The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. 시약 준비 <ol><li> SDS-추출 용액을 제조 하였다 : 0.1 M 트리스 -HCl pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 10 mM의 EDTA, 1 % SDS를. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔에 필요한 재고 시약을 준비합니다. <ol><li> 1.5 M 트리스 - HCL pH가 8.8를 준비합니다. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터. </li><li> 0.5 M 트리스 - HCL pH가 6.8. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터. </li><li> 10 % SDS를 준비합니다. 필터를 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 저장소. </li></ol></li><li> 에 - 겔 트립신 소화 및 펩타이드 추출에 필요한 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 100 mM의 중탄산 암모늄을 준비합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독. </li><li> 1 M DTT의 주식을 준비합니다. -80 ° C에서 100 mM의 중탄산 암모늄 및 저장 중에 현탁. </li><li> 550 mM의 요오도 아세트 아미드 주식을 준비합니다. 현탁100 mM의 -80 ° C에서 중탄산 암모늄 및 저장. </li><li> 100 NG를 준비 / 트립신 주식 μL. -80 ° C에서 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 60 μL 나누어지는 및 저장. </li><li> 포름산 1 %, 2 % 아세토 니트릴 : 추출 용액을 제조 하였다. </li><li> 5 % 아세토 니트릴 0.1 % 포름산 : 부유 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li></ol> 2. RNA 안정화 솔루션에 보존 세포와 카트리지 필터 유닛에 세포 용해를 수행 <ol><li> 카트리지 필터 부 (1.5 ㎖)로부터 필터의 루어 록 끝에 연결된 60 mL를 주사기를 사용하여 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 RNA 안정화 용액 추방. </li><li> 모든 세포 파편을 펠렛 17,000 XG에서 10 분 동안 2 ml의 microcentrifuge 관을 원심 분리기. 단계 2.3에서 필터를 막히게하지 않도록이 행해진 다. </li><li> 동결 / 그쪽에서 용해 한 세포에서 발생하는 모든 단백질을 캡처하는 10 K ultracentrifugal 필터 유닛에 뜨는 전송샘플 w. 펠렛을 버리지 마십시오. 그것은 단계 2.5에서 사용됩니다. 30 분 동안이나 볼륨까지 3,270 XG에서 ultracentrifugal 필터 유닛의 원심 분리를 수행은 약 600 μL로 감소했다. </li><li> P10 팁의 선단을 녹여 팁의 개방 단부와 카트리지 필터 유닛의 비 루어 록 사이드 블록. 이것은 더 추출 버퍼와 바이오 매스 단계 2.5-2.7 동안 탈출 없는지 확인합니다. </li><li> 1ml의 SDS-추출 용액에 펠릿을 중단하고 원래의 카트리지 필터 유닛으로 피펫. 카트리지 필터 유닛에 피펫하는 가장 쉬운 방법은 P1000 팁에 P200 팁을 스택과 피펫이 더블 팁을 사용하는 것입니다. </li><li> 총 부피는 약 2 mL로하므로 카트리지 필터 유닛 SDS 추출 용액 1 ㎖를 첨가하고 혼성화 오븐에서 회전하면서 실온에서 10 분 동안 배양한다. 3 구겨진 연구소는 50 ML 원뿔 튜브의 바닥에 쳐 놓습니다. 폐쇄 카트리지 필터 부의 양단을 파라 필름및 50 ㎖ 튜브에 카트리지 필터 유닛을 넣어. 뚜껑을 닫고 하이브리드 오븐에 튜브를 넣어. </li><li> 10 분 놓은 후 Sterivex는 거품 플로터에 필터와 루어 잠금 끝에 5 ML의 주사기와 장소에 고정합니다. 플로트와 15 분 동안 95 ° C의 물을 욕조에 품어. </li><li> 시원한 카트리지 필터 장치를하자 (단계 2.6에서와 같이)을 실온에서 1 시간 동안 회전한다. </li><li> (단계 230) 이전과 동일 ultracentrifugal 필터 부에 60 ml의 시린지 필터에서 SDS 추출 용액 / 세포 용 해물을 추방. 카트리지 필터 부에 신선한 SDS 추출 용액 1 ㎖를 첨가하고 손으로 30 초 동안 혼합 한 후 60 mL의 주사기를 사용 ultracentrifugal 필터 유닛으로 추방. 