Name: isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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이 작품은 독일 연구 협회 임상 연구 (IZKF) 뮌스터에 대한 학제 간 센터 (SEED 3월 12일, SB), (DFG)에 의해 지원되었다, 셀 - 인 - 모션 우수 클러스터 (EXC 1003 - CIM), 뮌스터 대학 (SB 및 SGM에)와 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 (SB 및 SGM에 2012_A88)에 의해. 우리는 우수한 삽화 헤이 케 블룸 감사합니다.

동물 보호의 독일 법에 따라 실시하고 모든 동물 실험은 지방 자치 단체 ( &quot;Recklinghausen에서, 독일; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz 노르 트라 인 베스트 팔렌&quot;)에 의해 승인되었다. 마우스 실험 1. 일반 댓글 <ol><li> 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 마우스를 사용하여 모든 실험을 수행합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 쥐를 보관하고 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있도록. </li><li> 생물학적 특성은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별에 일치하는 마우스를 사용합니다. </li><li> 가능한 한 것은, 감소 수정 또는 동물 실험을 대체하려고합니다. </li></ol> 퍼콜 그라데이션 2. 준비 <ol><li> 1 ml의 10 배 PBS, 1 ML의 FCS 및 10 ml의 퍼콜와 1X PBS 19 ml의 혼합. </li><li> 인트를 수행유리관에 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 화나게. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 내피 세포 중간 및 세포 배양 플레이트의 코팅 3. 준비 <ol><li> 내피 세포 매체 : <ol><li> 500㎖의 매질의 제조 : (. 약 20 %) 100 ㎖의 PDS 400 ml의 DMEM 배지 (. 약 80 %)을 섞어, 0.25 ml의 bFGF를 (. 20 ㎍ / ml의 약 0.05 %), 0.5 ml의 헤파린 (100 μL / ㎖;. 약 0.1 %) 및 ​​0.5 ml의 pyrumycin (4 ㎎ / ㎖]. 약 0.1 %). 단지 문화의 제 2 일 내에 사용되는 세포 배양 배지 용 pyrumycin 추가. </li><li> 유리관 내의 멸균 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 수행. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 플레이트의 코팅 : <ol><li> 도포 액 1ml를 들어, 500 μL의 DDH 2 O, 400 μl의 콜라겐 IV (0.4 ㎎ / ㎖) 100 ㎕를 피브로넥틴 (0.1 ㎎ / ㎖)의 용액을 제조 하였다. </li><li> EAC의 전면을 덮코팅 용액으로 세포 배양 플레이트의 웰 시간. 4 ° C에서 하룻밤 접시를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 4. 분리 (MBMEC) <ol><li> 경추 탈구로 - (12 주 이전, C57BL / 6 ~ 8) (10) 성인 쥐를 희생. 그 후 PBS 5ml에 마우스 두뇌와 저장소를 분리 (경고 :! 작업 멸균). </li><li> 집게와 뇌 줄기, 소뇌 및 시상을 제거합니다. 신중하게 멸균 블로 팅 용지에 머리를 굴려 수막를 분리합니다. 결과 수막없는 forebrains를 수집합니다. </li><li> DMEM의 13.5 ml로 채워진 50 ml의 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. </li><li> 미디어 유백색이 될 때까지 10 ㎖를 피펫 후, 제 25 ㎖를 피펫으로, 조직을 말하다. </li><li> 이어서 궤도에 37 ° C에서 1 시간 동안 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 0.6 ㎖의 콜라게나 CLS2 (10 ㎎ / DMEM에서 ml) 및 0.2 ml의 DNase를 (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 혼합물로 조직 다이제스트 악수180 rpm에서 R. </li><li> DMEM의 추가 10ml를 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 조직 서스펜션과 원심 분리기에 셀을 추가했다. </li><li> 폐기 상층 액 (경고 :! 펠릿 잃을 쉽게) </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 (약. 25 배) (20 V / w %), 및 원심 분리기, 미엘린을 제거 BSA-DMEM 25 ml의 25 ml의 피펫 펠렛을 재현 탁한다. </li><li> 큰 직경 깨진 유리 파스퇴르 피펫 상부 미엘린 층 (유백색)을 폐기하고 정상적인 파스퇴르 피펫 BSA 층을 버린다. </li><li> 9 ml의 DMEM에 펠렛을 재현 탁하고 1 ml의 콜라겐 / 디스 파제를 0.1 ml의 DNase의 (최종 농도가 1 ㎎ / ㎖이다)를 추가합니다. 180 rpm에서 진탕 기에서 37 ° C에서 1 시간을위한 솔루션 다이제스트 (주의를 : 재현 탁 피펫을 사용하지 않는 - 세포가 손실 될 수 있습니다). </li><li> 소화되는 동안, 가속도, 위스콘신과, 4 ° C에서 1 시간 동안 3000 XG에서 초 원심 분리기를 사용하여 밀도 구배를 설정하는 퍼콜 용액을 원심 분리하여thout 브레이크. </li><li> 소화 세포 현탁액에 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정지를 원심 분리기. 그런 다음 상층 액을 제거하고 DMEM 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁. </li><li> 가속 및 브레이크없이 4 ° C에서 10 분 동안 700 XG에서 퍼콜 그라데이션 원심 분리기 위에 조심스럽게 재현 탁 세포를 추가합니다. 참고 : 세포가 계면에 구름으로 볼 수 있습니다. </li><li> 약 가져 가라. 긴 멸균 된 바늘로 세포와 상간의 12 ml의 DMEM 5 ml의 새로운 50 ml의 팔콘에 넣습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 다시 세포를 원심 분리기. 이후 내피 세포 배지 중 펠렛을 재현 탁 (약 사용한다. 0.2 ml의 배지를 1cm 세포 배양 판의 두 표면 당). </li><li> 코팅 된 세포 배양 플레이트로부터 도포 액을 제거한다 (단계 3.2 참조), 두 개의 연속적인 세척 단계에서 멸균 PBS로 각 웰을 씻어. </li><li> 내피 세포에서 세포 배양을 유지세포 37 ° C에서 중간 및 5 % 무균 인큐베이터에서 CO 2. 모든 2~3일 매체를 변경합니다. 90 %의 합류에 분할 세포. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

