Name: fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the &#8220;priority programmes&#8221; SPP1316 and SPP1617.

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The authors have nothing to disclose that would present a conflict of interest.

형광 프라이머 신장은 TSP- 또는 RNA 이차 가공 식별 어느 쪽의 RNA의 5 &#39;말단을 결정하기위한 간단하고 신속한 방법이다. 때문에 형광 프라이머의 사용, 반응이 설정 될 수 있으며, (방사성 표지 된 프라이머 경우와 달리) 추가 보안 조치없이 실행합니다. 샘플은 형광으로 검출되는 바와 같이 전기 영동 X 선 필름은 일반적으로 사용되는 방사성 방법에 비해 신속한 분석을 허용 진행되는 동안, 이들은 이미징 될 수있다. 일반적으로, 프라이머 신장 반응의 품질 등급과 프라이머의 결합 능력에 크게 의존한다. 결합 부위가 관심 영역에 너무 가깝게 선택되면, 프라이머 도말 표본 신호를 마스크 할 수있다, 결합 부위 반면 너무 멀리 (&gt; 300 염기쌍) 5 &#39;말단에서 신호 불량이 발생할 수있다. 형광 염료는 공유 결합으로 연결되어 있어야합니다합성 올리고 뉴클레오티드 중 커스텀 DNA 올리고 뉴클레오티드의 5 &#39;말단 잔류 염에 의해 역전사 반응으로 간섭을 방지하기 위해 HPLC로 정제한다. 적절한 염료 수정 (호환 염료에 대한 자세한 내용은 시약 목록 표 참조) 올리고 뉴클레오티드는 가장 올리고 뉴클레오티드 합성 회사에서 주문할 수 있으며, 어두운 곳에서 보관해야합니다. 방사성 동위 원소를 뉴클레오티드 가능합니다 불행하게도, 우리는 기존의 올리고 뉴클레오티드에 염료를 부착하는 효소 기술을 인식하지 못하고있다. 여기에 설명 시퀀싱 시스템에서, 두 개의 서로 다른 형광 염료들은 여기 같이 동시에 두 샘플을 검출하기 위해 (700 및 800 ㎚)를 사용하고 발광 스펙트럼은 구별 될 수있다. 별개 원래 제조업체 염료에서, 이러한 시약리스트에 표시된 다른 염료는 우수한 결과를 생산하는 데 사용될 수있다. 홍보를위한 또 다른 중요한 요소IMER 연장 반응은 RNA의 질과 양이다. 케어 그러한 AMV RT로서 역전사가 주형 (18)으로 DNA를 사용할 수 있으므로, DNA의 오염 물질을 제거하기 위해주의를 기울여야한다. 도 7에 도시 된 바와 같이, 겔 런 밴드의 검출 된 신호 강도는 역전사 반응에 사용 된 RNA 양에 의존한다. 이것은 샘플 내의 관심 존재 RNA의 비례 양에 따라, 총 RNA의 양을 조절하는 것이 필수적이다. 낮은 발현 RNA를 검출하기 어려울 수 있으므로,이 방법의 낮은 민감성도 단점 중 하나이다. 어떤 신호가 전혀 검출 할 수없는 경우, 총 RNA의 양이 증가 될 수 있거나 관심 RNA는 인위적 플라스미드에서 과발현 될 수있다. 프라이머 확장을 기반으로 형광 젤의 검출 감도는 프라이머 확장 (19)을 기반으로 32 P 33 P 방사성 동위 원소보다 낮은 요인 약 10 인. 그러나,이 단점은 겔 또는 역전사 반응에 사용되는 RNA 템플릿의 양을 증가시켜에로드 된 cDNA의 양을 조정함으로써 보상 될 수있다. 대부분의 경우, 감도가 양호한 결과 4,5- 충분히 높다. 짧은 노출 시간의 이점, 모세관 시퀀서 (3)와 조합하여 형광 프라이머를 사용하는 경우 방사성 프라이머 확장 비슷한 민감도보고되었다. 그들은 가용 기계, 프라이머, 사다리 반응, 가용성, 방사성 물질, 방사성 폐기물, 교육 및 개인 건강 보험의 폐기 작업을위한 실험실의 유지 보수 등 여러 가지 요인에 따라 달라로 프라이머 확장 기반의 형광 및 방사능 사이의 비교가 어려운 비용 . 