이것은 모든 단백질이 제거되었는지 확인하기 위해 카트리지 필터 장치를 세척 할 것이다. </li><li> 3,270 XG 또는 필터 장치에 볼륨까지 45 분 동안 ultracentrifugal 필터 부에서 원심 분리를 수행하여 600 미만이다 μL. </li><li> 폐기 흐름을 통해 신선한 SDS-추출 용액 상단까지 ultracentrifugal 필터 장치를. </li><li> 3,270 X g에서 45 분 동안 다른 필터 유닛을 원심 분리기. </li><li> 반복 두 번 더 2.11 및 2.12 단계를 반복합니다. ultracentrifugal 필터 부에서 최종 용적을 확보하는 것은 최종 스핀의 단부에서 최대 600 μL이다. </li><li> 이 시점에서, 두 가지에 집중을 분할. 한 분획은 DNA 침전에 사용 된 단백질 침전 다른 것이다. 주 : 분별 량을 여과 바이오 매스의 양 및 제품의 의도 된 용도에 의존한다. 우리의 경우는 DNA 침전을 향해 10 % 단백질 침전을 향해 90 %로 농축 물을 분할. </li></ol> 3. 단백질 침전 <ol><li> 10 초 동안 집중 소용돌이의 하나의 볼륨에 아세톤 (50 : 50) : 4 볼륨 메탄올을 추가합니다. -20 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 30 분 동안 17,000 XG에 스핀 다운. 뜨는을 가만히 따르다펠릿은 1 시간 (또는 건조까지)의를 Speed​​vac에서 건조 (눈에 보이지 않는 수 있음) 할 수 있습니다. 참고 : 위에 펠렛을 건조하지 마십시오이 재현 탁하는 것을 어렵게 만들 수 있기 때문이다. </li><li> SDS-추출 용액 25 μL에 펠렛을 중지. 다음로 pipetting 아래로 재현 탁 한 시간 동안 앉아 보자. </li><li> 단백질 분석 키트 및 제조 업체의 지침을 사용하여 단백질을 정량화. </li></ol> 4. DNA 강수량 <ol><li> 농축 분획을 SDS-추출 용액을 추가 500 μL 마크까지 DNA 침전에 사용한다. 이 단계는, 용액의 부피를 증가 쉽게 작동 할 수있게하는 것입니다. </li><li> 10 초 동안 소용돌이 (예 : MPC 단백질 침전 시약) 단백질 침전 시약의 0.583 볼륨을 추가합니다. 당신은 흰색 침전물 양식을 볼 수 있습니다. 참고 : 또한 사용한 페놀 : 클로로포름 추출 DNA 방법이지만 인해 낮은 볼륨에 더욱 곤란하다. 우리는을 사용하여 더 나은 DNA 수율을 얻을MPC 단백질 침전 시약. </li><li> 17,000 XG에 원심 분리기 10 분 동안 4 ℃. </li><li> 또 다른 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 이소프로판올 0.95 볼륨을 추가합니다. 30 ~ 40 회 전환. </li><li> 최대 속도로 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 상층 액을 버린다. </li><li> 70 % 에탄올 750 μL로 두 번 씻어. </li><li> 많은 에탄올을 피펫으로 가능한 한 제거하고 자연 건조 할 수 있습니다. 참고 : 위에 DNA를 건조하지 마십시오이 재현 탁하는 것을 어렵게 만들 수 있기 때문이다. </li><li> 낮은 TE 완충액, pH가 8 (10 mM의 트리스 -HCl, 0.1 mM의 EDTA) 25 μL에 재현 탁. </li><li> dsDNA 분석 키트 제조 업체의 지침을 사용하여 DNA를 정량화. 품질을 확인하기 위해 DNA의 3 μL에 아가 로스 젤 (1 %) 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 5. 단백질의 SDS-PAGE 젤 <ol><li> 샘플 버퍼를 준비합니다 (950 μL 램 믈리 샘플 버퍼 50 μL의 β-머 캅토 에탄올). &lt;/ 리&gt; <li> 단백질 15 μg의에 해당하는 볼륨 또는 샘플 버퍼의 동일한 볼륨에 20 μL의 최대를 추가하고 4 분 동안 끓인다. SDS-PAGE를 수행 할 수있을 때까지 샘플은 현재 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 5 % 아크릴 아미드 스태킹 젤 10 % 아크릴 아미드 해결 젤을 준비합니다. </li><li> 샘플 및 단백질 사다리의 4 μL와 젤을로드합니다. 250 kDa의 사다리 마커 때까지 일정하게 120 V에서 젤을 실행하여 바로 해결 젤에 도달했습니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 염색 계를 사용하여 쿠마시 염색 겔. </li></ol> 6.