혈액 - 뇌 장벽 기능 장애는 다발성 경화증의 BBB의 예를 들어 고장 광범위자가 반응 면역 세포에 의한 중추 신경계의 침략을 용이하게하고 희소 돌기 아교 세포의 만남과 파괴를 가능하게 다양한 해로운 CNS 질환의 특징이다. 허혈성 뇌졸중에서 BBB의 중단과 뇌 부종의 후속 형성 보조 경색의 성장과 환자 6의 생존율에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 나아가, 원격지에서 BBB의 변화에​​ 의해 국소 허혈성 뇌 병변의 광범위한 기능적 변화를 유도 할 수있다. 그러나, 기본 분자 메커니즘은 5 크게 알려져 있지 않다. 반면에, 기능 BMECs에서 높은 밀도와 유출 수송의 다양성은 감염성 질환에 대한 뇌의 악성 종양 또는 항생제 화학 요법으로 도움이 약물의 농도를 감소시킨다. 따라서, 뇌 혈관 바의 깊은 이해생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서는 캐리어 기능은 특히 선호 방향 (21)에 장벽 기능을 조절 할 수있는 약리학 적 제제를 개발하는 것이 요구된다. BBB의 체외 모델에서 신뢰성이 BBB에서 규제 메커니즘을 연구하기 위해 필수 불가결 한 도구입니다. 많은 불사 화 뇌 내피 세포주 확립 및 체외 BBB 모델 (22)로서 사용되어왔다. 그들은 빠르게 성장하고 여러 통로를 통해 특정 BBB 특성을 유지 이들 세포주는 차 BMECs을 통해 어떤 이점을 제공합니다. 그러나 내피 세포 라인은 완전히 생체 내 상황에 대한 실험 결과의 양도와 섞이는 등의 중요한 속성이 변경 일차 전지를 대체 할 수 없습니다. 예를 들어, 뮤린 뇌 내피 세포주 bEnd.5 높은 parac 선도 불연속 분산 꽉 접합 단백질 만 낮은 수준을 발현ellular 투과성 (23). BEnd.3 다른 자주 사용되는 뮤린 뇌 내피 세포주, 치밀하고 연속 분산 견고 연접, 높은 저항 transendothelial 여러 유출 수송차와 낮은 세포층 투과성을 보여준다. 일차 BMECs 특정 세포 횡단 및 세포층의 기판 (24)의 투과에 대하여 실제 차별 부족하지만 bEND.3 셀 층 비해. 차 세포 배양의 준비에서 오염 세포는 크게 실험 결과의 타당성을 방해 할 수 있습니다. 내피 세포는 높은 순도를 달성하기 위해 기술 된 프로토콜에 pyrumicin은 선택적 제로서 사용된다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양의 일반적인 품질 관리 불가피 신뢰성 실험 보장하는데 필요하다. 내피 세포의 전형적인 형태 학적 특성 (도 1a 참조), transendothelia 게다가 품질 제어를위한 여러 가지 방법이있다L 저항을 측정 할 수있는 또는 같은 CD31와 같은 내피 세포 마커의 발현 (그림 1B 참조) 또는 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)가 평가 될 수 있습니다. 