우리는 MRC 영국 (G0800498)에서 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 항생제 내성을 포함하여 pcDNA 3.1 (+) 발현 벡터를 제공하기 위해, GABA -R 서브 유닛 별 γ2 항체 교수 R. 하비, 약국의 UCL 학교를 제공하기 위해, 교수 JM Fritschy, 취리히 대학에 감사드립니다 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주의 생산을위한 유전자.

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	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜을 수행 할 기술적으로 어려운 것은 아니지만, 가장 정확하고 반복 가능한 공동 배양 분석을 달성하기 위해 따라야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배양 매체 가시 뉴런은 최적의 농도로 접종해야합니다. 너무 드문 드문 시드 경우, 신경 세포는 매우 느리게 개발하는 경향이 생존이 크게 감소한다. 너무 조밀하면 시드 한편, 뉴런 HEK293 세포에 들어갔을 분석하는 응집을 저해하는 경향이있다. 둘째, 그것은 일시적으로 안정적 전에 공동 문화로를 platting에, GABA의 R을 발현하는 HEK293 세포에서 형광 기자, GFP 또는 mCherry을 표현하는 것이 좋습니다. 이는 이들 세포와의 연결을 문화에서 드문 생존 아교 세포의 세포 사이의 모양과 크기에 유사성에 의해 손상 될 수 있습니다 HEK293 세포의 신뢰성 인식 할 수 있습니다. GFP 또는 mCherry cDNA로 형질 감염 효율을 달성하기 위하여, HEK293 세포주 지수 성장기에 있어야하고6 웰 플레이트에 적절한 밀도로 시드. 형질 다음에 스파 스 시드를 통해 시딩의 cDNA를 복용 세포를 방지 할 수있는 동안 세포가 제대로 성장하게됩니다. 형질 날에 90 % 합류 - 그들은 70 사이되도록 이상적으로, 세포를 시딩한다. 어떤 세포주가 다른 것보다 더 민감 셋째로, 형질 전환은, 사용 된 각 세포주에 대해 최적화되어야한다. 구성 적 GABA는 HEK293 세포에서 R 발현 세포 생존 및 형질 감염 후 복구 세포의 능력을 감소하기 때문이다. 또한, 생존 일부 세포주 크게 다른 것보다 더 민감하여, HEK293 세포에서 발현 GABA의 루피의 유형에 따라 달라진다. 리포좀 시약을 사용하여 형질 감염은 빠르게 성장 세포주에 외래 단백질을 발현하는 형질 높은 효율 및 발현 수준을 모두 제공하기위한 최적의 방법이다. 그러나,이 시약에 대해, 천천히 성장하는 세포주에 너무 많은 손상을 야기이는 우리가 정기적으로 비 리포좀 형질 전환 시약을 사용합니다. 이것은 리포좀 시약 유사한 방식으로 작동하지만 효율적인 형질 필요한 DNA의 양은 상당히 감소된다. 이것은 큰 세포 생존을 허용 (대략 80~90% 60 % 사용하여 리포좀 시약과 비교)하지만 낮은 형질 전환 효율 (60 %)로. 마지막으로, 제어 HEK293 또는 α1의 수 / β2 / γ2 HEK293 신경 세포 배양 물에 첨가 발현 세포하여 최적화 될 필요가있다. 그들은 매우 드문되기 때문에 너무 적은 수의 세포를 추가하면, HEK293 세포와 신경 세포 사이의 접촉의 성공적인 분석을 손상시킨다. 반대로, 너무 많은 HEK293 세포를 첨가하여 몇 시간 이내에 신경 세포 사멸을 야기한다. 배아 매체 가시 신경 세포 문화가 이상적으로 배아 15 세에서 해부 선조체 조직을 이용하여 제조한다 - 그러나 17, 종종 배아 최적의 나이보다 약간 젊은 이상인 것을 발생합니다. 이 경우, 뉴런의 수가 배양에 접종 것변화 될 필요가있다. E15보다 어리다 조직은 E17 최적의 세포 생존 할 수 있도록, 더 높은 밀도로 접종 할 필요가 있습니다보다 나이가 조직하는 동안, 약간 낮은 밀도에서 시드 할 필요가있다. 