형광 프라이머는 비 표지 된 표준 프라이머 (20 염기쌍)보다 약 5-10 배 더 비싸다. 그러나 이러한 프라이머는 적어도 사용될 수있다올해 훨씬 짧은 반감기를 가지고 32 P 표지 프라이머에 비해 (가능성이 몇 년). 다시 라벨 프라이머의 잦은 간격으로 새로운 방사성 물질의 필요성, 많은 시간과 비용이 소요된다. 프라이머의 동일한 세트가 장시간에 걸쳐 사용되는 경우, 형광 프라이머는 일반, 방사성 표지 된 프라이머보다 저렴하다. 주요 선정 된 포인트는 그러나 형광 시퀀서 또는 이미 저와 비용 효과되지 않을 수 있습니다 프라이머 확장의 목적으로 만이 장치를 구입을 할 것이다. 여기에 설명 된 방법은, 소지 또는 그러한 시스템에 대한 액세스 권한이 그룹보다는 흥미 롭다. 자동화 겔 시퀀서가없는 경우, 형광 검출을위한 다른 방법도 사용될 수있다. 이 경우에, 겔이 필요한 경우 건조시키고, 그 다음 형광 이미 저로 전송 표준 전기 영동 장치에서 실행할 수 (모델 FL 유사한있는 사용할atbed 스캐너). 실행 중에 젤을 가시화하는 장점이 손실 되더라도, 방사성 동위 원소의 사용은 실험자에 대해이 방법으로, 중요한 이점을 회피 할 수있다. 또한, 가능하다면, 모세관 시퀀서는 감도를 증가시키는 것이 도움이 될 수 분리 및 실시간 검출을 위해 사용될 수있다. 다양한 방법이 있지만이 방법은 종종 19 (불순물 제거) 샘플을 집중 cDNA의 침전 단계를 필요로 자동화 된 젤 시퀀싱 기계 또는 모세관 시퀀서와 형광 프라이머 확장자를 사용하는 방법에 대한 발표되었다. 여기에 제시된 방법에서, DNA 침전 따라서 준비 시간을 줄일 필요가 없다. 침전 절차의 불일치를 해소 할 수있는 반 - 정량적 샘플에서 RNA 분자의 양을 결정하기 위해 더 중요하지만,이 단계를 생략하는 것이 가능하다. 그것은 지적하지만 그되어야한다RNA 분자의 5 &#39;말단, 프라이머 신장 반응에 맵핑 처리 차 단부 (전사 시작점)가 용이하게 구별 할 수는 없습니다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 적절한 컨트롤 실험의 세심한 계획이 필수적이다. 명백한 프로모터 서열은 전사의 시작점의 존재를 나타낼 수 있으며, 돌연변이 또는 삭제 프로모터 요소들은 다음의 cDNA 밴드를 폐지한다. 이러한 서열이 없거나 특정 컨센서스 서열이있는 경우 한편, 밴드 RNA의 처리에 의해 야기 될 수있다. 처리 효소가 알려져 정제 할 수 있으면, 시험 관내 프라이머 확장 전사로서, 명확화를 가져올 수 있고, 처리는 분리 될 수있다. 또한, (미처리 RNA 분자의 효소 보충 포함) 다른 방법 예를 들면 5 &#39;RACE는 RNA 처리에서의 전사 개시 사이트를 구별하는 프라이머 확장을 보완 할 수있다. 목즉 프라이머 신장 방법은 종종 5 &#39;RACE 및 S1 뉴 클레아 제 보호 어 세이, 따라서 그 유용성 때로는 심문 같은 다른 방법과 비교된다. 예를 들어 차세대 시퀀싱과 함께 RNAseq 기술 그러나 필요한 재정 부담과 bioinformatical 작업이 관심의 단일 RNA를위한 오히려 비 경제적 만들기의 TSP와 병렬로 RNA를 여러 처리 사이트를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반면에, 5&#39;-RACE은 저렴하고 결과를 분석하기 쉽지만 RNA를 여러 가지 또는 여러 전사 시작점으로 존재되어 처리되는 경우에, 제품은 복제되어야하며 후보 다량으로 시퀀싱 될 필요 관심의 RNA를 대표보기를 얻을 수 있습니다. 새로운 방법에도 불구하고 지난 몇 년 동안 제기하는 데에 따라서, 오늘날에도 프라이머 확장으로 인해 더욱 그러하다 사용, 저렴한 비용과 짧은 처리 시간의 용이성, 자신의 존재 이유가여기에 제시된 형광 기반의 방법.

