Name: use of maldi-tof mass spectrometry and a custom database to characterize bacteria indigenous to a unique cave environment (kartchner caverns, az, usa)
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA at JoVE.c

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

주의 : 모든 환경에서 미확인 된 박테리아는 병원성 할 수 있으며, 적절한 바이오 안전성 프로토콜을 사용하여주의하여 취급해야합니다. 라이브 문화에 대한 작업은 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 절차를 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-2 절차에 대한 자세한 내용은 페이지 33-38 &quot;미생물 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성&quot;CDC / NIH의 제목 설명서,에서 사용할 수 있습니다. 문서에서 온라인으로 볼 수 있습니다 <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a> . 실험복 / 가운, 보호 안경, 니트릴 또는 라텍스 장갑을 포함 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다. 표준 미생물 학적 방법과주의 사항을 준수해야하며, 생물학적 폐기물은 적절히 폐기해야합니다. 이 데모에 사용 된 박테리아는 Kartchner 동굴에서 분리되었다,AZ, USA, 건조 스펠 레오 뎀, 흐름 돌, 촉촉한 스펠 레오 뎀과 종유석 드립 (표 1) 등 4 개 환경에서. 모든 균주의 16S rDNA 염기 서열 분석에 의해 확인 된 25 % 글리세롤 2 B-R 매체에서 -80 ° C에 보관 하였다. 모든 실험은 실온에서 완료 하였다. 참고 : 우리는 데이터베이스 구축 및 미지의 질량 스펙트럼에 대한 질량 스펙트럼을 획득하기 위해 같은 샘플 준비 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 시료 제조 방법은 스펙트럼의 품질 및 재현성에 영향을 미치는 세 이전에 도시되었다. 다른 샘플 준비 방법을 사용하는 것은 바람직하다 (변형 수준에서 예) 미지의 잘못된 식별, 특히 높은 분류 학적 해상도의 원인이 될 수 있습니다. MALDI 대상 1. 증착 주의 : 여러 프로토콜 단백질 추출물 GUID에 따라 이용해야 산 및 유기 용매의 사용을 필요로 수득각각의 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)에 포함 elines 및 정보. 적절한 보호구 착용해야하며, 사용되는 화학 물질의 종류와 양에 따라 달라집니다 (예를 들어, 아세토 니트릴 등의 독성, 가연성 솔벤트의 상당 수, 작업 할 때 / 가운, 장갑, 보호 안경, 그리고 호흡 보호 장치를 사용해야합니다 실험실 코트, 포름산과 트리 플루오로 산과 같은 부식성 산). <ol><li> 스테인레스 스틸 MALDI 표적 판에하고 건조 할 수 있도록 (해당 앞에서 설명한 프로토콜 11-13을 사용하여 얻은)에는 가능한 세포를 포함하지 않는 단백질 추출물 μL 보증금 1. 1 ㎕의 매트릭스 용액 (α 아노 -4- 하이드 록시 - 신 남산 용액)와 단백질 건조 추출물을 오버레이하고 건조시켜야. </li><li> 각 생물 복제의 경우, 기술 복제합니다 (5-20 기술 회 반복) 적절한 수의 자리. 여기서, 각 생물 복제에 대 한 (10) 기술 복제하고 3 생물 복제합니다 w를 발견오히려 준비했다. 참고 : 우리는 단백질 추출 시료 전처리 법을 이용하는 경우 연마 MALDI 스틸 타겟 판을 사용하는 것을 권장. 스틸 그라운드 대상 플레​​이트를 사용하여 확산 및 개별 샘플 우물 외부의 다른 샘플의 의도하지 않은 혼합의 원인이 될 수 있습니다. </li><li> 보증금 1 μL의 calibrant의 대상 판에 표준이 건조 할 수 있습니다. 1 μL 매트릭스 솔루션을 오버레이하고 건조 할 수 있습니다. </li><li> 음성 대조군으로 대상 접시에 보증금 2 μL 매트릭스 솔루션입니다. </li></ol> 2. 질량 스펙트럼 취득 <ol><li> 질소 레이저 (λ = 337 ㎚)를 구비 한 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 브루 커 FlexControl 소프트웨어를 이용하여 동작. </li><li> 100 샷 단위로 500 레이저 샷의 축적에 의해 긍정적 인 선형 모드에서 각 질량 스펙트럼을 수집합니다. 20kV의에 이온 원 (1) 전압을 설정; 이온 소스 (2) 18.15 kV의 전압을; 및 9.05 kV의에 렌즈 전압. 이러한 매개 변수는 악기 정시 참고및 FIC는 최적의 결과를 얻기 위해 다른 악기에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. </li><li> 충전 당 2 ~ 20 kDa의 자동화 된 스펙트럼 평가를위한 대량으로 충전 범위를 설정합니다. 중심 피크 검출 알고리즘을 사용합니다. (100) 다에서 최소 해상도 임계 값을 설정합니다. 100에서의 최소 세기 임계 값을 설정 2.에서 역치 잡음비 (S N)에 신호를 설정한다. </li></ol> 3. 데이터베이스 건설 <ol><li> 데이터베이스 설계 <ol><li> &quot;새 데이터베이스 마법사&quot;를 사용하여 BioNumerics 7.1에서 새 데이터베이스를 만듭니다. </li><li> &quot;실험 유형&quot;패널에서 명령을 사용하여 스펙트럼 실험 유형, 예를 들어,을 Maldi를 만듭니다. </li><li> &quot;데이터베이스 디자인 패널&quot;을 이용하여 레벨을 작성합니다. 사용하여 새로운 수준의 추가 &quot;데이터베이스&quot;메뉴의 명령 &quot;레벨&gt; 새로운 차원의 ... 추가&quot;. 여기에, &quot;종&quot;수준 &quot;생물 복제&quot;수준 &quot;과&quot;기술 복제 &quot;수준 respectiv를 만들엘리. </li></ol></li><li> 가져 오기 및 원시 질량 스펙트럼을 전처리 <ol><li> &quot;파일&quot;메뉴에서 &quot;내보내기&gt; 질량 스펙트럼&quot;명령을 클릭하여 FlexAnalysis를 사용하여 .txt 파일로 원시 질량 스펙트럼을 보냅니다. </li><li> 복제물 기술적 수준에서 데이터베이스로 원료 질량 스펙트럼 (.txt 파일)를 가져. </li><li> 원시 질량 스펙트럼을 미리 처리. <ol><li> 가져 오기 및 재 샘플 (차 피팅 알고리즘을 사용하여). </li><li> (50 점의 크기와 회전 디스크 포함) 기준 빼기를 수행합니다. </li><li> (창 20 점의 크기와 10 점의 베타 카이저 창) 소음 [연속 웨이블릿 변환 (CWT)], 부드러운을 계산하고, 두 번째 기본 공제 (200 점의 크기와 디스크를 압연)을 수행합니다. </li><li> [: 10 (N S) 잡음 비율 최소한의 신호와 CWT] 피크를 감지합니다. </li></ol></li><li> 전처리 한 후, 같은 피크를 포함하는 피크 목록과 같은 각각의 질량 스펙트럼의 특성 패턴을 저장크기, 피크 강도, S : 데이터베이스 N 등. </li></ol></li><li> 복합 질량 스펙트럼을 만들기 <ol><li> &quot;분석&quot;메뉴의 &quot;... 