Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei James Oesterling für die Durchflusszytometrie Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-amerikanischen National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) und einer US-amerikanischen National Institute Postdoc-Stipendium (5T32CA009035-37, LWY) unterstützt.

Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Fox Chase Cancer Center Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. 1. Vorbereitung der Instrumente, Lösungen und Deckgläser <ol><li> Saubere zwei Sätze von # 5 feinen Pinzette, ein Satz von # 7 feinen gebogenen Pinzette, einer großen chirurgischen Schere, eine microdissecting Schere, einem Spachtel und einem Lochlöffel. Legen Sie die Instrumente in einer selbstdichtenden Sterilisationsbeutel und Autoklaven. Halten Sie die Geräte in Beutel bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung. <ol><li> 1,5 g Agarose hinzufügen in 50 ml sterilem Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), dann in der Mikrowelle und Wärme setzen, bis sich Blasen bilden. Swirl Kolben und Zwischenüberhitzung, bis alle Agarose gelöst hat. Mischen Lösung mit einem Rührstab vor dem Erhitzen, wenn Klumpen erscheinen. </li><li> Shop-Lösung in einem 37 ° C warmen Wasserbad, bis sie benötigt. </li><li> Für langfristige storage, speichern die Agarose-Lösung für eine spätere Verwendung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für Monate. Aufwärmen in der Mikrowelle zu verflüssigen. Für wiederholte Erwärmung der Agarose-Lösung, der Kolben wiegen vor dem Erhitzen in seine Ausgangsgewicht mit warmem sterilem destilliertem Wasser zu halten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Papain-basierte Zell Dissoziation, wie zuvor beschrieben 2: <ol><li> Ein Papain-Lösung mit Papain (100 U / ml), Cystein (0,2 mg / ml) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS. </li><li> Eine Ovomucoid-Lösung mit Rinderserumalbumin (BSA, 8 mg / ml), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (8 mg / ml)) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS. Filter sterilisieren beide Lösungen und pH-Wert auf ursprüngliche Farbe der Phenol-Rot-haltigen DPBS zurückzukehren. </li></ol></li><li> Vorbereitung Zellkulturmedien (NB / B27): Ergänzung Basalmedium mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) und B27 Supplement. Filter sterilisieren und vor Licht schützen. Äquilibrieren Medien bei 37 ° C und 5% CO 2 vor der Verwendung. </li><li> Vorbereitung FACS-Puffer: 5% fötalem Rinderserum (FBS) in DPBS. Fügen Sie 2,5 ml bis 47,5 ml FBS DPBS. </li><li> Vorbereitung Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Deckgläschen. <ol><li> Autoklaven neue Deckgläser. </li><li> Bestreichen Sie die Deckgläser mit PDL (100 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser) und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C oder Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Waschdeckgläser mit sterilem destilliertem Wasser. Einmal mit NB / B27 Medien waschen. Lassen Deck vollständig trocknen in der Gewebekultur Haube vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Dissection und Herstellung von Gewebeschnitten <ol><li> Am Tag der Präparation, wischen Sie die Dissektion Bereich mit 70% Ethanol und Abdeckung mit einem saugfähigen Unterlage. </li><li> Entfernen Dissektion Werkzeuge aus der Sterilisationsbeutel. Fügen eiskalt, sterile DPBS / 1% P / S zu einem kleinen Petrischale und auf Eis. </li><li> Enthaupten P4 Math1-GFP / Nestin-GFP Maus Welpen mit großen chirurgischen Schere halten dann den Kopf nach unten mit feinen gebogenen Pinzette. Entfernen Sie die Haut und vorsichtig abziehen der Schädel mit # 5 feinen Pinzette dann aushöhlen das Gehirn aus dem Schädel mit einem Spatel und überträgt es auf die Petrischale mit DPBS / 1% P / S. <ol><li> Verwendung von # 5 feinen Pinzette vorsichtig die Kleinhirn vom Rest des Gehirns. Achten Sie darauf, einen Welpen zu einem Zeitpunkt, so schnell wie möglich zu sezieren. </li><li> Sammeln ein Minimum von 8 Kleinhirn, um genügend NEPs für molekulare und funktionelle Analysen zu erhalten. </li></ol></li><li> Füllen Sie eine Einbettung Form von 2 x 2 x 2 cm mit 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung. Sicherzustellen, dass die Temperatur der Agarose nicht mehr als 37 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Kleinhirn durch Abtupfen sanft auf einem Labor Gewebe. Zeigen Kleinhirn in die Form in eine vertikale Position. Legen Sie die Form auf Eis, damit es schnell zu verfestigen. Werden ~ 4 cerebella pro Block. </li><li> Erhalten liVing Gewebeschnitte mit einem vibrierenden Klinge Vibratom. Trim cerebella haltige Agarose-Block mit einer Rasierklinge. Kleben Sie die Agarose-Block auf die Platte Vibratom mit Kleinhirne in eine vertikale Position ausgerichtet. </li><li> Füllen Sie den Boden der Vibratom mit eiskaltem sterilen DPBS / 1% P / S und Ort Eis darunter. <ol><li> Schnitt 600 um Schnitte durch die gesamte Länge des Kleinhirns. Sammeln Abschnitte aus dem Eiswürfelschale mit einem perforierten Löffel. Platz Abschnitte in einer Petrischale mit DPBS / 1% P / S auf Eis gefüllt. </li></ol></li></ol> 3. Mikrodissektion und Zelldissoziation <ol><li> Legen Sie die Petrischale mit Gewebeschnitten unter einem Fluoreszenz-Binokular. <ol><li> Vorsichtig die EGL aus dem Rest der Kleinhirnschnitt mit feinen Pinzette durch Sezieren zwischen der GFP + Molekularschicht und der GFP + EGL (siehe gestrichelte Linie in Abbildung 1). Achten Sie darauf, jeden Teil des molekularen Schicht nicht enthalten, die dazu führen wirdKontamination von Nestin-exprimierenden Bergmann Gliazellen. </li><li> Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich zu halten und das Gewebe auf Eis, um den Zelltod zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die Agarose die umgebenden Gewebe, bevor Sie zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Digest mit einer Papain-basiertes Protokoll, wie zuvor beschrieben, 2 um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die microdissected EGL Gewebe. <ol><li> Resuspendieren Zellen in FACS-Puffer für die Sammlung der GFP-positiven Zellen über FACS. </li></ol></li></ol> 4. Zellsortierung und Oberflächen <ol><li> Sortieren Zellen für GFP-Fluoreszenz mit einer sterilen, Hochgeschwindigkeits Durchflusszytometer, die eine geeignete GFP-Filter und sammeln Zellen in FACS-Puffer auf Eis. Erhalten rund 100.000 NEPs von jedem P4 Kleinhirn. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min. Verwenden Zellen sofort für die molekulare Analyse oder Kultur für weitere Experimente. </li><li> Zur Kultivierung von Zellen, Wieder die Zellen in vorgewärmte NB / B27 medien und Platte auf PDL-beschichtete Deckgläser wie zuvor beschrieben 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Mikrodissektionsverfahren ist das erste Verfahren in der Lage, eine reine Population von lebenden Zellen für den Einsatz in der molekularen und funktionellen Analysen zu isolieren. Wie von Li et al. 9 gezeigt, NEP durch dieses Verfahren erhalten werden, können kultiviert werden und in verschiedenen Versuchen integriert werden und aufgrund ihrer hohen Reinheit kann auch für die Microarray-Analyse eingesetzt werden. Es ist sehr wichtig, sich Zeit zu nehmen tüchtig mit diesem Mikrodissektion Technik zu werden. NEP sind im tiefen Bereich der EGL in unmittelbarer Nähe zu der Molekularschicht, in der Nestin-exprimierenden Bergmann Gliazellen könnte die NEP Zellisolierung kontaminieren und Kompromisse Reinheit entfernt. Mikrodissektion sollte daher konservativ durchgeführt, um sicher kontaminierenden Zellen in benachbarte Gewebe sind nicht enthalten zu machen. Der große Vorteil der hier beschriebenen Mikrodissektion Technik ist die Fähigkeit, lebende Zellen zu erhalten, die für furthe kultiviert werden könnenr Experimente. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass alle Schritte bei diesem Verfahren schnell durchgeführt werden und dass Gewebe auf Eis so viel wie möglich gehalten werden. Auch müssen alle Instrumente und Reagenzien steril sein. Nach diesen Schritten wird Zelltod und Zellkultur-Kontamination zu verringern. Darüber hinaus wird die Montage mehrerer Kleinhirn pro Agarose-Block bei der Verringerung der Verfahrenszeit zu unterstützen. Diese Technik ist nicht die Isolation Nissen beschränkt und kann verwendet werden, um Zellen, die von anderen Bereichen des Kleinhirns, wie Gliazellen aus der Molekularschicht und neuronalen Stammzellen aus der weißen Substanz zu sammeln. Neben dem Kleinhirn, kann Mikrodissektion mit anderen Geweben, die erkennbar Regionen wie dem Hippocampus enthalten, beispielsweise verwendet werden. Die Verwendung von fluoreszierenden Transgene, wie hier verwendet, kann bei der Schaffung von Grenzen zu helfen oder zu identifizieren, für die Präparation Regionen, die besonders hilfreich bei der Gewebe, die leicht erkennbar Raum mangelt es sein kann, und sonst nicht in der Lage, m seinicrodissected. Diese Technik könnte daher in der Zelle helfen Reinigungen in einer Vielzahl von Forschungsbereichen und Anwendungen.