또한, 시토신 아라 비노 시드 (아라-C)은 나이가 조직에 더 풍부 아교 세포의 성장을 방지하기 위해 이전의 문화에 추가해야 할 수도 있습니다. 공동 배양을 생성 할 때 상술 한 바와 같이, 그것은, 형질 감염된 HEK293 또는 α1 / β2 / γ2 HEK293 발현 세포의 수를 최적화 도금하는 것이 중요하다. 그러나 때문에 생존의 차이, 각 세포주에 대해이 결정을 할 필요가있다. 이 조절 신경 매체가 너무 희석되지 않도록하고 전형적으로 50 μL의 최대 음량에 30,000 셀들은 이미 신경 세포 배양 배지 500 μl를 함유하는 24 웰 접시의 각 웰에 첨가한다 조건 해당 각 내에서 잘, 예를 비교적 일정하게 유지 </em&gt; 성장 인자의 농도. 물론 볼륨 각보다 큰 50 μl를 추가하면 일반적으로 신경 세포를 죽이는 것이다. 공동 배양 기술의 주요 단점 중 하나는 신경 세포 배양 물 뉴런 정상적인 미세 환경으로부터 제거하고 정상적인 해부학 적 조직을 확립 할 수없는되었음을 의미 단층, 성장 중 해리 된 세포로부터 생성된다는 점이다. 그러므로 그들은 시냅스 개발의 초기 단계에 영향을 미칠 수있는 다른 셀들로부터의 적절한 연결 입력 및 분비 분자 부족하다. 예를 들어, 생체 내 중간 가시 뉴런 조밀 이러한 입력은 선조체 조직을 절개 중에 손상되기 때문에 글루타메이트 시냅스 형성하지 않는 우리의 신경 세포 배양에서, 그러나, 피질, 시상 및 다른 뇌 영역 (34)로부터 글루타메이트 입력에 의해 신경 지배된다. 어떻게 배양 매체 가시 뉴런의 기능 글루타메이트 시냅스의 부재 AFFECTS GABA R을 표현하는 서로 및 / 또는 HEK293 세포와 GABA 성 시냅스를 형성 할 수있는 능력은 의문으로 남아있다. 이 질문은 쉽게 피질 글루타메이트 신경함으로써 그들이 35 종래 HEK293 세포의 부가 기능에 시냅스를 형성 할 수 있도록 함께 중간 가시 뉴런을 배양함으로써 해결 될 수있다. 대안적인 접근법은 성숙 및 시냅스 형성에 중요 할 수 cytoarchitecture의 일부를 유지 Organotypic 슬라이스 배양에 기초 공동 배양 모델 시스템을 설계하는 것이다. 그러나 Organotypic 슬라이스 문화는 여기에 수행 된 분석을 손상시킬 수 조밀하고 이기종 neuropil 있습니다. 이는 충분히 높은 표면 발현 (30)를 소정의 시냅스 형성에 필요하지 나타나지만 공동 배양 분석을 사용하는 또 다른 중요한 단점은, GABA 루피들이 뉴런 그대로 클러스터되지 HEK293 세포의 표면에서 발현한다는 것이다. 예를 들면, R에odent 뇌와 해마 문화에서, α1 GABA R 서브 유닛은 피라미드 세포의 모든 시냅스 도메인에 가장 GABA 성 시냅스에서 발견된다. 그러나, α2는 특히 세포체에 시냅스와 수상 돌기의 부분 집합에 위치하고 있지만, 면역 형광 및 전자 현미경 (36)에 의해 계시 고, 축삭 초기 세그먼트에 충실. 공동 배양에 시냅스 형성이 여전히 신뢰성있게 검출 할 수 있음을 감안할 때, 30 분석이 HEK293 세포의 세포 표면에서 GABA의 루피의 밀도가 시냅스 내에서 이러한 수용체의 밀도보다 비슷하거나 심지어는 더 높을 수 있음을 시사 신경 세포의 클러스터. 이것은 적어도 같은 gephyrin 등 neuroligin 같은 시냅스 접착 단백질 및 시냅스 밀도 단백질, 적절하게 조립 GABA R과 충분한에 존재하는 경우, 공동 문화 시냅스 형성에 필요하지 않은 이유 부분에서 설명 할 수 밀도. 그것은 잘 GABA의 R과 구조적 및 기능적 이종 것으로 설명되고, 수용체 아 단위 조성물은 세포 내 현지화 및 약리학 적 특성을 결정한다는. 서브 유닛이 거의 독점적으로 현재 extrasynaptic GABA의 루피에있는 동안 예를 들어, 2 개의 서브 유닛의 결합은 GABA의 RS의 시냅스 현지화을위한 전제 조건으로 알려져있다. 단지 조합 αβ 통합 수용체는 주로 extrasynaptic 도메인 12 (14) 지역화 할 것으로 생각된다. 