프라이머 신장도 1은 하나의 기본 해상도까지 특정 RNA 분자의 5 &#39;말단을 결정하기 위해 분자 방법이다. 이러한 5&#39;-RACE (cDNA의 신속한 증폭이 종료 됨) 같은 다른 방법의 장점은 빠른 처리 시간을 용이 RNA 분자의 서로 다른 길이의 혼합물을 분석 할 수있는 능력이다. 이 방법은 RNA 분자가 특정 길이의 cDNA 단편을 생성하는 특정 형광 프라이머를 사용하여 전사 반응을 반대로 실시함으로써 작동한다. 이들의 cDNA 분자 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에 전통적인 생거 시퀀싱 반응이 함께 실행 의한 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 그 형광을 검출 할 수있다. 된 cDNA 단편의 길이는 5 &#39;말단 RNA의 맵핑을 허용 시퀀싱 사다리 비교에 의해 평가된다. 전통적으로, 프라이머 신장 반응을 함께 사용방사성 동위 원소와 X 선 필름에의 cDNA 분자들을 검출한다. 그들의 감도가 약간 낮다이라도 인해 건강 위험, 폐기물 처리 문제 및 취급의 용이성, 새로운 프로토콜은 자동화 된 시퀀서와 프라이머 신장의 검출을위한 형광을 이용한다. 형광 프라이머 (로모 손 년 이상) 장기간 안정적으로 형광 표지 된 프라이머를 사용하여 무선 표지 반복 절차가 생략 될 수있다. 우리는 여기에서 설명하는 방법은 자동화 겔 시퀀서를 이용하지만, 약간의 수정과, 모세관 시퀀서는 cDNA의 분리 및 검출 3에 사용될 수있다. 겔 분석 병렬 특성은 가능한 RNA 절단 또는 프로세싱 심지어 적은 양을 검출 할 수있다. 또 다른 이점은 검출 될 수 단말 절단 또는 심지어 하나의베이스 처리로서,이 방법의 고해상도이다. RNA 절단 또는 가공, t의 검출에 관련하여프라이머 확장 ypically 두 가지 종류가 구별된다. 다른 경우에, 처리가 생체 내에서 수행하고, 생성 된 RNA 정제 반면 한 경우, 효소 처리, 정제 된 RNA 정제 효소를 사용하여 시험 관내에서 수행된다. 프라이머 신장 시험 관내에서 수행에 두 경우 RNA가 RNA의 소스에 따라, 그러나, 실시되고, 상기 방법은 시험 관내 또는 생체 내 프라이머 신장이라고 하나. 여기 제시 프로토콜에서는 때문에 사용 용이성 (정제없이 필요한 단백질)과 동시에 전사 시작점 및 처리를 결정하는 가능성 단독 생체 프라이머 신장에 초점. 그러나, 시험 관내 프라이머 확장은 동일한 방법으로 설정 원칙적으로,이 프로토콜은 시작점을 제공 할 수있다. 여기에 예시 된 방법은 그것들이 높은 의무만큼 많은 세균 종에 적용될 수있다핵산의 순도 높은 수율 준비. 우리 실험실 연구 독소 항독소 (맞대기) 시스템 4,5, 프라이머 신장 방법은 광범위하게 사용되는 필드의 규정 범위에 초점을 맞춘다. TA-시스템은 안정적이고 내생 활성 독성 단백질과 독성 6,7 중화 대부분 불안정한 단백질 또는 RNA 항독소로 구성 원핵 생물의 게놈에 존재하는 작은 유전 적 요소입니다. 독소 활성은 때때로하는 RNase 활성 8,9 의해 대부분 복제, 세포벽 합성 또는 다른 메커니즘의 억제에 의해 발휘되지만. 일반적으로, RNA 분해 효소 특이성 프라이머 신장 방법 중 하나는 다른 테스트를 수행하여 결정된다. 벽개 및 전체 길이 단편의 혼합물을 동시에 그들의 5 &#39;끝나는 결정하기 위해 분석 될 수있는 프라이머 신장 반응,이 애플리케이션에 매우 적합하다. 시험 관내 및 생체 프라이머 확장에 믹스를 사용하여,특정 독소의 RNase 절단은, 예를 들어, 서열 특이성 10-13 결정될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> . 프라이머 확장 절차 1. 개요 그림 세균 배양 실험의 필요에 따라 배양 및 처리됩니다. 총 RNA는 세포의 cDNA를 수득 대상 특정 형광 DNA 프라이머를 사용하여 역전사 반응에 DNA의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리하고 실시로부터 추출된다. 게놈 DNA 또는 플라스미드를 추출하여 이후의 cDNA 조각과 크기 비교를 위해 형광 생거 시퀀싱 반응에 사용된다. 프라이머 신장 산물은 변성 우레아 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 생거 시퀀싱 제품을 함께 실행하고 자동화 레이저 현미경으로 분석한다. 라 cDNA를 밴드와 함께 선까지입니다 시퀀싱베이스세인트 5 &#39;의 cDNA 끝 (파란색 화살표)의 기본. Fekete 추가 정보, 등. (3) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전체 프라이머 신장 절차의 개요는도 1에서 발견 될 수있다. 요약하면, 박테리아 세포 수확, 배양, 세포 펠렛을 용해 및 RNA 추출. 정제 된 RNA이어서 역전사 템플릿으로 동작 할 수있다 DNA 분자의 흔적을 제거하기의 DNase I로 처리된다. 특정 형광 프라이머는 관심 영역에 교배와 이후 단일 가닥 보완 DNA (cDNA를) 결과, 전사 역, RNA에 추가됩니다. 시퀀싱 사다리 형광 프라이머를 이용하는 전통적인 생거 시퀀싱에 의해 생성 및 프라이머 신장 된 cDNA 단편의 나란히 변성 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 분리된다. 결과겔은 관심의 5 &#39;말단의 식별을 허용 형광 밴드를 비교하여 분석된다. 전사 시작 지점 및 처리 사이트는 다음 서열 비교​​에 의해 개별적으로 평가된다.