Das Kleinhirn aus mehreren Zellschichten, die jeweils verschiedene Zelltypen umfassen. Während der Entwicklung der EGL enthält wuchernden Granulat Neuron Vorstufen (BSP), während die Molekularschicht und Purkinje-Schicht enthalten Bergmann Gliazellen und Neuronen Purkinje auf. Tief im Kleinhirn liegt die weiße Substanz, die neurale Stammzellen (NSCs) und Oligodendrozyten 1 enthält. Sonic Hedgehog (Shh) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Kleinhirnentwicklung und insbesondere fördert sie die Verbreitung von BSP über die Bindung an seinen Rezeptor Patched (PTC), einem negativen Regulator der Shh-Signal 2-4. Abweichende Aktivierung des Shh-Signal erzeugt Medulloblastom (MB), der häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern 5,6. PTC-Mutante MB transgenen Mausmodellen sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung von MB und entwickeln Tumoren menschlichen MB 7,8 ähnelt. Mit diesenMäusen wurde festgestellt, dass BSP sind die Ursprungszelle für Hedgehog-Aktivität MB 7. Ferner, zusätzlich zu BSP, haben wir kürzlich eine einzigartige Population von neuronalen Vorläuferzellen in der EGL des Kleinhirns, die auch die Entwicklung hervorrufen können MB identifiziert. Diese Zellen exprimieren hohe Konzentrationen des Typs VI Intermediärfilament Protein, Nestin, und werden als NEP 9. NEP werden im tiefen Teil der EGL befindet und existieren nur in Neugeborenen vorübergehend Kleinhirnentwicklung. Sie sind auf der Körnerzelllinie als BSP verpflichtet, sondern sind verschieden, wie sie sind und nicht Ruhe Math1, eine gut etablierte Marker für herkömmliche BSP 10 auszudrücken. Darüber hinaus geben Anlass zu NEP MB effizienter als BSP nach Aktivierung des Shh-Signalweg 9, die sie zu einem neuen Ausgangspunkt für MB Tumorentstehung spielt. Wir haben vorher isoliert NEPs aus der Kleinhirn EGL am postnatalen Tag 4 (P4) durch die Mikrodissektion Technikhier 9 beschrieben. Mikrodissektion über direkte mikroskopische Visualisierung des Gewebes ermöglicht spezifische Präparation der Kleinhirn EGL. Dies ist notwendig, da Nestin auch von NSC in der Klein weißen Substanz und von Bergmann Glia in der Molekularschicht 1,7,11,12 ausgedrückt und es war von entscheidender Bedeutung, dass diese Zellen nicht aufgenommen werden, da sie Analyse verwechseln. Zellen, die aus Gewebe isoliert microdissected kann sofort für die molekulare Analyse verwendet werden, oder sie kann für weitere Anwendungen kultiviert werden. Auf staatliche Beihilfen, die speziell microdissecting die EGL und zur weiteren Reinigung Nissen, wurden Math1-GFP (green fluorescent protein)-Mäusen mit Nestin-GFP (cyan fluorescent protein)-Mäusen gekreuzt. Der Transkriptionsfaktor Math1 wird speziell durch BSP und GFP-Expression ausgedrückt ist in der EGL 9,13 deutlich sichtbar. Nestin-GFP-Mäuse exprimieren eine Kern Form von GFP und kann leicht in der Molekularschicht 9,14 visualisiert werden. Zusammen, GFP und GFP-Expression zu erstellen Grenzen für die Mikrodissektion der EGL (siehe Abbildung 1). GFP-positiven NEPs wurden dann durch FACS isoliert, nach enzymatischer Spaltung der beschäftigungspolitischen Leitlinien seziert. Derzeit ist das Verfahren auch verwendet, um Zellen von der EGL isolieren Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Vollkleinhirngewebe 15,16. Dieses Verfahren ist jedoch nicht Nestin +-Zellpopulationen aus der Molekularschicht und der weißen Substanz vollständig ausschließen und kann daher nicht für die Untersuchung der NEP verwendet werden. Laser Mikrodissektion, die die Übertragung von Laserenergie verwendet, um Zellen von Interesse zu entfernen, ist eine andere verwendet, um bestimmte Zellen in einer heterogenen Gewebe 17,18 isolieren, sondern gefangenen Zellen können nur zur Gewinnung von DNA, RNA und Protein verwendet werden und sind nicht Verfahren Lage, kultiviert werden. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, gezielt isolieren eine lebendige, reine Population Nissen von der EGL.Diese Technik kann auch auf verschiedene Gewebearten, die entweder erkennbar anatomischen Architektur oder fluoreszenzmarkierten Zellen / Regionen angewendet werden. Daher ist der große Vorteil der Einbeziehung dieser neuartigen Mikropräparationsverfahren in Zellisolierungsprotokolle, die Zellen von bestimmten Gewebebereichen getrennt werden, zu beseitigen kontaminierenden benachbarte Gewebe und die Zellen können sofort für eine Analyse oder für andere Anwendungen kultiviert gesammelt werden.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Mikrodissektion ist eine neuartige Technik, die spezifische Regionen eines Gewebe zu isolieren und Verunreinigungen zu beseitigen aus zellulären Quellen in benachbarten Bereichen können. Dieses Verfahren wurde in der Studie verwendet Nestin exprimieren Progenitoren (NEP), einem neu identifizierten Population von Zellen in der Klein externe Keimschicht (EGL). Verwendung Mikrodissektion in Kombination mit fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde eine reine Population Nissen getrennt von herkömmlichen Granulat Neuron Vorstufen in EGL und von anderen kontaminierenden Nestin-exprimierenden Zellen im Kleinhirn gesammelt. Ohne Mikrodissektion würde funktionelle Analysen Nissen nicht mit der aktuellen Methoden zur Verfügung, wie Percoll-Gradienten-Zentrifugation und die Laser Mikrodissektion möglich. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit verschiedenen Geweben, die entweder erkennbar Regionen oder fluoreszenzmarkierten Zellen enthalten eingesetzt werden. Am wichtigsten ist, ein wesentlicher Vorteil dieser microdissection Technik ist, dass isolierte Zellen leben und kann für weitere Experimente, die derzeit mit anderen beschriebenen Methoden nicht möglich ist kultiviert werden.