요약&quot;명령을 사용하여 사전 처리 된 스펙트럼에서 복합 스펙트럼을 만듭니다. 목표 수준으로 &quot;생물 복제&quot;를 선택합니다. </li><li> 여기에서, &quot;생물 복제&quot;수준에서 그 분리에 대 한 세 가지 복합 질량 스펙트럼의 결과로, 그 식민지의 복합 질량 스펙트럼을 산출하기 위해 같은 식민지의 10 기술 복제물의 질량 스펙트럼을 결합한다. </li><li> 여기, 즉 &quot;종&quot;레벨에서 분리하기위한 하나의 복합 스펙트럼을 생성하기 위해 세 가지 복합 스펙트럼을 요약한다. 참고 : 복합 스펙트럼은 기술 복제물의 포인트 별 평균입니다. 95 % 이상 (기본 설정)의 평균 유사도 (피어슨 상관 관계)를 복제 복합에서 제외됩니다. 그들은 (75 %에있는 경우 복합 스펙트럼의 봉우리 만이라고합니다포함 된 복제물의 기본 설정). 생물학적 복제판 들어, 이러한 설정은 각각 90 및 60 %였다. </li></ol></li></ol> 4. 질량 스펙트럼 데이터 분석 <ol><li> 데이터베이스의 항목을 선택하고 &quot;비교&quot;패널에서 &quot;새로운 비교 만들기&quot;명령을 클릭하여 비교를 만들 수 있습니다. </li><li> 여기에, 비교 및​​ 분석을 보여주기 위해 &quot;기술 복제&quot;및 / 또는 &quot;생명 복제&quot;수준에서 질량 스펙트럼을 사용합니다. </li><li> 비슷한 기반 클러스터 분석과 다차원 스케일링 (MDS) <ol><li> 색상 그룹을 만듭니다. 세 가지 생물학적 복합 질량 스펙트럼을 선택하고 해당 분리에 대 한 그룹을 만듭니다 &quot;그룹&quot;메뉴의 명령 &quot;선택에서 만들기 새 그룹&quot;을 클릭합니다. 자동 이러한 세 질량 스펙트럼에 사용 색을 지정한다. </li><li> 또한,의 명령을 사용하여 해당 색상으로 필드 상태를 정의하는 &quot;이 정의 필드를 기준으로 모든 그룹이 그룹에 대해 정의 된 같은 색을 사용하도록 데이터베이스 항목 &quot;패널. </li><li> 클러스터 분석을 수행합니다. &quot;클러스터링&quot;메뉴의 &quot;클러스터 분석을 계산&quot;명령을 클릭합니다. 비교 설정 1 페이지, &quot;피어슨 상관 관계&quot;를 선택하고 기본값으로 다른 매개 변수를 둡니다. 2 페이지에서 &quot;UPGMA&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;마침&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;통계&quot;메뉴의 MDS를 사용하여 플롯 &quot;다차원 스케일링을 ...&quot;명령을 얻습니다. </li></ol></li><li> 피크 일치 <ol><li> &quot;실험&quot;패널의 스펙트럼 유형 &quot;을 Maldi&quot;을 클릭합니다. 그런 다음 &quot;레이아웃&gt; 이미지보기&quot;를 선택합니다. 스펙트럼 겔 밴드로 표시됩니다. </li><li> &quot;스펙트럼&quot;메뉴에서 &quot;피크 일치를 수행&quot;명령을 사용하여 피크 매칭을 수행합니다. </li></ol></li><li> 피크 클래스 식별 <ol><li> 주성분 분석 (PCA)을 수행. 강조 &quot;MALDI 실험 &quot;실험의 유형&quot; &quot;패널과 사용&quot;PCA를 수행하는 통계 &quot;메뉴&quot;에서 명령 &quot;주 구성 요소 분석을 .... </li><li> 양방향 클러스터링을 수행합니다. &quot;비교&quot;창에서 &quot;통계&gt; 매트릭스 마이닝을 ...&quot;을 클릭합니다. 피크 클래스에 정합 피크의 세기는 서로 다른 색상 (열 맵)를 이용하여 표현된다. </li></ol></li></ol> 사용자 지정 데이터베이스 5. 박테리아 식별 <ol><li> 비슷한 계수 기반 방법 <ol><li> 비교를 만들고 단계 4.3.3에 설명 된대로 &quot;기술 복제&quot;수준의 질량 스펙트럼을 기반으로 Dendrogram이를 생성합니다. 유사성의 비교를 위해 Dendrogram이를 저장합니다. </li><li> &quot;선택 항목을 확인&gt; 분석&quot;알 수없는 질량 스펙트럼을 선택하고을 클릭합니다. 확인 대화 상자가 나타납니다. </li><li> &quot;비교를 기반으로&quot;분류 유형 (또는 저장 classif를 선택IER) 및 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. 다음 페이지에서 참조 비교로 저장 Dendrogram이를 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 식별 방법으로 &quot;기본 유사성&quot;을 선택하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 채점 방법으로 &quot;최대 유사성&quot;을 선택합니다. 각 매개 변수에 대한 적절한 임계 값과 최소값의 차이 값을 입력하고 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 계산이 완료되면, 확인 창이 나타납니다. &quot;결과&quot;패널에서 가장 잘 알 수없는 일치하는 데이터베이스의 구성원이 나열됩니다. </li><li> 식별 프로젝트를 저장하고 &quot;확인 프로젝트&quot;패널에서 &quot;교차 유효성 검사 분석&quot;명령을 사용하여 ID를 확인합니다. </li></ol></li><li> 잠재적 바이오 마커 기반 방법 <ol><li> 피크 클래스를 정의합니다. &quot;매트릭스 광업&quot;창에서 공통적 인 특징을 공유하는 피크 세트를 선택하고 정시 이러한 피크를 정의FIC 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)를 사용하여 &quot;스펙트럼&gt; 피크 클래스 유형을 ... 관리&quot; &quot;비교 창&quot;에서. </li><li> 여기에, 모든 15 균주에 대한 격리 각 특정 피크 클래스를 정의합니다. </li><li> 미지의 질량 스펙트럼을 선택하고, 전술 한 바와 같이 정의 피크 클래스 이러한 스펙트럼의 피크와 일치. </li></ol></li></ol>

