를 확인할 것을 권장한다. 또한이 냉동 / 해동 사이클을 거쳤다 IL-4 단백질 활성을 감소 수도 있음에 유의해야한다. 이전의 고정 및 투과성으로하는 세포의 트립신은 정확도는 허용(그림 2) 유동 세포 계측법을 통해 클래스 전환의 측정을 먹었다. 세포의 적절한 트립신이 절차의 성공적인 응용 프로그램에 매우 중요합니다. FCS는 트립신을 억제 할 수있는 것처럼, 1X PBS 세척 전에 트립신 단계로 수행됩니다. 우리는 실온에서 30 초 배양이 완료 소화하기에 충분했습니다. 더 긴 내구 띄게 세포 생존에 영향을 미칠 수있다. 분석하기에 앞서 흔적 메탄올을 제거하는 PBS로 세포를 여러 번 세척하는 것이 필수적이다. 메탄올 이월 13 항체 결합을 변경할 수 있고, 하류 유세포 분석 (14)에 사용 된 FCS에서 단백질을 침전 수있다. 이 점에있어서, 투과성으로 다른 방법 (즉, 사포닌) 메탄올 대신 사용할 수있다. 메탄올은 세제 막 (15)의 무결성을 방해하면서, 막 지질을 용해시키는 유기 용제이다. 메탄올 투과성으로에 장점은 확장 된 스토리지의 기능입니다-20 C 14 ° 고정 된 세포의. 이 절차를 사용할 때주의해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 절단 단백질 잔류 물을 트립신 때문에 일부 FACS 얼룩은 치료 후 다른 나타나거나 아예 에피토프를 대상으로 결합 할 수있는 능력을 잃을 수 있습니다. 또한, 트립신 처리 후 세포 수의 손실이 발생할 수 있습니다. 우리가 각각의 하이 브리 도마 클론 항체 (11)의 분비를 측정으로부터 수집 클래스 스위칭 데이터 명확 필적이 방법을 발견하지만, 이것 CSR IgE의 측정의 정확도에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 다른 방법은 IgE 항체 생산 마우스 B 세포를 검출하기 위해보고되었다. 18 - 한 가지 방법은 셀 (16)을 IgE 항체가 발현에 막 결합 IgE에 염색을하는 수용체에 결합 된 IgE 항체 전에 제거 산 세척 절차를 사용합니다. 또 다른 방법은 셀 permeabiliz 전에 모든 표면의 IgE을 차단하는 모노클로 날 항 - 면역 글로불린 항체를 사용하여IgE에 발현하는 세포 (19)의 세포 내 IgE에 대한 ATION 및 염색. 더욱이, 최근의 연구는 IgM이 +, IgD의 +, IgA와 IgG의 + + B 세포 서브 세트 (20)를 제외하여 인간 IgE에 교환 B 세포 개체군을 식별 여덟 색 FACS 패널 프로파일. 이러한 다른 방법에 비해, 여기에서 설명한 방법은, 산 세척 변성의 사용을 회피하고, 과량의 항체가 필요하지 않다. 이 절차에 대한 장점은 CSR에 대한 IgE의 측정에 대한 특정 모노클로 날 항체를 규정하지 않는다는 것이다. 대안 항 IgE의 모노클로 날 항체는 내인성 면역 글로불린 분자를 검출하는 것으로 나타났다. 하이 브리 도마 클론 R1E4은하지 세포 친화 IgE 항체가 CD23 (21, 22)에 결합 만 내생 표면 분자에 특이적인 쥐 항 - 마우스 단일 클론의 IgE 항체를 생산하고 있지만 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그것은 일반적인 실험실 reage를 사용하기 때문에 위에서 설명한 프로토콜은 편리하고 경제적이다국세청. 가능성이 여기에 사용되는 항 면역 글로불린 항체는 수용체 결합에 의한 세포 친화 IgE 항체에 대한 IgE 신호가 치료 후 감소하기 때문에, 트립신 매개 분열에 민감한 사이트에서 IgE 항체 (그림 2)에 결합한다. 이 프로토콜을 실행하는 실험 연구자 시판 클론의 범위에서 선택할 수있는 자유가 그러나. 더욱이, 세포 표면 단백질을 제거하기 위해 트립신을 사용하는 개념은 FACS 분석에 의해 다른 세포 마커의 검출에 확장 될 수있다.

마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 H s의) (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C H의 1의 각 세트 5 &#39;위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 - 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다. IgE 항체는 알레르기 질환 2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 3 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CSR은 불완전하게 이해된다. B 세포의 체외 활성화는 IL-4 항 CD40 또는 LPS 중 하나와 조합은, 모두의 IgG1과 IgE의 5 CSR을 유도하여. 활성화 된 B 세포를 용해 IgE 항체가 CSR 후 문화 분비 결합 선호도가 낮은의 IgE 수용체 FcεRII / CD23 2,6-을 표현한다. 유동 세포 계측법으로 분석 할 때 따라서, 수용체에 결합 된 IgE의 얼룩 B 세포는 유사 내생 적 IgE 항체 (7)를 발현하는 세포를 B로. 그것은 그 마우스 B를 알려져 있지만 세포는의 IgG1에 클래스 전환의 측정에 방해가 나타나지 않는 우리의 경험에서 선호도가 낮은 IgG의 수용체 FcγRIIB1 (CD32) 8을 표현한다. 배양에서 B 세포 활성화 후 IgE의 전환을 측정하는 경우에는, 표면 - 결합 특이성 IgE 항체는 분석을 가릴 수있다. 공통 염색 방법과 비 IgE 항체 발현 세포가 IgE에 대해 긍정적으로 염색. 여기에 설명 된 마우스 (9)로부터 참의 IgE 발현 B 세포를 CSR 세이를 수행하고 검출하는데 이용 된 전략 - 11. 트립신으로 활성화 된 B 세포의 치료는 일반적인 실험실 시약은 단백질을 소화, 세포 친화 및 막 모두 결합 된 표면의 IgE는 제거합니다. 세포질 IgE에 대한 후속 투과성으로 염색 따라서 진정한 IgE 항체 생산 세포를 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Anti-Mouse IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Mouse/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microbeads&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS purification column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA&amp;#8226;4 Na per Liter of 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Calf Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B cell Stimulation media</td><td></td><td></td><td>B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine,&amp;nbsp; 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 &amp;micro;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &amp;micro;L/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 &amp;micro;g/ml)</td></tr></tbody></table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 - 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.

이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 11 CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하게 트립신 처리 (도 2a)없이 판별 될 수 블라스팅 림프구 게이트. 그러나, 고정 및 투과성으로 이전에 세포의 트립신으로 인해 표면 바인딩 IgE 항체의 제거에 IgE 항체 생산 세포 (그림 2b)의 분리를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52264/52264fig1highres.jpg" /> 그림 1 : ForwIL-4 및 안티 CD40와 문화에 자극 5 일 후 마우스의 비장의 B 세포의 측면 분산 FACS 플롯 대 ARD. 발파 림프구는 총 획득 한 사건의 63 %를 차지합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52264/52264fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 활성화 된 B 세포의 IgE와의 IgG1의 세포질 염색에 트립신의 효과 (A, B) 문화의 활성화 후 129 / B6 혼합 된 배경 마우스에서 비장 B 세포를 폭파에 게이트 외과 (위) 플롯과 막대 그래프 (아래) 항 CD40 및 IL-4 5 일 동안. 단독으로 고정 및 메탄올 투과성으로 (a) 및 트립신 (b)의 첨가로 나타낸다.

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Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K 조회수.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

연구

생물학

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

면역학 및 감염병학

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

의학

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...