<table><tbody><tr><td>AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&amp;micro;l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument&amp;nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescently labeled primers</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5&amp;rsquo; DY-681 modification of &amp;ldquo;ordinary&amp;rdquo; DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Product discontinued</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini preparation kit</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrate</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNA STORAGE BUFFER</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternative: &amp;ldquo;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)&amp;rdquo; from Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&amp;bull;In RNase Inhibitor</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo

형광 계 프라이머 신장 (FPE)는 전사 시작점 또는 RNA 분자의 프로세싱 사이트를 결정하기 위해 분자 방법이다. 이것은 특정 형광 표지 된 프라이머 및 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 변성하여 수득 된 cDNA 단편의 후속 분석을 이용하여 관심있는 RNA의 역전사에 의해 달성된다. 동시에, 전통적인 생거 시퀀싱 반응은 자신의 정확한 해당 기지의 cDNA 단편의 단부를 매핑 겔상에서 실행된다. 제품은 복제되어야 복수 후보 서열 5&#39;-RACE (cDNA를 엔드 신속한 증폭), 대조적으로, 프라이머 신장에 의해 생성 된 cDNA 단편의 대부분은 동시에 하나 겔 실행에서 검출 할 수있다. 또한, (결과를 최종 분석에 역전사에서) 모든 절차는 하나의 작업 일에 완료 할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이머를 사용함으로써, 유해 방사성 동위 원소의 사용은 표지 된 시약을회피 할 수 있고, 제품은 전기 영동 과정에서 검출 될 수 있기 때문에 처리 시간이 감소된다. 다음의 프로토콜에서는 확실하고 신속 S.에서 (예를 들어, 독소 항독소 시스템 구성 요소) 시작점 및 RNA 프로세싱 사이트 전사을 추론의 RNA의 5 &#39;말단을 검출하는 생체 내 형광 프라이머 신장 방법을 서술 구균, E. 대장균 및 기타 세균.