이 특이성은 우리의 공동 배양 시스템에서 유지되는지의 여부를 쉽게 일시적 신경 세포 배양 물에 추가하기 전에, 안정적으로 α 및 β 서브 유닛을 발현하는 HEK293 세포주에 2 개 소단위의 cDNA를 형질 감염에 의해 시험 될 수있다. 이 방법을 사용하는 우리의 예비 실험은 연접 용이 정시 나타내는 만이 서브 유닛의 존재 하에서 형성되는 것이 제안생체 내에서 관찰 ficity이 시험 관내에서 유지 될 가능성이있다 (데이터는 미도시). 또한, 다른 α 서브 유닛을 통합 GABA의 R은 선택적으로 시냅스 전 뉴런의 특정 유형의 형성 연접 언어로 번역. 예를 들어, 글로 버스 pallidus에서, α1-GABA의 R은 일반적으로 striatopallidal (STR-GP) 각각 수상 돌기 및 중간 가시 신경 세포의 체세포 지역에있는 palliopallidal (GP-GP) 시냅스에서 찾을 수 있습니다. α3-GABA의 루피는 중간 가시 뉴런의 perisomatic 지역에있는 이러한 뉴런의 말단 수상 돌기에 위치하며, 선조체 (32)로부터 입력에 의해 주로 접촉 α2-GABA의 루피 동안, 지역 GP 축삭 담보로 연락한다. 시냅스 및 다른 신경 세포 구획에서 다른 유형의 특정 α 서브 유닛의 발현은 또한 HIPP 같은 다른 뇌 영역에서 입증되었다ocampus 21과 18, 20 신피질. 이러한 결과는 특정 억제 시냅스가 뇌에서 형성되는 방법에 대한 의문을 제기. 시냅스 단말기의 특정 유형의 접착력은 접촉점에 특정 GABA R 아형의 삽입을 유도 하는가? 수용체는 세포막 삽입 특정 출처의 축삭 터미널의 접착을위한 필수 조건이다 자신의 서브 유닛 구성에 따라 특정 세포 내 위치에 인신 매매? 지금까지 이러한 질문에 답이 남아있다. 이러한 공동 배양 모델 시스템으로 환원 모델 시스템의 사용은 시스템이 중요한 DNA 작 제물 및 시약의 적용 형질 쉽게 순종하며 때문에 우리는이 복잡한 질문에 대답 시작할 수 있도록, 그것은 생균 영상 분석에 적합 30. 따라서,이 모델 시스템을 이용하여 우리가 알고, GABA의 루피의 다른 유형을 포함하여 개별적인 분자의 역할을 테스트 시작할 수n은 연접에 존재합니다. 또 다른 장점은 분 이내 시간 급속이 모델 시스템 형태 시냅스, 실험 지속 기간을 감소시키는 점이다. 유사 공동 배양 모델 시스템이 성공적으로 신규 synaptogenic 분자 27,37,38 스크리닝하는 과거에 사용되었다. 중추 신경계가 어떻게 발전하는지 이해, 성숙하고 예, 행동이나 인식에 대한 제어에 매우 복잡 뉴런 사이 형태의 연결은, 기본적인 중요하다. 이 먼 목표는 개발 기간 동안 인식과 세포 간 통신의 각 단계를 제어하는​​ 분자 메커니즘의 윤곽에 의해 달성 될 것이다. 때문에 복잡성에, 이러한 여러 세포 상호 작용의 분자 세부 사항은 현재는 감소 된 시스템에서 정밀하게 공부하실 수 있습니다. 그러나, 능력은 단백질의 여러 조합을 표현하는 방법과 연구함으로써 이러한 시스템의 복잡성을 증가시키기이들은 예를 들어, 유전자 결실 접근 방식에 비해 몇몇 장점을 가지고 상호 작용한다. 하나의 유전자 결실 효과의 정확한 해석은 종종 특히 뇌 발달에, 원래 병변 효과 마스킹 보상 메커니즘과 연관된 변화에 의해 손상되기 때문이다. 여기서 설명하는 단순하면서도 유익한 공동 배양법은 시냅스 형성, GABA의 루피의 구조적 역할의 검색을 허용 GABA의 루피와 다른 세포 부착 분자 및 / 또는 시냅스 기질 단백질이 서로 어떻게 상호 작용 하는지를 조사 할 가능성을 열었다 synaptogenesis에 중. 시냅틱 기질 단백질들은 최근 글루타메이트 시냅스 형성 (39)에서 중요한 역할을하는 것으로 입증되었다 주어진 특히 관심이다. 그들은 &#39;정상 가이드 분자 메커니즘에 대한 지식을 사전에 잠재력을 갖고 있기 때문에 공동 배양 모델의 추가적인 개발이 중요# 8217; 두뇌 발달에 따라서는 이러한 메커니즘은 간질, 정신 분열증, 자폐증 스펙트럼 장애와 많은 다른 사람과 같은 많은 신경 발달 질​​환에서 변경하는 방법에 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다.

