Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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저자는 지원 유동 세포 계측법 제임스 Oesterling에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국 국립 암 연구소 (R01-CA178380, ZY)와 미국 국립 연구소 박사후 훈련 보조금 (5T32CA009035-37, LWY)에서 부여에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 폭스 체이스 암 센터의 동물 관리 및 사용위원회의 승인 절차에 따라 수행되었습니다. 인스트루먼트, 솔루션 및 Coverslips는의 1 준비 <ol><li> # 5 미세 집게의 청소 두 세트, # 7 한 세트의 미세 곡선 포셉, 하나의 큰 수술 가위, 한 microdissecting 가위, 한 주걱 하나 천공 숟가락. 자체 밀봉 멸균 파우치 및 오토 클레이브에 악기를 배치합니다. 사용할 준비가 될 때까지 주머니에 상품을 보관하십시오. </li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 거품이 나타날 때까지 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) 50 ㎖에 1.5 g 아가로 오스를 추가 한 다음 전자 레인지와 더위에 배치합니다. 모든 아가 때까지 소용돌이 플라스크 및 재가열은 해산했다. 수풀이 나타나면 이전 가열 교반 막대와 솔루션을 섞는다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 보관 솔루션까지 필요. </li><li> 장기 저장 상에 대한전자, 개월 동안 실온에서 4 ° C에서 향후 사용을 위해 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 액화 전자 레인지에 재가열. 아가로 오스 용액의 반복 가열 따뜻한 멸균 증류수 초기 중량을 유지하도록 가열하기 전에 플라스크의 무게. </li></ol></li><li> 이전에이 설명 된대로 파파인 기반의 세포 분리에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol><li> 멸균 페놀 레드를 DPBS에 함유 파파인 (100 U / ㎖), 시스테인 (0.2 ㎎ / ㎖) 및 DNase의 (250 U / ml)로 파파인 용액. </li><li> 소 혈청 알부민과 오보 뮤코 이드 용액 (BSA, 8 ㎎ / ㎖), 대두 트립신 억제제 (8 ㎎ / ㎖))과의 DNase (250 U / ㎖) 멸균 페놀 레드 - 함유 DPBS에서. 필터 솔루션을 모두 소독 및 페놀 레드 함유 DPBS의 원래 색상을 반환하는 산도를 조정합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양액 (NB / B27)를 제조 : 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM의 L-글루타민을, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S) 및 B27 보충제와 기저 용지를 보충. FilteR 소독 및 빛으로부터 보호합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서 미디어와 5 % CO 2를 평형. </li><li> FACS 버퍼를 준비 : 5 % 소 태아 혈청 DPBS에서 (FBS). 47.5 ML의 DPBS에 2.5 ML의 FBS를 추가합니다. </li><li> 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 된 커버 슬립을 준비합니다. <ol><li> 오토 클레이브 새로운 유리 커버 슬립. </li><li> 코트 PDL와 커버 슬립 (멸균 증류수 100 μg / ㎖) 및 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 또는 실온에서 하룻밤. </li><li> 세척 멸균 증류수로 된 커버. NB / B27 매체와 한 번 씻으십시오. 커버 슬립은 사용하기 전에 조직 문화 후드 완전히 건조 시키십시오. </li></ol></li></ol> 조직 조각의 2 해부 및 준비 <ol><li> 해부의 날, 흡수 패드와 70 % 에탄올 및 커버 해부 영역을 닦아. </li><li> 멸균 파우치 해부 도구를 제거합니다. 얼음 차가운 얼음에 작은 페트리 접시와 장소에 멸균 DPBS / 1 % P / s의를 추가합니다. </li><li> 목을 벨 P4 MATH1-GF큰 수술 가위로 P / 네 스틴 - CFP 마우스 새끼는 잘 곡선 집게로 머리를 누르십시오. 피부를 제거하고 부드럽게 미세 겸자 후 주걱을 이용하여 두개골로부터 뇌를 꺼내서 DPBS / 1 % P / 초를 포함하는 페트리 접시로 전송 # 5와 두개골을 벗겨. <ol><li> # 5 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분합니다. 가능한 빨리 한 번에 하나의 강아지를 해부해야합니다. </li><li> 분자 및 기능적 분석을위한 충분한 네프를 얻기 위해 8 소뇌의 최소 수집. </li></ol></li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 용액을 2 × 2 × 2cm를 측정 삽입 금형을 입력합니다. 아가로 오스의 온도가 더 이상 37 °의 C 없는지 확인하십시오. </li><li> 실험실 조직을 부드럽게 dabbing에 의해 소뇌 물기를 제거합니다. 수직으로 금형에 소뇌를 놓습니다. 신속 공고히 할 수 있도록 얼음에 금형을 놓습니다. 블록 당 ~ 4 소뇌를 사용합니다. </li><li> 리를 얻진동 블레이드와 vibratome ving 조직 섹션. 면도날과 소뇌 함유 아가로 오스 블록을 낸다. 수직으로 지향 소뇌와 vibratome 판 아가로 오스 블록을 붙인다. </li><li> 아래 얼음처럼 차가운 멸균 DPBS / 1 % P / S와 장소 얼음 vibratome의 트레이를 입력합니다. <ol><li> 소뇌의 전체 길이를 600 μm의 섹션을 잘라. 천공 숟가락을 사용하여 얼음 트레이에서 섹션을 수집합니다. 얼음에 DPBS / 1 % P / S 가득 페트리 접시에 넣어 섹션. </li></ol></li></ol> 3 이외에 Microdissection 및 세포 분열 <ol><li> 형광 해부 현미경 조직 슬라이스가 들어있는 페트리 접시를 놓습니다. <ol><li> 신중하게 (도 1에 점선 참조) CFP + 분자 층 및 GFP + EGL 사이에서 해부에 의해 미세 핀셋을 이용하여 소뇌 섹션의 나머지로부터 분리 EGL. 될 것이다, 분자 층의 일부를 포함하지 않도록주의하십시오네 스틴 발현 버그만 글리의 오염. </li><li> 가능한 한 빨리이 단계를 완료하고 세포 사멸을 방지하기 위해 얼음에 조직을 유지합니다. </li><li> 다음 단계로 진행하기 전에 주변 조직 아가로 오스를 제거한다. </li></ol></li><li> 이전에 단일 세포 현탁액을 수득 2 바와 같이 파파인 기반 프로토콜을 사용 microdissected EGL 조직 다이제스트. <ol><li> FACS를 통해 CFP 양성 세포의 수집을 위해 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 4 셀 정렬 및 도금 <ol><li> CFP 적절한 필터를 포함하고 얼음에 FACS 완충액에 세포를 수집 사이토 멸균, 고속의 흐름을 이용하여 CFP 형광 용 정렬 셀. 각 P4 소뇌에서 약 100,000 네프를 얻습니다. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. 추가 실험을위한 분자 분석이나 문화에 대한 즉시 세포를 사용합니다. </li><li> 배양 세포에, 미리 예열 NB / B27의 m에서 세포를 다시 일시 중단PDL-코팅 된 커버에 edia 및 판은 이전에이 설명했다. </li></ol>