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Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

이 데모는 특성화 및 MALDI-TOF MS와 사용자 지정 데이터베이스를 사용하여 세균의 식별의 세부 절차를 보여 주었다. 예를 들어 전통적인 분자 방법과 비교하여, 16S rDNA의 염기 서열, MALDI-TOF MS 기반 지문 방법은 다양한 박테리아의보다 신속한 식별을 용이하게한다. 견고성으로 인해,이 기술은 널리 임상 환경에서 설정 1,14-16에서 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 효모를 특성화하기 위해 사용된다. 또한, MALDI-TOF MS는, 어떤 경우에는, 더 높은 해상도 분류학을 수득 한 것으로보고되었다. 예를 들어, B. 특검팀. A, B, D 및 E는 함께 클러스터링 (도 2) 경향이 있지만, 명확하게 분리시키고, 다른 B. (SP)의 스펙트럼 사이의 유사도. (그림 2) 80 % 미만이었다. 대조적으로, 이들 균주의 16S rDNA 염기 서열은 이들 균주를 구별하기 위해 이용 될 수없는 높은 유사성을 가지고종 수준에서. B. (SP)의 16S rDNA 염기 서열. B 및 D는, 복수의 배향 분석에 기초하여 99 % 유사성을 가지고 B. (SP)의 서열한다. A와 E는 B. (SP)의 순서로 각각 95 %와 96 %의 유사성을 보여준다. B 및 D. 특이점도 관찰되었다. 예를 들어, B. 특검팀. C와 F는 멀리 다른 B. 특검팀에서 그룹화합니다. (그림 2). 특이 균주의 출현은 질량 스펙트럼의 클러스터링 분석이 반드시 계통 관계를 설정하지 않음을 나타냅니다. 분리의 환경은 질량 스펙트럼 클러스터링에 영향을 미칠 수 얻었다. 예를 들어, 브레 비박 테 리움 종 B 촉촉한 스펠 레오 뎀와 B 특검팀에서 분리 하였다 Kocuria 종. 종유석 물방울에서 분리 된 F 함께 (표 1, 그림 2) 클러스터하는 경향이 있지만, 앞으로의 연구는이 ISOL의 큰 컬렉션에서 관찰 여부를 검토 할 필요오버라이드. 이 라이브러리 기반 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 특성은 일반적으로 데이터베이스를 기반으로합니다. 현재 상용 데이터베이스는 주로 박테리아 균주, 특히 병원성들로 구성된다. 이러한 상용 데이터베이스 임상 미생물학 실험실 설정에서 가장 유용합니다. 환경 균주뿐만 아니라 바이러스, 곰팡이와 효모의 특성을 사용자 지정 데이터베이스는 큰 변형 컬렉션을 사용하여 구성해야합니다. 후속 분석에 사용되는 파라미터는, 특히 종 및 균주 수준에서, 분류학 해상도를 증가시키기 위해 최적화 될 필요가있다. 예를 들어, S :이 데모에서 피크 검출을 위해 사용되는 N 값은이 레벨 종의 식별에 적합하지만, 변형 레벨 식별을 위해,이 값을 낮게 할 필요가있다 (10)이었다. 이러한 공정 변수뿐만 아니라 워크 플로우 데이터 처리 때문에 때때로 예, ClinProTools 및 Bionume를 들어, 많은 소프트웨어 패키지 사용자 정의RICS, 파라미터 값과 해당 워크 플로우의 선택의 가능성이 최적화 데이터 분석을 최적화하기 위해 요구 될 것이다. 이 예제에서, 피크 매칭 파라미터들은 임계 값을 식별 프로젝트에 사용하고, 교차 검증이 모두 올바른 식별 율을 개선하기 위해 최적화가 필요했다. 이러한 매개 변수를 최적화하는 방법 및 / 또는 절차를 찾으려면 우리의 실험실에 큰 관심이다. 예를 들어, 하나의 접근 방식은 우리가 MALDI-TOF 데이터 수집 (17)을 최적화하는 자동화 된 최근에 사용 된 통계적 요소 디자인을 포함 할 수있다. 추가 미래의 응용 프로그램 및 MALDI-TOF MS 기반 미생물 지문의 향상은 널리 사용의 건설, 환경 박테리아 및 / 또는 비 세균성 미생물뿐만 아니라 혼합 문화 (18)과 미생물 군집의 특성의 큰 데이터베이스를 포함한다.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or &#8220;fingerprints&#8221; of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge &#8220;fingerprints&#8221;. 
Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1. 
The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS. 
In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&amp;ge; 97%, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Bruker FlexControl software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>version 3.0</td></tr><tr><td>Bruker FlexAnalysis software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>version 3.0</td></tr><tr><td>Bionumerics software</td><td>Applied Maths</td><td></td><td>version 7.1</td></tr></tbody></table>