GABA는 가장 풍부한 흥분성 신경 전달 물질 인 글루타메이트 1 항 배아 뇌에서 발견 된 초기 신경 전달 물질 중 하나이다. 개발하는 동안, GABA는 흥분 독성을 유발하지 않고 세포의 증식, 이동 및 신경 네트워크의 형성을 조절하는데 중요한 역할을 미성숙 신경 세포 탈분극 및 흥분. 성인 뇌에서 GABA 수용체 채널 반전 전위 인해 클로라이드 세포 내 농도의 감소로 더 음 전위로 시프트된다. 이러한 변화는, 병렬로, 상향 조절 세포 밖으로 클로라이드 전송 칼륨 클로라이드 공동 수송 체 (KCC2)의 의해 발생되고, 하향 조절 갖는 나트륨 - 칼륨 클로라이드 트랜스 포터 (NKCC1)의 반대의 효과 2. 뇌에서 GABA는 기본적으로 빠르거나 느린 시냅스 억제를 중재하는 GABA A 또는 GABA의 B 중 하나 수용체에, 각각의 결합LY. GABA의 루피도 량체 이온 성 또는 리간드 - Cys이고 루프 이온 채널로 알려진 수용체의 클래스이다. GABA 두 분자, 중탄산 이온 염화물 이온 및 적은 정도로 투과성 수용체의 활성화를 위해 요구된다. 염화 컨덕턴스의 증가는 시냅스 후 뉴런 (3)의 활성화에 탈분극, 흥분성 이벤트의 효과를 감소시킨다. GABA의 루피의 구조적 다양성은 오랫동안 기능 및 약리학 적 특성의 폭의 넓은 범위를 결정하는 중요한 요소로 인식되고있다. 일반적으로 α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ와 θ 3 : 기본 GABA의 루피로 분류 여러 아형과 서브 유닛으로 구성된 헤테로 펜타 있습니다 큰 N 말단 세포 외 도메인, 막 횡단 도메인 네 (TMS), 및 세 개의 TM 및도 4 (4) 사이의 주요 세포 내 도메인을 포함하는 트랜스 토폴로지.이러한 서브 유닛의 유전 삭제 베어링 마우스가 탄생 5,6 후 죽을 때문에 β3 및 γ2 서브 유닛은, 시냅스 억제 및 유기체의 생존에 필수적이다. 반대로, α 서브 유닛의 개별 이성체는 불안, 진정 작용, 각성, 등과 같은 다른 동작과 관련된 뇌의 특정 시냅스 연결 기능에 중요하지만, 개별적으로, 생명에 필수적이지 7-9이다. GABA의 루피는 강력한 진정제, 수면제, 항 불안 및 벤조디아제핀, 바르비 투르 산염, neurosteroids 및 마취제 7,10,11 등의 항 경련 효과와 약물의 다양한 행동의 주요 사이트입니다. 시냅스 GABA의 루피는 일반적으로 γ2 서브 유닛 (가장 일반적으로 β2 또는 β3)이 β 서브 유닛과 두 개의 α 소단위 (α1, α2, α3 또는 α5) 12, 13이 포함되어 있습니다. 여분 시냅스 수용체의 우세한 클래스 조합 δ 수단를 포함두 개의 α 소단위 (α4 또는 α6), 두 개의 β 서브 유닛 (β2 또는 β3) 14. 세포막에 축삭 돌기 또는 소마, 및 삽입에 GABA의 루피의 세포 내 지역화 β-서브 유닛 (15, 16)의 존재에 따라 달라집니다. 그러나, 다른 GABA R의 선택적 결합은 특정 α 소단위 (α1, α2, α3 또는 α5) 7,17,18의 존재와 관계를 잘 시냅스의 가지 유형으로 아류. 중요한 것은, 쥐에서 α1 또는 α2 서브 유닛의 삭제는 억제 시냅스 (19)의 미세 구조 변화가 발생합니다. 이 GABA가 버렸네 형성을 조절하는 직접적인 역할을 스스로 RS 제안합니다. 증거는 GABA 성 시냅스 개발 신경 목표도 다른 억제 축삭의 유형과에서 클러스터 된 수용체와 접촉하는 이벤트를 정확하게 조율 순서임을 나타냅니다억제 시냅스의 각 클래스는 선택과 17,20-22 기능적으로 적응한다. GABA 성 시냅스에서의 특이성이 기본 원칙은 사전 및 시냅스 파트너가 시냅스 접촉의 개시 동안 서로를 인식 방법에 대한 질문을 제기한다. 시험 관내에서 공동 - 배양 분석은 시냅스 형성의 메커니즘 일부를 연구하고이 과정에서 각각의 시냅스 틈새 스패닝 단백질의 역할을 테스트하기 위해 성공적으로 적용되었다. 시냅스 형성 및 성숙을 중재하기 위해 양방향으로 작동 공통 트랜스 시냅스 작용 단백질의 조합 중 하나는, Neurexins (Nrxns) 및 Neuroligins (NLS)이다. Nrxns는 다양한 아형 (23)에 상승을주는 그들의 라미닌 - neurexin-성 호르몬 결합 단백질 도메인 내에서 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)을 전시 시냅스 단백질이다. Nrxns 또한 다른 단백질과 상호 작용하는 동안, NLS는 자신의 유비쿼터스 시냅스 PA 것으로 생각된다24 rtners. 함께이 단백질은 가까운 단단한 동격 (25)의 시냅스와 시냅스 후 세포막을 유지에 기여한다. 두 개의 가장 풍부한 이소은 흥분성과 억제 성 시냅스, 각각 26 일에 존재하는 NL-1, NL-2입니다. 트랜스 - 시냅스 단백질 상호 작용을 조사하기위한 초기 공동 배양 모델 시스템 중 하나는, 비 - 신경 세포의 다른 유형을 이용, 예컨대 오버 특급 NL-로 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포와 같은 가장 일반적 불멸 세포주 2. 이들 세포는 뇌교 뉴런 배양하면, HEK 세포의 표면에 근접 연접 단백질의 축적은 시냅스 형 콘택트의 형성을 나타내는 관찰되었다. 이러한 공동 문화에 대한 수용성 β-neurexin 첨가 Nrxns과 NLS 사이의 트랜스 시냅스 상호 작용이 시냅스 접촉 형성 (27)에 필요한 것을 건의, 연락처의 형성을 억제 하였다. 또한, 일시적인 발현COS에 β-neurexin 해리 해마 글루타메이트와 GABA 성 신경 세포 시냅스 단백질 gephryin과 GABA R 서브 유닛의 유도 식을 공동 배양 (C의 V-1 (O의 rigin에서) 유인원, 그리고 S V40 유전 물질을 운반하는) 세포의 이러한 두 가지 세포 유형 (28) 사이의 접촉 지점에서 γ2 및 α2. 시냅스 형성을 연구하는 데 공동 배양 모델의 또 다른 예는 일시적 GABA R로 α2 / β3 / γ2 및 NL-2, 및 시상 하부 뉴런 (29)의 혼합 모집단을 소단위 형질 HEK293 세포를 포함했다. 본 연구는 NL-2의 발현이 억제 시냅스 형성 용 절대 조건이라고 결론 지었다. 그러나, 최근의 공동 배양 연구에서, 안정하게 형질 α1 / β2 / γ2 GABA HEK293 세포에서 R은 기능적 시냅스를 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 때 공 배양 GABA 성 메드추가 트랜스 시냅스 또는 후 시냅스 접착 단백질 없이도 이움 가시 뉴런. NL-2 GABA RS (30)와 공동 발현 그러나 시냅스 형성과 강도의 현저한 증가가 관찰되었다. 