도 6에 도시 된 바와 같이, 프라이머 신장 반응 관심 사체의 전사 시작 포인트를 결정하는데 사용될 수 있고 (통상적으로 -10 -35 원소로 식별 됨) 프로모터 영역을 추론 할 수 있습니다. 최상위 (가장 긴)의 cDNA 단편의 mRNA의 5 &#39;말단을 나타내며, 따라서 시퀀싱 사다리에 비해 용이하게 매핑 될 수있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig6highres.jpg" /> 프라이머 확장 반응의 그림 6. 대표 결과. 왼쪽에서 E. 전체 생체 프라이머 신장 겔 다양한 플라스미드와 대장균이 표시됩니다. 관심의 개별 영역이 확대됩니다. 상단 (A)에있어서, 전사로 ompA 시작점의 판정이 도시되어있다. 역전사는의 mRNA의 5 &#39;말단에서 중지되므로 공업 (전체 길이의 RNA 밴드를 만들어) 화살표로 icated. 첨부 된 시퀀스에 도시 한 바와 같이 시퀀싱 사다리의 cDNA 밴드를 정렬함으로써, mRNA를 5 &#39;말단을 결정할 수있다. 하부 부분 (B)에서, YoeB-seq2 RNA 분해 효소에 의해로 ompA 사체의 절단이 도시되어있다. 레인 - 1 부재와의 cDNA 제품의 존재와 일치, (5) 활성의 RNase와 샘플을 나타냅니다 - 3 4 차선 반면 독소 YoeB-seq2가 없거나 비활성화되어있는 샘플을 나타냅니다. 화살표로 표시된 바와 같이 두 가지 주요 절단 제품이 만들어집니다. 각 레인과 시퀀싱 사다리의 해당 RNA베이스에 사용 된 ddNTP가 표시됩니다. 성적 증명서 부품은 마젠타 글꼴로 코돈 블루 글꼴, 프로모터 요소와 8 월 시작으로 표시됩니다. 자세한 내용은; Nolle 등 알에서 원래 연구 문서를 참조하십시오., 미생물학 159, 1575-1585 (2013). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52134/52134fig6large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다. 도 6에 도시 된 예에서,로 ompA mRNA를 TSP는 (겔 아래 서열에서 화살표로 표시) G를베이스로 측정되었다. 이 15 전에 발표로 ompA TSP과 일치한다. 주제는 각각의 합의 시퀀스 (각각 TTGACA 및 TATAAT)에서 두 기지를 각각 다르기 때문에 프로모터의 -35과 -10 요소 TTGTAA과 TAGACT (16)로 추론 할 수있다. 이러한 5 &#39;RACE 같은 다른 방법과는 대조적으로, 프라이머 신장 반응을 정확하게 결정하고 RNA 분자의 절단을 정량화하는데 사용될 수있다. RNA 분자의 쪼개짐 동시에 겔에서 cDNA를 밴드로 검출 할 수없는 5 &#39;말단을 생성한다. 여러 개의 PCR 산물이 절단 제품을 얻기 위해 서열화되어야하기 때문에 하나의 mRNA를 여러 절단 제품 식별은, 5 &#39;RACE 실험에서 더 어렵다만 총 (미처리) RNA 대량의 작은 분율을 나타낸다. 도 6의 하부에서의 RNase 의한 절단의 RNA 매핑이 도시된다. 앞서도 5의 RNase YoeB-seq2, S.에서 TA-시스템의 일부를 기술 한 바와 같이 17 equorum, 개시 코돈에 가까운 절단의 mRNA를. 이 절단은 동족 항 독소 YefM-seq2에 의해 억제 될 수있다. 된 RNase YoeB가 (레인 1 - 3)이 존재하지 않거나 비활성화 인 경우, 어떤 프라이머 신장 산물 가까이 개시 코돈에 형성되지 않는다. RNA 분해 효소 활동은 곧 하류 코돈이 나타 시작의 존재 (레인 4 &amp; 5), 두 개의 강력한 밴드 때마다. 이 방법을 사용하여, 절단 패턴은 쉽게 식별 될 수있다. 그림 7은 실패 프라이머 확장 실험을 보여줍니다. 역전사 반응에 과량으로 RNA, cDNA를 발생량 같은 강한 신호를 생성으로 인해, 그 개인의 cDNA 밴드들과 구별 될 수 없다. 이는 5 &#39;RNA 종료 판정이 불가능하게 만든다. (도 7에 도시 된 바와 같이) 그러한 리보솜 RNA로서 프라이머 신장 반응에서 고도로 발현의 RNA를 사용하는 경우, 과다 노출 된 영역이 증가의 위험. 따라서, 총 주형 RNA의 양은 관심 RNA의 풍부함으로 조정되어야한다. 관심 사체 만 총 RNA의 소량을 구성 할 때 반대로, 역전사 반응의 양은 달리 신호가 너무 약한 것, 증가되어야한다 (미도시). 이것은 또한 더 강한 신호를 발생 (예 rRNA 유전자 또는 유전자 플라스미드 인 코드하는 유전자)를 셀당 다중 복제 템플릿으로, 생거 시퀀싱 반응에 적용된다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig7highres.jpg" /> 그림 7에서 실패한 프라이머 확장의 대표 결과 </stro<html> NG&gt; S. 구균. 16S RNA는 박테리아 세포에 매우 풍부하다. 총 RNA의 적당한 양을 사용하는 경우에 강한 역전사 신호에 리드. 여기에 도시 된 경우에는, 강한 cDNA를 밴드의 정확한 5 &#39;말단을 방지하고, 따라서 5&#39;마스크 매핑. 또한, 리보솜 RNA를 매우 구조화되어 있으므로 전체 길이 조각을 나타내지 않는 짧은 cDNA의 제품을 생산, 조기 역전사을 종료 할 수 있습니다. 