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	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 미세 절제 방법은 분자와 기능적 분석에 사용하기 위해 살아있는 세포의 순수 모집단을 분리 할 제 절차이다. 리 등. 구에 의해 알 수 있듯이, 이 방법에 의해 얻어진 배양 네프 다양한 실험에 통합 때문에 고순도, 또한 마이크로 어레이 분석에 이용 될 수있다. 그것은이 미세 절제 기술에 능숙하게 시간이 걸리는 것이 매우 중요하다. 네프는 네 스틴 발현 버그만 글리는 NEP 세포 격리을 오염 및 순도를 손상시킬 수있는 분자 층에 매우 가까이에 EGL의 깊은 지역에 위치하고 있습니다. 미세 절제 따라서 포함되지 않은 인접 조직에 있는지 오염 세포를 만들기 위해 보수적으로 수행해야합니다. 여기에 설명 된 미세 절제 기술의 주요 장점은 furthe 배양 살아있는 세포 수를 얻을 수있는 능력이다연구 실험. 이 때문에,이 절차의 모든 단계 중에 신속하게 수행하고 조직이 최대한 얼음에 보관하는 것이 중요하다. 또한, 모든 장비와 시약은 멸균해야합니다. 다음 단계를 수행하여 세포 사멸과 세포 배양 오염을 줄일 수 있습니다. 또한, 아가로 장착 블록 당 여러 소뇌는 시술 시간을 감소 시키는데 도움이된다. 이 기술은 네프 단리에 한정되지 않고, 백질에서 분자 층과 신경 줄기 세포로부터 신경 교세포 같은 소뇌의 다른 영역으로부터 세포를 수집하기 위해 사용될 수있다. 소뇌 게다가, 미세 절제는 예를 들면, 해마와 같은 인식 가능한 영역을 포함하고 다른 조직으로 사용될 수있다. 여기서 이용 형광 유전자로의 사용은, 경계를 만드는 보조 또는 용이하게 식별 영역이 부족한 조직에 특히 도움이 될 수 있고, 그렇지 않으면 m이 될 수 없을 것이다 해부 용 영역을 식별 할 수있다icrodissected. 따라서이 기술 분야의 연구 및 응용의 넓은 범위에서의 휴대 purifications 돕기 있었다.