Wie in 1A gezeigt, wurden Kleinhirnschnitten von P4 Math1-GFP / Nestin-GFP-Mäuse hergestellt, in dem der Kleinhirn EGL wurde von GFP-exprimierenden BSP dominiert und die Molekularschicht wurde durch GFP-positive Gliazellen angereichert. (; 1A entlang gestrichelte Linie) zu NEP, die in den tiefen Teil der EGL befinden isolieren, wurden Scheiben zwischen der EGL und der Molekularschicht mikrodissektiert. Anatomisches BPLL (1B) wurden dann für die enzymatische Spaltung, gefolgt von FACS gesammelt. Wie erwartet, eine Mehrheit (über 85%) von Zellen in dem sezierten EGL waren herkömmliche BSP, das für GFP (2A) positiv waren. NEP (GFP +) machen nur rund 5% der EGL Zellpopulation. Fast keine der Zellen waren doppelt positiv für GFP und GFP-basierten FACS-Analyse auf die. GFP +-Zellen durch FACS gereinigt, wurden in vitro kultiviert, um die Differenzierung zu untersuchen Potential. Wie in 2B gezeigt, Nissen ergab ausschließlich die zu β-Tubulin +-Neuronen nach 4 Tagen in der Kultur, was NEP sind linien eingeschränkten neuronalen Vorläuferzellen. Durch dieses Protokoll Mikrodissektion wurden Nissen und BSP auch von der EGL von Ptc mangelKleinHirn gereinigt. Nach intrakraniellen Transplantation entwickeln NEPs MBs schneller verglichen mit BSP, die anzeigt, dass NEP besonders anfällig für onkogene Transformation 9 sind. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Bezeichnung der Region für die EGL Mikrodissektion. Fluorescent Bilder von P4 Math1-GFP / Nestin-GFP Tieren. (A) GFP-Expression in der EGL befindet, während die Mehrheit der GFP-Expression in der Molekülschicht. Mikrodissektion wurde entlang t getaner gelb gestrichelten Linie. (B) wurden für die beschäftigungspolitischen Leitlinien Gewebedissoziation gesammelt. Diese Zahl wurde von Li et al 9 geändert. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. NEP stellen eine kleine Population von Zellen in der EGL und sind linien beschränkt neuronalen Vorläuferzellen. (A) Die Durchflusszytometrie Analyse der GFP +-Zellen aus mikrodissezierten EGL isoliert. (B) NEPs wurden unter Differenzierungsbedingungen für 4 Tage kultiviert und für β-Tubulin (rot) gefärbt und mit DAPI (blau) gegengefärbt. Diese Zahl wurde von Li et al modifiziert. 9

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden.

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Aufrufe.  Temple University Health System.  Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden. 

Serie: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Biologie

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Immunologie und Infektion

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Neurowissenschaften

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolierung und Kultivierung von primären zerebellären Körnerneuronen der Maus

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und Differenzierung in Nervenzellen

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...