에서 젤 트립신 다이제스트 및 펩타이드 추출 주 : 6.10까지 여기의 모든 단계는 오염을 최소화하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. <ol><li> 각 레인의 10 kDa의 사다리 마크에서 과잉 젤을 잘라. 각 레인 별도로 MS / MS로 분석한다. 표면적을 증가 1mm X 1mm 사각형으로 각 레인을 절감하고 모든 SQUA를 배치낮은 결합 마이크로 원심 분리기 튜브에 차선에서 입술. 모든 차선에 대해이 작업을 반복합니다. (1 % 아세트산을 건조 및 절단 곤란 해지는 겔을 방지하는데 사용될 수있다). 주 : 오염을 최소화하는 것이이 단계에서 매우 중요하므로 겔은 겔 슬라이스를 만드는 데 사용 된 유리 SDS-PAGE 겔에 몰드 생물학적 안전 캐비넷에서 수행된다. </li><li> 드 얼룩 <ol><li> 각 로​​우 결합 튜브, 개폐 덮개에 100mM의 중탄산 암모늄의 50 μL 분주하고 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 50 μl를 분배하고 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 기음과 150 μl를 폐기합니다. </li><li> 반복 6.2.1와 6.2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 기음과 95 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 50 μL 아세토 니트릴, 가까운 뚜껑을 분배하고 5 분을 기다립니다. 기음과 45 μl를 폐기하고 10 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 축소 <ol><li> 100 MM의 암모니아 희석 50 μL DTT (10 mM의를 분배오 수소 나트륨), 가까운 모자 및 37 ℃에서 30 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 알킬화 <ol><li> (100 mM의 중탄산 암모늄에 희석 55 밀리미터) 50 μL의 요오도 아세트 아미드, 가까운 뚜껑을 분배하고 37 ℃에서 20 분을 기다립니다. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 100 μl를 분배하고, 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 기음과 195 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 빨래 <ol><li> 50 μL 중탄산 암모늄, 가까운 뚜껑을 분배하고 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 50 μl를 분배하고 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 기음과 120 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 50 μL 아세토 니트릴, 가까운 뚜껑을 분배하고 5 분을 기다립니다. 기음과 45 μl를 폐기합니다. </li><li> 아세토 니트릴 50 μl를 분배, 5 분을 기다립니다. </li><li> 기음과 75 μl를 폐기하고 5 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 소화 <ol><li> 25 ~ 30 μL NG (6)를 분배 / 유 (트립신을 μLntil 모든 젤 조각)이 적용됩니다. 닫기 모자와 실온에서 30 분을 기다립니다. </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 (4.5 시간 최소) 품어. </li><li> 실온에서 30 분 동안 앉아 보자. </li></ol></li><li> 추출 및 펩타이드 전송 <ol><li> 추출 용액 30 μl를 분배하고 얼음에 30 분 동안 뚜껑 커버. </li><li> 기음 30 μL와 새로운 레이블 낮은 결합 관에 흡입 된 볼륨을 분배. </li><li> 추출 용액 12 μL와 (젤) 원래 튜브에 아세토 니트릴 12 μl를 분배. 닫기 모자와 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> 새로운 튜브에 대기음 15 μL 및 예금. </li><li> 단계를 반복합니다 (6.9.3과 6.9.4). </li></ol></li><li> 건조까지를 Speed​​vac 새로운 튜브를 놓습니다. </li><li> 부유 용액 50 μL에 재현 탁. 10 분 동안 중간에 소용돌이는 재현 탁합니다. </li><li> 나노 / LC에 적합한 나노 / LC 바이알 또는 96 웰 플레이트 중 하나에 피펫 펩타이드 솔루션MS / MS 작동합니다. </li></ol>