use of maldi-tof mass spectrometry and a custom database to characterize bacteria indigenous to a unique cave environment (kartchner caverns, az, usa)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

이 데모에 건설 데이터베이스는 &quot;종&quot;, &quot;생물 복제&quot;와 &quot;기술 복제&quot;각각 (그림 1A)을 포함한 &quot;모든 레벨&quot;최고에서 최저 수준을 4 단계를했다. &quot;기술 복제&quot;수준의 기술 복제물의 모든 전처리 스펙트럼을 포함. &quot;생물 복제&quot;와 &quot;종&quot;레벨은 복합 (요약) 스펙트럼을 포함. &quot;모든 레벨&quot;모든 기술적 복제 스펙트럼뿐만 아니라 모든 복합 스펙트럼을 포함. 스펙트럼 요약 절차 대표 피크를 사용하여도 1에 나타내었다. 각 구성원 질량 스펙트럼은 얇은 회색 선으로 나타납니다. 복합 스펙트럼은 빨간색으로 색 선으로 표시됩니다. 인접 피크를 쉽게 육안 검사 (그림 1B)를 허용하는 다른 색으로 표시됩니다. 표 1에 나타낸다. 높은 재현성 바실러스 종 B 대 98.0 ± 1.4이고, 최저 재현성 Curvibacter 종 (표 1)에 대해 89.4 ± 7.8이었다. 복합 질량 스펙트럼 데이터의 계층 구조의 생물학적 복제 수준에서 용이하게 시각화 클러스터 분석. 도 2에 도시 된 바와 같이, 생물학적 모여 회 반복하고, 15 종의 세균은 15 클러스터 형성. 밀접하게 관련 종, 예를 들어, B. 특검팀. A, B, D 및 E는 함께 클러스터링하는 경향이 있었다. 그러나, 아웃 라이어, 예를 들어, B. 특검팀. C와 F는,도 관찰되었다. &quot;기술과 생물&quot;수준에서 질량 스펙트럼에 따라 MDS 플롯은 그림 3. MDS의 페이지에 표시됩니다많은 이들 박테리아의 스펙트럼 사이의 유사성에 대한 명확한, 3-D 시각화를 얻었다. 두 기술 복제하고 생물학적 복제물 유사한 그룹핑 (도 3 및 B)를 나타냈다. 피크 매칭은 질량 스펙트럼에서 피크의 세트를 구별하는 데 사용 하였다. 상수 공차 (X 축상의 점), 선형 공차 (PPM) 및 피크 검출 피크를 포함 레이트 매칭 파라미터는 사용자에 의해 지정 될 필요가있다. m / z × 위치 공차 = 상수 + 공차 선형 공차 : 상수 공차 및 공차 선형 방정식을 사용하여 피크 위치 오차를 계산하는 데 사용되는 요소이다. 증가 m / z으로 일정한 오차의 중요성은 감소한다. 피크 검출 속도는 피크의 스펙트럼 규정 속도 이상에 대한 그 위치에서 발견되는 경우에만, 피크 클래스 제조되는 것을 의미한다. 하나 이상의 패턴에 피크 피크 클래스를 나타냅니다. 예를 들어, 피크 검출 율 등식스펙트럼의 10 % 이상이 피크 위치에있을 경우 10 % (LS), 최고 클래스 만 이루어질 수있다. 이 기술 반복 실험과 일련의 낮은 유병률 피크 (일반적으로 소음 피크)를 제외한다. 세트가 생물학적 복제물의 복합 스펙트럼을 기반으로하는 경우 낮은 유병률 피크 이미 복합 스펙트럼의 작성 중에 필터링 된 바와 같이,이 숫자는 낮은해야 할 수도 있습니다. 이 예제에서, 피크 매칭 &quot;기술 복제&quot;레벨에서 질량 스펙트럼을 사용하여 수행하고, 이러한 파라미터의 값은 각각 1.9, 550, 10 %이었다. 선택된 파라미터에 기초하여, 피크는 다른 피크 군의 결과와 일치하거나 일치하지 않는 것으로 간주 하였다. 피크 매칭 결과의 일례는 단일의 분리에 30 회 반복 (바실러스 종)를 사용하여도 4에 도시된다. 매칭 결과를 원료로서 색상 강도가 존재하는 테이블로 시각화 하였다. 파란색은 낮은 강도를 나타내는 빨간색은 높은 I을 나타냅니다ntensity. 피크 매칭 결과에 기초하여, 사용자는 후속 분석을 용이하게 피크 클래스를 정의 할 수있다. 두 주성분 분석 (PCA) (보충도 1)과 양방향 클러스터링 복합 피크 클래스를 분석하는데 사용될 수있다. &quot;기술 복제&quot;수준의 질량 스펙트럼을 사용하는 대표적인 양방향 클러스터링 결과는 그림 5에 나타나있다. 두 계통도가 표시됩니다. 하나는 m / z 값 옆이며 다른 박테리아 엔트리 상기 (도 5)이다. 피크 강도는 녹색은 낮은 강도를 나타냅니다과 빨간색 높은 강도를 표시하는 색으로 표시했다. 예를 들어, B. 특검팀. A와 F는 B. 특검팀과 거의 피크 클래스를 공유 할 수 있습니다. B와 D (그림 5). 닫기 검사 B. 특검팀 것으로 나타났다. B와 D는 종 특이 피크 클래스 (그림 5)의 세트가있다. 이러한 결과는 특정 피크 인증서 세트를 공유하는 것을 나타낸다<html> 아인 특성 종 수준 잠재적 바이오 마커로 정의 할 수있다. 예를 들어, 피크 열세 세트 B. SP에 속하는. D는 선택 B. 특검팀의 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)로 정의 하였다. (표 2), 3420.8, 2894.9, 2152.5 4302.0, 4339.9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1 및 7849.1를 포함하여 D,. 다른 균주의 피크 클래스는 서로 다른 색상 (보충 그림 2)에 표시 할 수 있습니다. 각 특정 피크 클래스 표 2에 도표화 하였다 격리. 