이것은이 공동 문화 모델 시스템은 이전에 설명한 모델 시스템, 가장 분명하게 증가 감도와 시냅스 접촉 감지의 신뢰성을보다 이점이 있음을 나타냅니다. 시냅스 접촉의 검출에 전반적 개선에 기여하는 두 가지 중요한 요인은 : ⅰ) 각각의 세포의 표면에서 GABA R 서브 유닛의 높이와 일치 식으로 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주의 용도. 이러한 일관성은 다른 공동 배양 조건 사이의 정량적 인 비교를 용이하게한다. ⅱ) 배아 선조체 (31)로부터 배양 배지 가시 GABA 성 뉴런의 순수한 인구의 사용은 알로 합병증 및 혼합 신경 집단과의 사용으로 인한 모호성을 제거WS, 예를 들면, 시냅스 형성 동안 서로 비교 될 수있는 가장 적절한 GABA 시냅스 R 종류의 선택. 시냅스의 형성은 사전 및 시냅스 후 세포 접착 복합체 내의 많은 트랜스 시냅스 신호를 포함하는 것으로 생각된다. 인해 시냅스 시그널링 및 세포 부착 분자의 투명 번호 양방향 특성으로는 시냅스 형성에 관여하는 주요 구성 요소를 식별하는 것이 곤란하다. 따라서, 비 - 신경 세포 내로 단일 세포 부착 단백질을 형질 (이 경우, 생체 내에서 GABA 성 중간 가시 뉴런위한 두 가지 가장 널리 시냅스 대상, α1 / β2 / γ2 또는 α1 / β3 / γ2 GABA 루피 32) 크게 시냅스 표면에서 사용 가능한 트랜스 시냅스 신호의 복잡성을 감소시키고, 시냅스 형성을 촉진하는이 단백질의 효능의 정확한 정량 분석​​을 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Warm in water bath at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Danger: irritant</td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technologies</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Neuralbasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Warm in water bath at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1&lt;sup&gt;(+)&lt;/sup&gt; Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>Stable HEK&amp;alpha;1&amp;beta;2&amp;gamma;2 line</td><td>Sanofi-Synthelabo, Paris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418 disulfate salt (Geneticin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>Danger: irritant</td></tr><tr><td>Phleomycin D1 (Zeocin)</td><td>Life Technologies</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>Danger: toxic, irritant and corrosive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Warm in water bath at 37 &amp;deg;C before use. Danger: irritant.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Nylon Cell Strainer</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>Danger: Irritant</td></tr><tr><td>Chelating agent (Versene)</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td><td>Life Technologies</td><td>15338-100</td><td>Alternative transfection method: Effectene Reagent</td></tr><tr><td>Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td><td>Synaptic Systems</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-&amp;gamma;2 GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor antibody</td><td>Prof. Jean Marc Fritschy</td><td>N/A</td><td>(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. &lt;em&gt;J. Comp. Neurol.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;359&lt;/strong&gt; (1), 154-194 (1995).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-synapsin antibody</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;beta;2/3 antibody (BD17)</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;alpha;1 GABA&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt; receptor antibody</td><td>Professor Anne Stephenson</td><td>N/A</td><td>(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson &lt;em&gt;et al. J. Comp. Neurol.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;416&lt;/strong&gt; (2), 158-172</td></tr><tr><td>Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Mounting reagent (Prolong Gold)</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>Use at room temperature</td></tr></tbody></table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