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K., Martinez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+chemolithoautotrophy+among+ubiquitous+bacteria+lineages+in+the+dark+ocean.">Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean.</a> Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).</li><li>Rinke, C., Schwientek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+microbial+proteome+preservation+techniques+applicable+to+autonomous+environmental+sample+collection.">Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection.</a> Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li><li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis.">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).</li><li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

샘플 보존 metaproteomic 연구에 중요하다 이전 작업은 RNA 안정화 용액 전에 단백질 추출 (28)에 셀을 저장하는 저장 버퍼 유용한 것으로 입증 하였다. 이상적으로, 샘플은 33, 34를 처리하는 동안 단백질 발현의 변화를 부정하는 현장에 보존 될 것이다. 사실, 시츄 샘플링 및 고정 기술은 선박 배치 인스트루먼트 자율 수집 및 샘플의 보존을 허용하는 개발되었다. 그러나, ?...

미생물은 유비쿼터스하고 지구의 생물 지구 화학 사이클 1에 필수적인 역할을한다. 현재, 미생물 군집의 구조와 기능을 특성화 할 수 많은 분자 접근 방법이있다. 4 - 일반적인 16S rRNA 유전자 분석 환경 (2)로부터 DNA가 PCR 증폭 된 서열이다. 16S rRNA 유전자 분석의 단점은 대사 기능 만에 거의 정보, 계통 신원 및 커뮤니티 구조에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 메타 지노믹스, metatranscriptomics 및 metaproteomics은 사회 구조와 대사에 대한 정보를 제공하기 때문에 대조적으로, 이러한 접근한다. 8 - 메타 지노믹스, 또는 생물의 유전자 군집의 함유량의 분석은, 커뮤니티 5의 구조 및 기능적 가능성에 대한 정보를 제공한다. 강력한 있지만,이 기능은 대사 전위에 대응하지 않을 수도생물의 활동. 유기체의 유전자형은 RNA로 전사 또한 표현형의 결과, 단백질로 번역 될 수있는 각각의 유전자에 의해 표현된다. 따라서, 환경에서 미생물 활성 작용의 이해를 돕기 위해, 포스트 게놈 분석 9를 수행한다. 그것은 주어진 환경에서 전사되는 유전자 밝혀 때문에 Metatranscriptomics, 또는 RNA 전 사체의 분석에 유용합니다. 그러나 mRNA 수준은 항상 인해 병진 규제 RNA 반감기, 다중 단백질의 mRNA는 모든 사본 (10)에 대해 생성 될 수 있다는 사실에 해당 단백질 수준과 일치하지 않는다. 이러한 이유 metaproteomics 지금 환경 미생물학을위한 중요한 도구로 인식되고있다. 일반 metaproteomic은 복잡한 시료에서 단백질의 가까운 완벽하게 보완 보통 EN을 통해 정제 동시에 분석 산탄 총 프로테오믹스 방법을 사용 분석질량 분석기에서 펩타이드 및 분석에 zymatic 소화. 후속 탠덤 질량 분석 (MS / MS) &quot;펩타이드 지문은&quot;검색 단백질 데이터베이스에서 단백질 서열과 기원의 잠재적 인 단백질 (검토를 위해 11 참조)를 결정하는 데 사용됩니다. 단백체 연구는 게놈 데이터 가용성의 증가 및 민감도와 높은 처리량 단백질 식별 및 정량 (11, 12)을 허용 질량 분석기의 정확도의 증가로 지난 25 년 덕분에 먼 길을왔다. 단백질은 유전자 발현의 최종 제품이기 때문에, metaproteomic 데이터는 주어진 환경과 어떤 단백질들이 표현되어에서 활동하는 유기체를 결정하는 데 도움이됩니다. 환경 변수들의 특정 세트는 유기체 또는 커뮤니티의 표현형에 미치는 영향을 결정하기 위해 시도 할 때 유리하다. 초기에, 바다에서 MS / MS 기반 metaproteomic 연구 대상의 특정 단백질을 식별하는 데 사용되었다SAR11 해양 박테리아 (13)의 빛 구동 양성자 펌프 proteorhodopsin에 초점을 맞춘 첫 번째 연구와 미생물 계통. 최근 metaproteomic 비교 분석 복잡한 공동체 간의 차등 단백질 발현 패턴을 규명 하였다. 예를 들면 연안 북서부 대서양 14 남극 반도 5 대사의 시간적 변화의 식별을 포함한다. 다른 연구는 생산성이 높은 연안 용승 시스템 (15)에 저 영양 해양 환류에서 지리적 가로로 쪼개다 따라, 예를 들어, 공간 규모에 걸쳐 단백질 발현 패턴의 변화를 설명했다. metaproteomics의 자세한 리뷰를 위해 우리는 슈나이더 외. (2010) 9 윌리엄스 외. (2014) 16 좋습니다. 표적 단백질 체학은 또한 환경 (17, 18)의 특정 대사 경로의 발현을 정량하기 위해 최근 사용되어왔다. THERmetaproteomic 분석의 세 가지 주요 단계는 전자 있습니다. 첫 번째 단계는 샘플 수집, 세포 용해 단백질의 농도를 포함하는 샘플을 준비한다. 해양 미생물의 시료 채취는 대개 일반적으로 0.22 ㎛의 카트리지를 사용하여, 자유 살아있는 미생물 세포의 포착을 위해 여과 하였다 큰 진핵 세포, 입자 및 입자 - 관련 박테리아를 제거하는 프리 필터를 통해 해수를 여과 수반 필터 유닛 (19, 20). 