정의 피크 클래스가 상기 수동들은 또한 100 AU의 최소 강도로 모든 기술적 복제판 등장하도록 체크하고, 피크 클래스의 부분 집합은 또한 박테리아의 특성을 용이하게하도록 저장 될 수도 종 및 / 또는 균주 수준에서, 예를 들면, 비 - 병원성 균주의 병원성 균주 구별 및 / 또는 항생제 내성 / 민감도를 조사. 식별과 관련하여 이비인후과 &quot;&gt; 블라인드 부호화 균주의 질량 스펙트럼을 수집하여 데이터베이스에 레퍼런스 질량 스펙트럼과 동일한 방법으로 전처리 하였다. 유사도 계수들의 비교에 기초하여 인증을 행하기 위해서는, 파라미터 값을 최대 유사도 포함한 지정된 최소 유사성이 지정되지 95.0 %와 87 %에서의 평균 유사성에서. (즉, 체크되지 않은 왼쪽). 최소 차이 값은 최대 유사도와의 평균 유사성 모두 5로 설정 하였다.이 값은 더 증가하기 위해 최적화 될 필요가있다 올바른 식별 속도. 그림 6은 유사성 계수 (그림 6)의 비교에 기초하여 식별 결과를 보여줍니다. 일치하는 결과는 블라인드 코드 박테리아는 대부분 B. 특검팀 것을 제안했다. A.이 식별 프로젝트의 비교를 기반으로 유사성 계수는 더 교차 유효성 검사 (보충 그림 3에 의해 검증되었다 </stroNG&gt;). 교차 검증은 25 % 범위에서 테스트되었습니다. 높은 커버리지를 사용하여, 예를 들면, 50 % 또는 100 %, 식별 신뢰도를 증가 시키지만, 특히 대규모 데이터베이스의 경우, 완료하기 위해 훨씬 더 긴 시간이 걸릴 수있다. 모든 테스트 클래스는 100 % 사실 긍정과 0 %가 음성 (false negative) (보충 그림 3)이있다. 흥미롭게도, 피크 클래스 비교에 기초하여 식별 프로젝트 교차 검증은 유사도 계수의 비교에 기초하여보다 훨씬 빠르다. 식별은 피크 수준의 매칭 (보충 그림 4)를 기반으로 완료 할 수 있습니다. 피크의 불일치는 (보충 그림 4) 관찰되었다 그러나. 불일치는 각각의 단백질의 아미노산 교환으로 인한 질량 변화에 기인 할 수있다. 하지 일치되는 피크는 종 수준에서의 차별은 아니지만이 변형 특정 또는 분리 피크 수 있습니다. 오, 함께 촬영유사성 계수와 바이오 마커 기반 - - 쉽게 카르스트 샘플 준비를 사용하여 환경, 스펙트럼 획득의 종 수준에서 박테리아를 식별 할 수 있으며, 데이터 분석 워크 플로우 여기에 설명 UR 결과는 모두 식별 방법을하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52064/52064fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1. 데이터베이스 구조 및 질량 스펙트럼의 요약이 데모 (A)으로 구성 데이터베이스의 구조.; Aminobacter 종 (B) 10 기술 반복 실험에서 피크를 사용 피크 요약의 그림입니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52064/52064fig2highres.jpg" width="600" /> 복합 그림 2. Dendrogram이생물학적 복제 수준의 질량 스펙트럼은. 데이터 세트는 각 종족에 대한 세 가지 복합 스펙트럼을 가진 15 종의 스펙트럼을 포함하고 있습니다. 각 종 색상으로 구분되었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52064/52064fig3highres.jpg" width="500" /> 다차원 스케일링 (MDS) (30), 각 종의 스펙트럼 (A)와 각 종 세 복합 스펙트럼 (B)로 생물학적 복제 수준과 기술적 복제 수준에서 질량 스펙트럼 표현이. 색상은 동일한 색상으로 코딩되었다 3.도 도 2에서 사용. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52064/52064fig4highres.jpg" width="700" /> 그림 4. 피크 매칭 테이블의 그림. 표는 기술 복제 LEVE에서 바실러스 종의 질량 스펙트럼을 기반으로 생성 된리터. 피크 일치하는 매개 변수의 값은 각각 선형 공차 일정한 허용 오차 1.9, 550 및 피크 검출 율 10 %였다. 블루 낮은 피크 강도를 나타내는 빨간색은 높은 피크 강도를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/52064/52064fig4highres.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52064/52064fig5highres.jpg" width="700" /> 그림 5. 양방향 클러스터링의 그림입니다. 그림은 기술 복제 수준에서 질량 스펙트럼을 사용하여 생성되었습니다. 그림 2에서 사용 된 균주의 색상이 동일한 색상으로 코딩 하였다. 피크 강도 색, 녹색의 의미 낮은 강도와 빨간색 의미 높은 강도로 표현된다. <a href="/files/ftp_upload/52064/52064fig5highres.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 사용자 데이터베이스를 사용하여 유사도 계수의 비교에 기초하여도 6 박테리아 식별. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 아이디 </td><td> 출처 </td><td> 가장 가까운 상대 B / 왕국 문 / 클래스 </td><td> 수탁 번호 (가장 가까운 상대 B) </td><td> %의 유사성 </td><td> BioNumerics 키 </td><td> 재현성 (%) </td></tr><tr><td> D2 </td><td> 드라이 스펠 레오 뎀 </td><td> 바실러스 SP. E-257 / 후벽 균 </td><td> FJ764776.1 </td><td> 98.8 </td><td> 바실러스 종 </td><td> 94.9 ± 4.0 </td></tr><tr><td> D7 </td><td> 드라이 speleot밑단 </td><td> 바실러스 SP. GGC-P3 / 후벽 균 </td><td> FJ348039.1 </td><td> 99.0 </td><td> 바실러스 종 B </td><td> 98.0 ± 1.4 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 흐름 돌 </td><td> 바실러스 니아신은 M27 / 후벽 균을 변형 </td><td> KC315764.1 </td><td> 99.2 </td><td> 바실러스 종 C </td><td> 96.5 ± 2.4 </td></tr><tr><td> F4 </td><td> 흐름 돌 </td><td> 바실러스 SP. GGC-P5A1 / 후벽 균 </td><td> FJ348046.1 </td><td> 99.1 </td><td> 바실러스 종 D </td><td> 89.8 ± 8.8 </td></tr><tr><td> F9 </td><td> 흐름 돌 </td><td> 바실러스 SP. OSS 19 / 후벽 균 </td><td> EU124558.1 </td><td> 99.4 </td><td> 바실러스 종 E </td><td> 96.5 ± 1.9 </td></tr><tr><td> R10 </td><td> 종유석 드립 </td><td> 바실러스 SP. K1 / 후벽 균 </td><td> GU968734.1 </td&gt; <td> 99.8 </td><td> 바실러스 종 F </td><td> 95.4 ± 3.9 </td></tr><tr><td> D11 </td><td> 드라이 스펠 레오 뎀 </td><td> Brevibacillus 브레비스 변형 IMAU80218 / 후벽 균 </td><td> GU125635.1 </td><td> 99.5 </td><td> Brevibacillus 종 </td><td> 94.3 ± 5.8 </td></tr><tr><td> F14 </td><td> 흐름 돌 </td><td> Exiguobacterium SP. ZWU0009 / 후벽 균 </td><td> JX292087.1 </td><td> 99.3 </td><td> Exiguobacterium 종 </td><td> 96.5 ± 2.5 </td></tr><tr><td> M7 </td><td> 촉촉한 스펠 레오 뎀 </td><td> 브레 비박 테 리움 SP. N78 / 방선균 </td><td> HQ188605 </td><td> 97.6 </td><td> 브레 비박 테 리움 종 </td><td> 97.5 ± 2.0 </td></tr><tr><td> M14 </td><td> 촉촉한 스펠 레오 뎀 </td><td> Kocuria rhizophila 변형 Ag09 / 방선균 </td><td> EU554435.1 </td><td> (100) </td><td>Kocuria 종 </td><td> 95.2 ± 4.1 </td></tr><tr><td> M15 </td><td> 촉촉한 스펠 레오 뎀 </td><td> 브레 비박 테 리움 SP. MN3-3 / 방선균 </td><td> JQ396535.1 </td><td> 99.5 </td><td> 브레 비박 테 리움 종 B </td><td> 92.1 ± 4.9 </td></tr><tr><td> R4 </td><td> 종유석 드립 </td><td> Aminobacter 특검팀. KC-EP-S4 / α-프로 테오 박테리아 </td><td> FJ711220.1 </td><td> 99.9 </td><td> 종 Aminobacter </td><td> 95.4 ± 2.7 </td></tr><tr><td> F5 </td><td> 흐름 돌 </td><td> Comamonas testosteroni 변형 NBRC 12,047 / β-프로 테오 박테리아 </td><td> AB680219 </td><td> (100) </td><td> Comamonas 종 </td><td> 96.4 ± 2.6 </td></tr><tr><td> R8 </td><td> 종유석 드립 </td><td> Curvibacter 섬세 / β-프로 테오 박테리아 </td><td> AB680705 </td><td> 97.0 </td><td> Curvibacter &lt;/ EM&gt; 종 </td><td> 89.4 ± 7.8 </td></tr><tr><td> F8 </td><td> 흐름 돌 </td><td> 모락 SP. 19.2 KSS / γ-프로 테오 박테리아 </td><td> HE575924.1 </td><td> 99.9 </td><td> 모락 종 </td><td> 92.6 ± 4.9 </td></tr></tbody></table> 박테리아는 Kartchner 동굴, AZ, 미국에서 분리 및 16S rDNA의 염기 서열을 이용하여 확인 하였다. 두 프라이머 27F (5 &#39;AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3&#39;) 및 1492r (5 &#39;TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3&#39;), 약 1400 bp의 길이의 16S rRNA 유전자 서열을 얻기 위해 사용 하였다. B NCBI 데이터베이스의 BLAST 검색을 기준으로합니다. C보고 된 값은 하나의 표준 편차 ± 30 회 반복 (세 생물학적 복제합니다 (10) 기술 복제물 각)의 평균 상관 계수이다. 