한 마우스 뇌로부터 단리 뇌 내피 세포의 수가 상대적으로 낮은 여러 실험에 적합한 세포 배양을 설정하는 등의 여러 쥐의 뇌를 풀링 할 수있다. 우리의 경험에서, 적어도 10 마우스는 각 동물 시설의 자원에 따라 제한적인 요소가 될 수있는 하나의 실험을 위해 사용되어야한다. 바이어스 또는 교란 요인을 피하기 위해, 동일한 유전 적 및 환경 적 배경 만 마우스 풀링한다. 반대로, 소 및 돼지의 뇌 내피 세포 제제는 하나의 뇌에서 사용할 뇌 내피 세포의 다수를 제공한다. 그러나, 복잡하지 않은 번식과 주택, 가능한 형질 전환 마우스의 광범위하고 계속 증가하는 레퍼토리 외에 주 쥐 BMECs 이상적인로 렌더링모델은 혈액 - 뇌 장벽의 기능을 연구합니다. BBB 및 기본 분자 메커니즘의 기능에 관한 몇 가지 주요 연구 결과는 2 차원 조직 배양 시스템의 연구에서왔다. 최근, 3 차원 배양 시스템은 내피 세포 루멘 관 네트워크를 형성 할 수 있도록 콜라겐 매트릭스 내에 배치된다 (25)이 개발되어왔다. 이러한 새로운 세포 배양 시스템은 생체 내에서 혈관 손상 유기체 프로세스 더욱 정확한 재생산을 허용. 이러한 혈관 주위 세포와 성상 세포로 NVU 3 차원 세포 배양 시스템의 추가 세포의 참여는 혈액 - 뇌 장벽 기능의 공부 체외 혁명 있습니다; 제 모델은 최근 26 개발되었다. 문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항이 있습니다. 모든 멸균 작업의 첫 번째는 내피 세포 배양의 품질에 필수적이다. 둘째, pyrumycin는 셀을 추가해야합니다배양의 처음 2 일 내에 사용되는 배지는, 응용 프로그램은 더 이상 증가 MBMEC 세포 사멸과 낮은 품질의 장벽 기능을 초래할 수있다. 셋째,이 프로토콜에 적용될 효소 제조업체의 지시에 따라 사용 및 저장되어야한다; 그렇지 않으면 자신의 적절한 기능이 손상 될 수 있습니다. 내피 세포 부착하지 않는 경우 또한, 세포 배양 판의 코팅은 개정 될 수 있습니다. 피브로넥틴 및 콜라겐의 농도가 변경되게 또는 다른 기질 단백질이 코팅 용액에 첨가 될 수있다. 마지막으로, 연령, 성별, 동물 시설 내의 연도와 환경 조건의 계절 MBMEC 분리 실험의 비교의 품질에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다. 기술 된 프로토콜은 뮤린 BMECs을 분리하는 기본적인 neuroimmunological 방법으로 고려되어야한다. 분리 된 세포는 U이 될 수 있습니다이러한 마이그레이션 분석법, 유전자 및 단백질 발현 연구, 또는 전기 생리 학적 평가 투과성 실험 등 BBB 기능에 추가 통찰력을 얻기 위해 다양한 애플리케이션을위한 나오지. 전술 한 바와 같이, 3D BMECs의 세포 배양 시스템은 NVU의 맥락에서 BBB의 조절에 관여 복잡한 메커니즘을 연구하기위한 새로운 기회를 제공 할 수있다. 따라서, 차 내피 세포의 분리는 향후 BBB 연구 분야에서 매우 중요한 기술에 남아있을 것이다.