내열성 역 전사 효소와 함께 역전사 승온이 경우에는 쉽게 과거 보조 구조물을 합성 할 수있다. 때문에 게놈 DNA의 시퀀스의 여러 사본에, 생거 시퀀싱 사다리 단일 복사본 유전자보다 강하다. 겔 영상을 향상시키기 위해, RNA 및 DNA는 역전사 금액 및 생거 반응은 감소되어야하고 / 이하인 제품이 겔에 적용._upload / 52134 / 52134fig7large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 1 : RNA의 DNase의 I 소화. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="158" width="687"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 위의 단계에서 RNA </td><td> 70-100 μg의 </td></tr><tr><td> 10 배의 DNase I 완충액 (100 mM 트리스, pH가 7.5, 25 mM의의 MgCl 2, 2 5mM의 염화칼슘) </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> DNase의 I,의 RNase 무료 (2 U / μL) </td><td> 10.0 μL (RNA의 최대 10 μg의의 DNase I의 1 μL 당) </td></tr><tr><td colspan="2"> DDH 2 O 500 μL에 볼륨을 가져와 (DEPC 치료) </td></tr></tbody></table> DNase의의 반응 부피와 양이 나는 양의 O에 따라 스케일 업 또는 다운 될 수있다F RNA를 사용합니다. 표 2 : RNA-프라이머 하이브리드. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 하나의 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 5-15 μg의 </td></tr><tr><td> 형광 표지 된 프라이머 </td><td> 2 pmol의 </td></tr><tr><td colspan="2"> DDH 6 μL로의 볼륨을 가져와 2 O (DEPC가 처리) </td></tr></tbody></table> RNA 샘플 및 프라이머 당 하나의 반응을 설정합니다. 표 3 : 프라이머 확장 마스터 믹스. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="438"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 하나의 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> DDH 2 O (DEPC 치료) </td><td> 1.3 μL </td></tr><tr><td> AMV RT 버퍼 (10 배) </td><td> 1.0μL </td></tr><tr><td> 의 dNTPs (10 mM의,의 RNase 무료) </td><td> 1.0 μL </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 </td><td> 0.2 μL </td></tr><tr><td> AMV 역전사 효소 (RT) (20-25 U / μL) </td><td> 0.5 μL </td></tr></tbody></table> 필요한 반응의 수까지 확장 할 수 있습니다. 표 4 : 10 배 TBE 레시피. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 트리스 자료 </td><td> 107.8 g </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> 55.0 g </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 7.4 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 먼지와 보풀을 제거하는 고순도 DDH 2 O 및 필터 1,000 ml의 볼륨을 가져와 </td></tr></tbody></table> 4 °에서 먼지와 보풀 및 저장소를 제거하기 위해 필터C. 표 5 : 시퀀싱 젤 레시피. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> 10.5 g </td></tr><tr><td> DDH 2 O (MilliQ를) </td><td> 13.0 ml의 </td></tr><tr><td> 10 배 TBE </td><td> 2.5 ml의 </td></tr><tr><td> XL 빠른 젤 솔루션 </td><td> 5.0 ml의 </td></tr><tr><td> TEMED (N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethane -1,2- 디아민) </td><td> 25 μL </td></tr><tr><td> APS (황산 암모늄, 10 %) </td><td> 175 μL </td></tr></tbody></table> 신속 TEMED 및 APS의 첨가 후 프로세스 겔 용액.