소뇌 여러 세포층, 각각 별개 함유 세포 유형으로 구성된다. 분자 층 및 조롱박 층은 각각 버그만 글리와 조롱박 신경 세포를 포함하는 동안 개발 과정에서 EGL은 과립 신경 세포 전구체 (GNPs)를 증식 포함되어 있습니다. 소뇌 내 깊은 신경 줄기 세포 (NSCs의)와 희소 돌기 아교 세포 하나가 들어있는 흰색 물질을,있다. 소닉 헤지 호그 (쉬) 소뇌 발달을 조절하는데 중요한 역할을하고, 특히, 그것은 기워 수용체 PTC (), 쉬 2-4 시그널링 네거티브 레귤레이터에 결합을 통하여 GNPs의 증식을 촉진시킨다. 쉬 시그널링의 비정상적인 활성화가 모세포종 (MB), 5,6 어린이에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 생성한다. PTC 돌연변이 MB 형질 전환 마우스 모델은 MB의 연구를위한 강력한 도구이며, 인간의 MB 7,8를 닮은 종양을 개발합니다. 사용이마우스, 그것은 GNPs 고슴도치 형 MB 7의 원래 세포 것을 발견되었다. 또한, GNPs 외에, 우리는 또한 최근에 MB를 야기 할 수있는 현상 소뇌 EGL 내의 신경 전구 세포의 집단을 고유 식별했습니다. 이러한 세포 유형 VI 중간 필라멘트 단백질, 네 스틴의 높은 수준의 발현 및 네프 9 불린다. 네프는 EGL의 깊은 부분에 위치한 유일한 신생아 소뇌 개발 과정에서 일시적으로 존재한다. 그들은 GNPs와 과립 세포 계보에 최선을 다하고 있지만,이 대기하고 MATH1, 기존의 GNPs 10 잘 설립 마커를 발현하지 않는 별개 있습니다. 또한, 네프 그들 MB의 종양에 대한 새로운 기원하게 쉬의 신호 전달 경로 (9)의 활성화 이후 MB에 상승보다 효율적으로보다 GNPs을 제공합니다. 우리는 이전에 미세 절제 기술에 의해 출생 후의 일 4 (P4)에서 소뇌 EGL에서 네프 격리여기에 9 설명했다. 조직의 직접 현미경 시각화를 통해 미세 절제는 소뇌 EGL의 특정 해부 수 있습니다. 네 스틴도 소뇌 백질과 분자 층 1,7,11,12에서 버그만 글리에 의해 NSCs을 표현하고 분석을 혼동 하듯이,이 세포를 포함하지 않는 것이 중요했다대로이 필요합니다. microdissected 조직에서 분리 한 세포는 분자 분석을 위해 즉시 이용 될 수도 있고 또 애플리케이션을 배양 할 수있다. 특히 EGL을 microdissecting을 돕기 위해 더욱 네프를 정화, MATH1-GFP (녹색 형광 단백질) 마우스는 네 스틴-CFP (시안 형광 단백질) 마우스와 함께 넘어졌다. 구체적 MATH1 GNPs 및 GFP 발현에 의해 표현되는 전사 인자는 EGL 9, 13에서 명확하게 볼 수있다. 네 스틴 - CFP 생쥐 CFP의 핵 형태를 표현하고 쉽게 9,14 분자 층으로 시각화 될 수있다. 함께, CFP 및 GFP 발현 EGL의 미세 절제를위한 경계를 생성 (도 1 참조). CFP 양성 네프는 다음 해부 EGLs의 효소 분해 다음, FACS에 의해 고립되었다. 현재 EGL에서 세포를 분리하기위한 가장 잘 이용 방법은 전체 소뇌 조직 (15, 16)의 퍼콜 구배 원심이다. 그러나,이 방법은 완전히 분자 층과 백질에서의 네 스틴 + 세포 집단을 배제 할 수 없으며, 따라서 네프의 연구에 사용될 수 없다. 관심의 세포를 제거하기 위해 레이저 에너지의 전달을 사용하여 레이저 캡처 미세 절제는 이종 조직 (17, 18)의 특정 세포를 분리하기 위해 사용되지만 캡처 세포에서만 DNA, RNA 및 단백질의 복구를 위해 사용될 수없는 수있는 또 다른 방법이다 수는 배양한다. 이 프로토콜은 특히 EGL에서 네프의 살아있는 순수한 인구를 분리하는 방법을 제공합니다.이 기술은 인식 할 수있는 해부학 적 구조 또는 형광 표지 세포 / 영역들 중 하나가 다른 조직 유형에 적용될 수있다. 따라서, 세포 격리 프로토콜에이 신규 한 미세 절제 기술을 통합의 주요한 장점은 세포 조직에 인접 오염을 제거하는 특정 조직 영역으로부터 분리 될 수 있고, 셀이 다른 애플리케이션에 대한 분석 또는 배양 즉시 수집 될 수 있다는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