이 뉴런 HEK293 세포 공동 배양 모델 시스템에 대한 프로토콜은 미세 최적 세포 생존을 허용하도록 조정되었다. 이 시스템에서, 시냅스와 같은 접점의 형성과 분석 기능 수용체에 조립 세 GABA R 서브 유닛의 안정적이고 일관성있는 표현을 사용합니다. 이는 신경 세포 배양 물에 추가하기 전에 HEK293 세포의 표면에서 발현 소단위 시험 면역 세포 화학 분석을 사용하는 것이 중요하다. 이들 실험에서, α1, β2 및 γ2 서브 유닛 (도 1a) 또는 α1, β3 및 γ2 소단위 (도 1b)의 세포 표면 발현은, 이들 서브 유닛의 세포 외 에피토프에 결합 단위체 특이 항체를 사용하여 검출 하였다. HEK293 표면에서 이러한 서브 유닛 사이의 공동 지방화의 높은 수준의 입증되었다. GABA의 표면 발현과 공동 현지화를 확인한 후,HEK293 세포, 공동 문화 R 소단위는 α1 / β2 / γ2 GABA R 소단위 14 일 (체외에서 십사일 (DIV)) 배양 매체 가시 신경 세포를 발현하는 HEK293 세포를 이용하여 제조 하였다. 공동 - 배양에서의 세포를 고정, 24 시간 동안 배양 및 면역 세포와 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 하였다. 콘택트 분석 GAD65 양성 GABA 성 축삭 터미널 제어 HEK293 세포 (도 2A, 2B) 만 산발적 접촉을 형성 것으로 나타났다. 4 시간에서 검출 접점의 수는 HEK293 세포 당 7.3 ± 0.9이고,이 숫자는 배양 된 신경 세포로 HEK293 세포를 첨가 한 후 24 시간에 HEK293 세포 당 5.5 ± 0.5 연결부 (± SEM을 의미)로 감소 하였다. 대조적으로, GAD65 양성 GABA 성 축삭 단자 GABA의 R을 발현하는 HEK293 세포 수많은 시냅스 형 콘택트 형성. HEK293 세포를 첨가 한 후 4 시간에서 획득 컨택 수는 HEK293 세포 당 28.3 ± 4.7이고,이 숫자는 더 증가했다52.1 ± 6.3 D 공동 문화에서 24 시간 (그림 2A, 2B)에서 HEK293 세포 당 (± SEM을 의미). 이러한 시냅스 같은 접촉되었는지 여부를 확인하려면 &#39;활성&#39;즉 기공을 송신기 릴리스를 지원, 소포 - 내강의 도메인 특정 안티 synaptotagmin Cy5에 접합 된 항체는 배양 23 시간 후 공동 배양 배지에 첨가 하였다. 이 항체는 시냅스 전 신경 말단에 혼입되면 시냅스 소포 루멘 및 신경 전달 물질 방출시 시냅스 틈새에서 세포 외액 간의 기공 형성된다. 릴리스에 따라, 기공은 Cy5에 접합 된 형광 항체 소포 내부 synaptotagmin에 부착 된 synaptotagmin를 떠나, 닫습니다. 이러한 방법으로, 적극적으로 신경 전달 물질의 방출에 종사하는 만 소포는 항체로 표시되어 있습니다. 몇 가지 실험에서 어떤 컨트롤 사이의 접촉 HEK293 세포와 중간 가시 신경 단자가 있다면 &#39;액티브 &amp; #8217; HEK293 세포에서 시냅스 GAD65 / synaptotagmin 형광 및 mCherry 형광 (도 3A) 사이의 공동 현지화의 부족에 의해 도시 된 바와 같이. 대조적으로, 다수의 &#39;액티브&#39;접점 매체 가시 뉴런 단자 α1 / β2 / γ2 발현 GAD65 / synaptotagmin 및 mCherry 간의 공동 지역화 고도에 의해 계시 된 HEK293 세포, 특히 HEK293 세포에서 발현 (사이에 형성했다 그림 3B). 중간 가시 뉴런과 HEK293 세포를 표현 GABA R의 다른 하위 유형은 또한 체외에서 시냅스와 같은 형성을 촉진 할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 우리는 한 공동 배양 α1 / β3 / γ2. 또, 제어 HEK293 세포는 거의 도달 synapsin 양성 시냅스 단말기와 연락처를받지 ± 0.48 10.8 공동 문화 (그림 4A 왼쪽, 4B)에서 24 시간 후 HEK293 세포 당 연락처 (± SEM을 의미)를. 그러나, HEK293 세포는 발현synapsin - 긍정적 인 시냅스의 공동 문화의 24 시간 후 HEK293 세포 당 25.3 ± 0.27 (± SEM을 의미) 접점에 도달하는 중간 가시 뉴런의 터미널 (그림 4A 오른쪽과 시냅스 같은 연락처 α1 / β3 / γ2 GABA 루피 양식 훨씬 더 많은, (b)). 그들의 힘은 α1 / β2 / γ2 함유 GABA의 R을의 힘보다 낮은이기는하지만이 α1 / β3 / γ2 GABA 루피는 HEK293 세포에서 발현을 나타냅니다 것은, 또한 시냅스 접촉 형성을 촉진 할 수 있습니다. 이 실험은 우리의 실험실에서 개발 된 공동 문화 모델 시스템은이 과정에서 GABA의 루피의 다른 아형의 효과를 정량적으로 체외에서 시냅스 접촉 형성의 분석뿐만 아니라 평가를 허용하는 것을 나타냅니다. 이 실험은 또한, GABA 성 시냅스의 중요한 기능적 구성 요소를 일뿐만 아니라 그 GABA의 R을 입증 핵심적인 역할을 할 수있다인식과 독립적으로 다른 시냅스 접착 단백질의 억제 뉴런 및 신경 적절한 표적 세포 간의 연접의 형성 공정. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1. 면역 세포 GABA R의 α1의 발현 분석 / β2 / γ2 또는 안정한 HEK293 세포주 α1 / β3 / γ2. GABA R 서브 유닛의 세포 외 도메인을 인식하는 항체는 세포 표면에 발현 라벨 수용체로 사용 하였다. ( A) HEK293 세포주 표현 α1 (알렉사 플 루어 488), β2 (알렉사 플 루어 555)과 높은 수준의 γ2 (Cy5에). (B) HEK293 세포주 표현 α1 (알렉사 플 루어 488), β2 (알렉사 플 루어 555)과 γ2 (Cy5에)높은 수준의 서브 유닛. 스케일 바 :. 10 μm의 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2. GABA 성 중간 가시 뉴런 공동 문화 HEK293 세포를 표현하는 α1 / β2 / γ2-와 시냅스와 같은 접점을 형성한다. (A) (오른쪽 파란색) 형광 항 GAD65 항체와 시냅스 터미널의 라벨 (녹색) 및 또는 GABA R γ2 서브 유닛 (빨간색 왼쪽) mCherry와 HEK293 세포는 이들 사이의 공동 현지화 점을 밝혀 공동 문화에 4 또는 24 시간 후 시냅스와 같은 접점의 형성을 나타내는 표식. 스케일 바 :. 10 μm의 (B) 시냅스와 같은 공동의 정량 분석<html> ntacts. 각각의 광학적 부분에서 눈으로 계수 하였다 DIC 이미징 및 / 또는 mCherry 발현 및 GAD-65 양성 눈물 점 (녹색) 및 HEK293 세포의 표면 사이의 접촉의 수에 의해 계시 된 HEK293 세포는 그들의 형상에 기초하여 식별 된 Z 스택 시리즈 (8-10) 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당, 및 콘택트 / 셀의 수로 표현. 그래프는 공동 문화 4, 24 시간 후 중간 가시 뉴런 및 제어 HEK293 세포 (라이트 그레이) 또는 α1 / β2 / γ2-HEK293 세포 (검은 색) 사이의 접촉의 수를 표시합니다 (± SEM을 의미, N = 각 8 두 개의 독립적 인 실험에서 조건). 이 수치는 Fuchs의 등에서 수정되었습니다. (2013) 30. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 광고 / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;폭 =&quot;600 &quot;/&gt; 그림 3. GABA의 R과는 시냅스 같은 GAD65에 대한 긍정적 인 중간 가시 신경 단자 사이의 공동 문화에서 24 시간 후에 형성 연락처 (알렉사 플 루어 (405) 시안) 및 (A) 제어 HEK293 세포. Immunolabeling을 활성화 연접의 형성을 촉진, 또는 (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 세포, 일시적으로 mCherry로 형질 모두 (빨간색)를 구축합니다. 활성 연락처 시냅스 터미널에서 모두 소포 내강 도메인 별 안티 synaptotagmin 항체 (Cy5에) 및 GAD65 특정 항체 사이의 공동 현지화로 식별하고, mCherry는 HEK293 세포에서 발현. 스케일 바 :. 10 μm의 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> igure 4 &quot;FO : 콘텐츠 폭 =&quot;6 인치 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;폭 =&quot;600 &quot;/&gt; 그림 4. GABA 성 중간 가시 뉴런 공동 문화 HEK293 세포를 표현하는 α1 / β3 / γ2- 서브 유닛과 시냅스와 같은 접점을 형성한다. (A) 방지 synapsin (왼쪽) I 항체 (녹색), 및 제어 HEK293 세포, 또는 α1과 시냅스 터미널의 형광 라벨 / β3 / γ2 HEK293 세포를 표현, 모두 일시적으로 (빨간색) mCherry로 형질이 곳을 밝혀 공동 배양 24 시간 후 시냅스 형 접촉의 형성을 나타내는 이들 마커 간의 공동 지역화. 스케일 바 : 10 μm의 (B). 시냅스 형 콘택트의 정량 분석​​. HEK293 세포 mCherry 식에 의해 식별하고, synapsin의 I 양성 눈물 점 (녹색) 및 HEK293 세포의 표면 사이의 접촉의 수 Z 스택 시리즈의 각 광학 부재에 눈으로 계수 하였다 (8-10) 이미징 소프트웨어를 사용하여 셀 당 및 연락처 / 셀의 수로 표현. 그래프는 중간 가시 뉴런 및 제어 HEK293 세포 (라이트 그레이) 또는 α1 / β3 / γ2-HEK293 세포 (검은 색)의 공동 문화의 24 시간 후 사이의 접촉의 수를 표시합니다 (± SEM을 의미, N = 8 ~ 12 세포에서 두 개의 독립적 인 실험에서 각 조건). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현<sub&gt;</sub&gt; 수용체