표 1. 박테리아는 데모에 사용 된 균주. <pFO : 페이지 나누기-전에 = &quot;항상&quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> BioNumerics 키 </td><td> 피크 클래스 / 잠재적 인 바이오 마커 (다) </td></tr><tr><td> 바실러스 종 </td><td> 2152.5, 2224.9, 2595.8, 2894.9, 2921.3, 3380.5, 3496.3, 3515.0, 3733.5, 4302.0, 4340.0, 4385.8,4763.9, 4910.6, 5189.4, 5227.0, 5634.6, 5769.6, 5892.8, 6301.4, 6756.2, 6789.4, 6990.3, 7029.5, 7466.3 </td></tr><tr><td> 바실러스 종 B </td><td> 2152.5, 2941.2, 3196.9, 3262.7, 3352.9, 3420.8, 3733.5, 3925.2, 4302.0,4339.9, 4629.2, 4713.4, 4859.3, 4900.6, 5189.4, 5227.0, 5541.8, 5878.7, 6388.8, 6524.0, 6704.5, 6838.8, 7142.7, 7317.5, 7466.3, 7849.1, 9263.9, 9721.2 </td></tr><tr><td> 바실러스 종 C </td><td> 2588.0, 3361.8, 4330.4, 5173.0, 5847.6, 6332.0, 6524.0, 6720.3 </td></tr><tr><td> 바실러스 종 D </td><td> 2152.5, 2894.9, 3420.8, 4302.0, 4339.(9), 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, 7849.1 </td></tr><tr><td> 바실러스 종 E </td><td> 2152.5, 2224.9, 2941.2, 3180.1, 3380.5, 4302.0, 4339.9, 4705.3, 5878.7, 6356.6, 6735.1, 6756.2 </td></tr><tr><td> 바실러스 종 F </td><td> 3308.6, 3367.8, 3567.5, 4279.7, 4489.2, 4629.2, 4727.9, 4751.7, 5067.7, 6614.7, 6919.7, 7130.9 </td></tr><tr><td> Brevibacillus 종 </td><td> 2133.3, 2611.0, 4263.3, 4302.0, 4859.3, 4900.6, 5080.2, 5219.0, 5847.6, 6775.7, 7529.4, 9721.2 </td></tr><tr><td> Exiguobacterium 종 </td><td> 2588.0, 3053.3, 3420.8, 3695.5, 4263.3, 5133.1, 5173.0, 5248.8, 6104.8, 6605.3, 6804.4, 6838.8, 7390.2 </td></tr><tr><td> 브레 비박 테 리움 종 </td><td> 3053.3, 6104.8, 6146.5 </td></tr><tr><td> Kocuria 종 </td><td> 3080.0, 4366.6, 5080.2, 5163.8, 5207.1, 5892.8, 6160.0, 6197.5, 6445.0, 7433.7 </td></tr><tr><td>브레 비박 테 리움 종 B </td><td> 3222.8, 3330.4, 3367.8, 4330.4, 4350.4, 4795.3, 4995.7, 5731.6, 6445.0, 6735.1,7487.3 </td></tr><tr><td> 종 Aminobacter </td><td> 2133.3, 2562.4, 3361.8, 3410.4, 4289.2, 4629.2, 4662.0, 4869.8, 6064.1, 6221.0, 6720.3, 6789.4,6818.8, 7216.1, 7447.4 </td></tr><tr><td> Comamonas 종 </td><td> 2806.0, 2921.4, 3246.5, 4350.4, 4727.9, 5607.5, 5666.3, 6221.0, 6488.3,​​ 7317.5, 9362.6 </td></tr><tr><td> Curvibacter 종 </td><td> 2868.6, 3453.2, 4319.8, 5133.1, 6292.4, 6903.4, 7433.7 </td></tr><tr><td> 모락 종 </td><td> 3011.2, 5698.0, 6720.3, 7064.8, 7366.6 </td></tr></tbody></table> 각 종족에 대한 정의 표 2. 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커) (다). 보충도 1 번째에서 질량 스펙트럼들의 주성분 분석 (PCA)도 2에 사용 된 예를 기술 복제 레벨 (A)와 피크 클래스 (B)는. 색상은 동일한 색상으로 코딩되었다. 보충 그림 2. 양방향 클러스터링을 기반으로 선택한 피크 클래스의 그림입니다. 동일한 레이블을 갖는 피크 클래스는 같은 색으로 착색된다. 보충 그림 BioNumerics에서 사용자 정의 데이터베이스를 기반으로 식별 프로젝트 3. 교차 검증 결과. 사용자 지정 데이터베이스를 사용 피크 일치에 따른 보충 그림 4. 박테리아 식별.