미세 절제는 조직의 특정 지역을 격리하며 인접 지역에서 휴대 소스에서 오염을 제거 할 수있는 새로운 기술이다. 이 방법의 첫 번째 연구에서 이용 된 네 스틴을 발현하는 전구 세포 (네프)를, 소뇌 새싹 외부 층 (EGL) 세포의 새롭게 식별 인구. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 조합 미세 절제를 사용 네프의 순수한 인구 소뇌 EGL 종래 과립 뉴런 전구체로부터 다른 오염 네 스틴 발현 세포 별도로 수집 하였다. 미세 절제없이 네프의 기능성 분석은 퍼콜 구배 원심 분리 및 레이저 캡처 미세 절제으로 사용할 현재의 방법으로 불가능했을 것이다. 이 기술은 또한 인식 할 수있는 영역 또는 형광 표지 된 세포 중 하나를 포함하는 다양한 조직과 함께 사용하기 위해 적용될 수있다. 이 microdissectio 중 가장 중요한 것은, 가장 큰 장점N 기법은 절연 세포 사는 다른 한 방법으로 현재 불가능 추가적인 실험, 배양 될 수 있다는 것이다.

도 1a에 도시 된 바와 같이, 소뇌 슬라이스 된 소뇌 EGL는 GFP 발현 GNPs을 지배하고, 분자 층은 CFP 양성 신경 교세포에 의해 농축시키고, P4 MATH1-GFP / CFP 네 스틴 - 마우스로부터 제조 하였다. (; 그림 1A 점선을 따라) EGL의 깊은 부분에있는 네프를 분리하려면 슬라이스 EGL 및 분자 층 사이에 microdissected되었다. 해부 EGLs (그림 1B)는 다음 FACS 다음 효소 분해에 수집되었다. 예상대로, 해부 EGL에서 세포의 대부분 (85 % 이상)은 GFP (그림 2A)에 대해 긍정적이었다 기존 GNPs이었다. 네프 EGL 세포 인구의 약 5 %를 (CFP +) 계정. 대부분의 세포 중 어느 것도 FACS 분석을 기반으로 GFP 및 CFP 더블 양성 없었다. FACS에 의해 정제 CFP + 세포는 분화 pote를 검사 체외 배양ntial. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 네프 독점적으로 β-튜 불린하는 + 뉴런을 배양 4 일 후에 초래했다, 제안 네프는 혈통 제한이 신경 전구 세포이다. 이 미세 절제 프로토콜에 의해, 네프와 GNPs 또한 EGL의 PTC 결핍 소뇌에서 정제 하였다. 두개 내 이식시, 네프는 네프가 종양 변환 구에 특히 취약 것을 나타내는 GNPs에 비해 더 빠르게 매크로 블럭을 개발한다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig1highres.jpg" width="500" /> EGL의 미세 절제의 영역의 그림 1 식별. P4 MATH1-GFP / 네 스틴 - CFP 동물에서 형광 이미지. CFP 식의 대부분은 분자 층에있는 동안 (A) GFP 발현, EGL에 있습니다. 미세 절제는 t 함께 이루어졌다그는 황색 점선. (B)는 조직 EGLs 해리 수집 하였다. 이 수치는 리 외 9에서 수정되었습니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 네프는 EGL에서 세포의 작은 인구를 대표하고 혈통 제한이 신경 전구 세포입니다. (A). microdissected EGL에서 격리 CFP + 세포의 유동 세포 계측법 분석 (B) 네프 4 일 동안 분화 조건에서 배양 및 β-튜 블린 (빨간색)에 대한 염색 및 DAPI (파란색)와 대조. 이 수치는 리 외에서 수정되었습니다. 9

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K 조회수.  Temple University Health System.  네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다. 

비디오: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

연구

발생학

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

생물학

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

면역학 및 감염병학

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

신경과학

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 분리 및 배양)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

출생 후 마우스 소뇌에서 줄기세포의 분리 및 신경 세포로의 분화

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...