<html> 고도로 전문화 된 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 일부입니다 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC) 형태의 단일 층. BMECs은 기저막에 부착 접합부 단백질에 의해 서로 연결되어있다. 함께 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 교세포 단부 피트와 순환 혈구 그들은 소위 신경 혈관 부 (NVU)를 하나 구축. 혈액과 중앙 신경계 (CNS) 간의 불 투과성 장벽의 이전의 개념에 대하여, NVU은 뇌 혈관 및 CNS (2) 사이의 유체 분자와 세포의 전이를 제어하는 동적 고도로 특이적이고 규제 인터페이스 . NVU의 장애 또는 이상 조절이 개시 및 / 또는 허혈성 뇌졸중, HIV-뇌증, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병과 같은 3-6 CNS의 신경 혈관, 감염성 염증성 또는 퇴행성 질환의 종류에 기여할 수있다. _content &quot;&gt; BMEC 단층 단단히 꽉 (TJ)로 구성 접합부 복잡한에 의해 밀봉되어 (AJ) 7. 높은 전기 저항과 BBB의 낮은 세포층의 투과성은 주로 TJ 단백질을 기반으로 접합 8. TJS은 adherens 이러한 zonulaoccludens (ZO) 단백질과 같은 어댑터 분자에 의해 내피 세포의 세포 골격에 연결되어 클라우딘 및 occludin 가족 경막 단백질에 의해 형성된 복합체 ZO1-3 4 Adherens 접합은 주로 막 관통 단백질에 의해 조립된다. catenins (8)를 통해 세포 골격에 연결되어 혈관 내피 세포 (VE) -cadherin. BBB의 기밀 유지는 혈액과 뇌척수액 사이의 기판과 세포의 무료 교환을 방지 할 수 있습니다. 이 규칙에 예외가 지질 매개 확산 9 BBB를 통과 할 수있는 분자량 &lt;400 다와 친 유성, 작은 분자이다. 통로의 더 큰 및 / 또는글루코스, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 많은 약물 친수성 분자는 다섯 가지 주요 범주로 분류 될 수 고도로 제어 된 세포 횡단 운송 시스템 (10)으로 제한된다 : 캐리어 매개 수송, 이온 수송 활성 유출 수송 수용체 매개 전송 및 카베 올래 매개 교통편 4. 이러한 수송 시스템은 정확한 신호 생성, 전달 및 통합에 필요한 CNS의 항상성을 유지하는 데 도움. 더욱이 BMECs 적극적 ectoenzymes의 다양한 표현에 의해 구별 분자의 전환을 제어 할 수있다. 이러한 효소 저해 또는 BBB (11)의 전환을 가능하게 특정 내인성 및 외인성 기질 세포 표면 상에 집중하고 수정할 수있다. CNS는 오랜 시간 동안 면역 권한 기관으로 간주 된 반면, 최근의 연구 결과는 면역 surv의 다소 역동적이고 엄격하게 규제 시스템을 제안CNS의 eillance. BMECs 비판적으로 면역 세포 윤회의 조절에 관여한다. 그들의 표면 림프구에 셀렉틴의 발현에 의해 선택적으로 느슨하게 내피 세포에 부착하도록 유도한다. 백혈구의 특정 수용체​​ 발생할 케모카인의 분비 발현 또는 LFA-1과 백혈구 인테그린의 구조 변화, 리드 (림프구 기능 관련 항원 1) 및 VLA-4 (매우 늦은 항원 -4). 인테그린 사이 또는 BBB 12-14 BMECs 통해 뇌 실질 내로 이주 있도록 그들의 내피 counterreceptors, 예를 들면 VCAM-I (혈관 세포 부착 분자), ICAM-I (간 부착 분자)를 결합함으로써 밀착성을 매개한다. 이들 및 다른 연구 결과는 면역 세포의 이동을 조절하는 내피 세포 자체의 적극적인 역할을 강조한다. 또한, BMECs NVU의 일부 뇌 혈류 리튬의 조절에 관여 된 바와지역 신경 세포의 신진 대사 요구에 nked. 성상 세포 자극시 내피 세포는 혈관 평활근 세포 (15)의 이완에 산화 질소로 혈관 활성 물질을 생산한다. 현상뿐만 아니라 성인 뇌 쇼 평행 패터닝 및 개발 및 규제 1,4 많은 속성을 공유하는 신생 혈관 형성 및 신경. 내피 세포는 비판적으로 이러한 프로세스 (16), (17)에 참여하고 있습니다. 요약하면, BMECs는 CNS의 적절한 개발과 기능을 보장하기 위해 필수적인 기능을 제공합니다. BBB 장애는 많은 심각한 신경 학적 장애에 연결되어 있습니다. 그러나, 매우 소수의 대상은 특정하고 효율적인 치료 18 뇌 혈관계 계면에서 확인되었다. 시험 관내 모델에서 간소화가 싸다 대한 함수 복잡한 생리 학적 시스템의 조절에 관여하는 메커니즘을 이해하는 데 사용되어왔다NG 시간. 이 원고와 쥐의 BMECs의 체외 연구에 의해 설명 된 특정 마우스 녹아웃-균주의 다양한 주어진 격리, 새로운 치료 길을 열어 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 BBB 기능 및 규제의 또 다른 이해를 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase from &lt;em&gt;V. alginolyticus&lt;/em&gt;, Dispase from &lt;em&gt;B. polymyxa&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulant</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-derived serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Warm to room temperature before use</td></tr><tr><td>Pyrumycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Should only be used in first 2 days of culture</td></tr></tbody></table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