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Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는<em&gt; 생체</em

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

26.9K 조회수.  University of Tübingen. We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

발생학

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

생화학

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be bound by many different RBPs that will regulate its production, stability, activity, and degradation. As such, much has been done to understand the dynamics that exist between these two types of molecules. A particularly important breakthrough came with the emergence of &#8216;cross-linking and immunoprecipitation&#8217; (CLIP). This technique allowed stringent investigation into which RNAs are bound by a particular RBP. In short, the protein of interest is UV cross-linked to its RNA substrates in vivo, purified under highly stringent conditions, and then the RNAs covalently cross-linked to the protein are converted into cDNA libraries and sequenced. Since its conception, many derivative techniques have been developed in order to make CLIP amenable to particular fields of study. However, cross-linking using ultraviolet light is notoriously inefficient. This results in extended exposure times that make the temporal study of RBP-RNA interactions impossible. To overcome this issue, we recently designed and built much-improved UV irradiation and cell harvesting devices. Using these new tools, we developed a protocol for time-resolved analyses of RBP-RNA interactions in living cells at high temporal resolution: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (&#967;CRAC). We recently used this technique to study the role of yeast RBPs in nutrient stress adaptation. This manuscript provides a detailed overview of the &#967;CRAC method and presents recent results obtained with the Nrd1 RBP.

Kinetic cross-linking and analysis of cDNA is a method that allows investigation of the dynamics of protein-RNA interactions in living cells at high temporal resolution. Here the protocol is described in detail, including the growth of yeast cells, UV cross-linking, harvesting, protein purification, and next generation sequencing library preparation steps.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

생물학

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는

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