이러한 필터는 플라스틱 실린더 incased하고 필터 부 내에서 수행 될 수있다 세포 용해 단백질 추출 프로토콜은 유용한 도구가 될 것이다. 바이오 매스가 얻어지면, 세포 단백질 추출을 위해 용해 될 수 있도록한다. 여러 방법이 구아니딘 염산 용해 21 및 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 기반 분해 방법을 포함하여, 또한 사용될 수있다. SDS와 같은 세정제, concentrati 많은 단백질 유형을 파괴하고 세포막을 가용화에 매우 효율적이지만0.1 %가 하류 단백질 소화와 MS 분석 (22)을 방해 할 수있는만큼 낮은 기능. 주요 관심사의 이온 소스 (23) 내부의 역상 액체 크로마토 그래피와 이온의 축적 억제 또는 해상력, 트립신 소화 효율에 SDS의 부정적인 효과이다. 두 번째 단계는 단백질 초기 트립신 펩티드의 1 차 아미노산 서열을 확인하는 데 사용할 수있는 AM / z 단편화 패턴의 결과로 LC MS / MS 분석 하였다 효소 소화 받는다 분류 및 분석한다. 다양한 소화 방법이 사용될 세제의 종류뿐만 아니라 질량 분광법 하류 흐름에 따라 수행 될 수있다. 우리의 프로토콜에서, SDS 겔로부터 제거하여 1-D의 PAGE 전기 영동 세제 오염을 제거하기 위해 이용된다. 이러한 막 단백질로서, 용해하기 어려운 단백질의 분석은, 높은 concen의 사용을 필요SDS 또는 다른 세제의 trations. 이는 SDS 겔 전기 영동과의 호환성 문제로 이끈다. 연구의 목적은 단백질을 용해하기 어려운 이들의 가용화가 필요한 경우, 관 - 겔 시스템 (22, 24)을 사용할 수있다. 튜브 - 겔법은 전기를 사용하지 않고 겔 매트릭스 내의 단백질을 포함한다. 그 후 가용화에 사용되는 모든 세제는 단백질 소화하기 전에 제거됩니다. 세 번째 단계는 생물 정보학 분석이다. 이 단계에서 MS / MS 데이터 펩티드는 펩티드 및 단백질 시료에 존재하는 결정으로 변환 뉴클레오티드 서열의 데이터베이스에 대해 검색된다. 펩타이드의 동정은 대하여 검색되는 데이터베이스에 의존한다. 해양 metaproteomic 데이터는 일반적으로 참조 게놈, 이러한 글로벌 오션 샘플링 데이터 세트 25 metagenomic 데이터뿐만 아니라 경작 리에서 단일 세포 증폭 된 게놈 구성 데이터베이스에 대해 검색됩니다(26, 27)를 neages. metaproteomic 데이터 5를 도출되었을 단백질 식별은 또한 동일한 샘플로부터 metagenomic 서열의 포함으로 증가시킬 수있다. 여기서 우리는 미생물 바이오 매스로부터 MS / MS 기반 분석에 적합한 펩티드를 여과 수집하고 RNA 안정화 용액에 기억의 생성을위한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA와 단백질이 모든 단계가 단백질로 이어지는 및 DNA의 침전이 동일 그래서 동일한 샘플에서 고립 될 수 있습니다. 단지 하나의 필터는 단백질 및 DNA 추출 둘 필요가 있기 때문에 실용적 관점에서, 적은 여과가 필요하다. 우리는 또한이 프로토콜이 이전에 발행 된 프로토콜의 조합, 적응 및 수정을 통해 만들어진 것을 인정하고 싶습니다. 세포 용해 단계 (2011) 28. 사이토 등의 알에서 적응하고 구성 요소를 소화에 - 겔 트립신은 Shevche에서 적응NKO 등. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0.22 &amp;mu;m filter unit</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 or TB0196-500G</td><td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Protein Extraction</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Protein Extraction</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Protein Extraction</td></tr><tr><td>10K Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Protein Extraction</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Protein Precipitation</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Protein Precipitation</td></tr><tr><td>MPC Protein Precipitation reagent</td><td>Epicenter</td><td>mmP03750</td><td>DNA Precipitation</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>DNA Precipitation</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Protein Quantification</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>30% Acrylamide</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoethanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>HPLC grade H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>2 ml ROBO vial 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>PP BM insert, No spring</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr></tbody></table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