즉시 차단 후, 뮤린 BMECs 및 오염 세포를 세포 배양 배지 (도 1A, 0 일)에 떠 대기업을 형성한다. 그들은 이러한 독소에 대한 상대 저항에 이르는 P는 당 단백질로 유출 수송의 높은 수준을 표현하기 때문에 pyrumycin과 치료는 쥐의 BMECs의 선택으로 이어집니다. 오염 세포 매개 세포 독성 (19) pyrumycin 훨씬 더 민감하다. MBMECs는 콜라겐 IV / 피브로넥틴 코팅 된 세포 배양 판 (그림 1A, 1 일 및 2 일)에 부착하기 시작하는 반면 pyrumicin 선택의 과정에서 오염 세포는 세포 사멸 또는 괴사 세포 사멸을 입력합니다. 5 일까지, MBMECs 약의 밀도로 증식. 80~90%. 이들은 전형적인 방추형 외관을 특징으로한다. 합류, 그들은 단단히 세로 방향으로 정렬, 포장 및 비 중복 접촉 억제 세포 (그림 1A, 5 일)의 단일 층을 형성한다. 로(; 그림 1B PECAM1) 내피 세포 마커 CD31에 의해 입증 된 바와 같이 pyrumicin 선택, 최대 99 % MBMEC의 높은 순도에 도달. MBMECs 단단히 꽉 접합 단백질에 의해 상호 연결 밀봉 된 단일 층을 형성한다. 7 후 - 문화의 8 일, 내피 세포 층은 전기 저항에 대한 안정적인 값을 구축 (20 사이의 전형적인 값에 도달 - Ω (30)를 X cm 2). 및 커패시턴스 (그림 1C)이 시간 시점에서 기능 분석 등의 세포 -로 에반스 청색 또는 덱스 트란과 함께 예 : 이주 실험 3, 20, 21 및 투과성 시험은 수행되어야한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 형태 학적 및 설치류 BMECs의 기능적 특성. 투과광 마이크로 볼 배양 BMECs의 (A) 주제 경시이상 오일 SCOPY. 스케일 바는 모든 이미지에 적용됩니다. 내피 세포 마커 CD31에 대한 (B) 면역 형광 염색을 하루 5 CD31 (녹색) 및 DAPI (파란색)에서. (C) 세포 5 일 동안 예비 배양 한 후위한 자동화 된 시스템으로 전송되었다 생물 물리학 적 특성 (저항 및 정전 용량)의 분석. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.3K 조회수.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

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Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

연구

발생학

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

신경과학

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

의학

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

생물학

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

1차 뇌 주피세포의 분리 및 배양: 내피 세포 오염 없이 소 뇌 모세 세포에서 주피 세포를 분리하고 배양하는 절차

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...