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Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

13.9K 조회수.  Arizona State University. This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented. 

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Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. Allelic isoforms of the detectable biomarker ions result in isolate-specific mass shifts. Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) is a novel technique that combines the mass spectrometric detectable biomarker masses in a scheme that allows deduction of phyloproteomic relations from isolate specific mass shifts compared to a genome sequenced reference strain. The deduced amino acid sequences are then used to calculate MSPP-based dendrograms.
Here we describe the workflow of MSPP by typing a Campylobacter jejuni ssp. doylei isolate collection of seven strains. All seven strains were of human origin and multilocus sequence typing (MLST) demonstrated their genetic diversity. MSPP-typing resulted in seven different MSPP sequence types, sufficiently reflecting their phylogenetic relations.
The C. jejuni ssp. doylei MSPP scheme includes 14 different biomarker ions, mostly ribosomal proteins in the mass range of 2 to 11 kDa. MSPP can in principle, be adapted to other mass spectrometric platforms with an extended mass range. Therefore, this technique has the potential to become a useful tool for strain level microbial typing.

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) was used to type a collection of Campylobacter jejuni ssp. doylei isolates at the strain level in comparison to multilocus sequence typing (MLST).

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

연구

유전학

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

생물학

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

환경과학

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

생화학

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

면역학 및 감염병학

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

화학

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

마우스의 결막 장금 격리 및 식별

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

MALDI-TOF Mass Spectrometry

Mass spectrometry is a powerful characterization technique that can identify and separate a wide variety of compounds ranging from chemical to biological entities, based on their mass-to-charge ratio (m/z). The instruments that allow this detection, known as mass spectrometers, have three components: an ion source, a mass analyzer, and a detector. These spectrometers differ based on the nature of their ion source and analyzers.
Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) is a commonly used mass spectrometer. It enables the soft ionization of biological molecules like peptides, lipids, and saccharides without fragmenting them. This means they can be analyzed intact as the sample integrity is maintained.
In MALDI, the sample is mixed with a compatible matrix that is organic molecules. When the laser strikes the sample, the matrix functions as a mediator for energy absorption, yielding the intact sample analyte ions. The matrix molecules energetically ablate from the sample surface, absorb the laser energy and carry the sample molecules into the gas phase. The sample molecules are usually ionized during the ablation process to carry a single positive charge.
The desorbed sample ions carrying the charge are then directed towards the mass analyzer, usually a time-of-flight (TOF). The ions pass through a field-free drift region which allows separation based on size, allowing the smaller ions to reach the detector first.
MALDI-TOF instruments are often connected with a reflectron that reflects ions increasing the ion flight path. This increased flight time between ions of different m/z allows better sample resolution where ions of the same mass reach the detector simultaneously. MALDI sources can be coupled with other analyzers, including triple quadrupoles and Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers. The MALDI-FT-ICR is known for its high mass resolution, wherein the sample ions carrying the charge move to an ICR cell and cyclotron in a magnetic field while separating on m/z.
With a couple of limitations, like, the possibility of photodegradation by the laser for some sample types, absorption of the laser by a few fluorescent analytes that could affect the results, an acidic matrix that could alter sample nature, etc., overall, this technique has vast applications.&#160; It can analyze protein samples isolated by electrophoresis or chromatography, peptides, carbohydrates, DNA, identify microorganisms from clinical samples and ascertain biomolecules in tissues, among many others.

MALDI-TOF 질량분석기

Mass spectrometry is a powerful characterization technique that can identify and separate a wide variety of compounds ranging from chemical to biological ...