데모, 우리는 표면과 캐나다 북부의 해안 바다의 엽록소 최대에서 수집 한 두 개의 해수 샘플에 프로토콜을 수행 하였다. 바다에서, 해수 6-7는 L이 3 μm GF / d를 전치 필터를 통과하면서, 그때는 월시 균체 외. (20)의 프로토콜은 다음 0.22 μm의 카트리지 필터 장치에 수집되었다. 세포는 추가 처리 될 때까지 즉시 RNA 안정화 용액에 저장 하였다. 이 여기에 제시된대로 연구실로 돌아온 ?...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

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8.7K 조회수.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

연구

생화학

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

환경과학

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

생체공학

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

화학

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

생물학

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

<meta charset="utf8"></head><body>Galaxy-Enabled Metaproteomics: 숙주-마이크로바이옴 상호 작용에 대한 통찰력

A Clinical Metaproteomics Workflow Implemented within Galaxy Bioinformatics Platform to Analyze Host-Microbiome Interactions Underlying Human Disease

Clinical metaproteomics reveals host-microbiome interactions underlying diseases. However, challenges to this approach exist. In particular, the characterization of microbial proteins present in low abundance relative to host proteins is difficult. Other significant challenges are attributed to using very large protein sequence databases, which impedes sensitivity and accuracy during peptide and protein identification from mass spectrometry data in addition to retrieving taxonomy and functional annotations and performing statistical analysis. To address these problems, we present an integrated bioinformatics workflow for mass spectrometry-based metaproteomics that combines custom protein sequence database generation, peptide-spectrum match generation and verification, quantification, taxonomic and functional annotations, and statistical analysis. This workflow also offers characterization of human proteins (while prioritizing microbial proteins), thus offering insights into host-microbe dynamics in disease. The tools and workflow are deployed in the Galaxy ecosystem, enabling the development, optimization, and dissemination of these computational resources. We have applied this workflow for metaproteomic analysis of numerous clinical sample types, such as nasopharyngeal swabs and bronchoalveolar lavage fluid. Here, we demonstrate its utility via the analysis of residual fluid from cervical swabs. The complete workflow and accompanying training resources are accessible on the Galaxy Training Network to equip non-experts and experienced researchers with the necessary knowledge and tools to analyze their data.

<meta charset="utf8"></head><body>인간 질병의 기저에 있는 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 분석하기 위해 Galaxy Bioinformatics 플랫폼 내에서 구현된 임상 메타단백질체학 워크플로우

Clinical metaproteomics offers insights into the human microbiome and its contributions to disease. We harnessed the computational power of the Galaxy platform to develop a modular bioinformatics workflow that facilitates complex mass spectrometry-based metaproteomic analysis and characterization of diverse clinical sample types relevant to studies of disease.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

요약

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이 비디오의 챕터

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl -_{L - 호모 시스테인 결합 단백질}

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별

인간 질병의 기저에 있는 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 분석하기 위해 Galaxy Bioinformatics 플랫폼 내에서 구현된 임상 메타단백질체학 워크플로우

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