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.4K 조회수.  University College London.  개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다. 

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

연구

생물학

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

발생학

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

신경과학

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) pathophysiology in vitro. Multi-electrode array (MEA) recordings are a means to record electrical field potentials from large populations of neurons and analyze network activity over time. It was previously demonstrated that the presence of hiPSC-A that are differentiated using techniques to promote a spinal cord astrocyte phenotype improved maturation and electrophysiological activity of regionally specific spinal cord hiPSC-motor neurons (MN) when compared to those cultured without hiPSC-A or in the presence of rodent astrocytes. Described here is a method to co-culture spinal cord hiPSC-A with hiPSC-MN and record electrophysiological activity using MEA recordings. While the differentiation protocols described here are particular to astrocytes and neurons that are regionally specific to the spinal cord, the co-culturing platform can be applied to astrocytes and neurons differentiated with techniques specific to other fates, including cortical hiPSC-A and hiPSC-N. These protocols aim to provide an electrophysiological assay to inform about glia-neuron interactions and provide a platform for testing drugs with therapeutic potential in ALS.

We describe a method for differentiating spinal cord human induced pluripotent-derived astrocytes and neurons and their co-culture for electrophysiological recording.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

Assessing Glutamatergic Neurons and Glioma Cells Interactions in a Co-Culture

Source: Fuchs, Q. et. al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62748">Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the assessment of neuronal electrical activity in a co-culture of hiPSC-derived cortical glutamatergic neurons and glioma cells using a microfluidic device with multielectrode arrays.

공동 배양에서 글루타메이트성 뉴런과 신경교종 세포 상호작용 평가

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.&#160;
1. Co-culture protocol

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공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현

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