Name: single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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이 프로젝트는 토지 바덴 뷔 르템 베르크에 의해뿐만 아니라 유럽 연합 (EU), 유로 파이스 퐁 자금 엘리제 REGIONALE ENTWICKLUNG 다이했다. 저자는 숙련 된 기술 지원 U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 세포주와 클라우디아 Hintze를 제공​​하기위한 라이너 티그 (ILM 울름를) 감사합니다.

1 셀 회전 타원체 성장하고 배양 <ol><li> 실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양 <ol><li> (6 판에 충분한) 30 ml의 배지에 아가로 오스 0.45 g을 첨가하여 배양액에 1.5 % 아가로 오스를 준비한다. </li><li> 수시로를 교반하면서 단계 1.1.1에서 최소 80 ° C로 가열하여 혼합합니다. </li><li> 96 웰 플레이트의 각 웰에 단계 1.1.2에서 가열 된 혼합물의 50 μl를 작성하고 1 ~ 2 시간 내에 확고히 할 수 있습니다. 사용할 때까지 5 ° C에서 냉장고에 폐쇄 덮여 판을 보관하십시오. </li><li> 제조 된 96 - 웰 10 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 햄 F-12 배지와 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM)에서 플레이트와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신의 각 웰에 150 MCF-7 유방암 세포에 대한 종자 . </li><li> 5 % CO 2와 37에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체 성장76, C. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 2 μM과 (배지에서) 8 μM 사이의 농도 범위에서 6 시간 동안 안트라 사이클린 항생제 독소루비신 염산염과 셀 회전 타원체를 품어. </li><li> 문화 매체 또는 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 현미경의 이전과 셀 회전 타원체을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 실험 2 : 산화 환원 센서를 발현 타원체의 산화 공정 <ol><li> DMEM에서 96 - 웰 플레이트의 영구적 아가 로스 겔 피복 웰 글루타티온 민감한 녹색 형광 산화 환원 센서 Grx1-roGFP2 (절차 단계에 설명 1.1.1-1.1.3)로 형질 400 U251-MG-L106의 아교 모세포종 세포에 대한 종자 배양 배지는 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (/ ㎖ 150 μg)으로 보충. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장. </li><li> 10 &amp; # 추가181, 100 mM의 스톡 용액을 만들기 위해 990 ㎕의 이중 증류수에 과산화수소 수용액 (purum 펜실바니아, ≥ 30 %)의 (L)은 12 시간 이내에 사용해야한다. </li><li> 바로 실험 전 단계에서 EBSS에서 1.2.3 50 μM을 원액을 희석. </li><li> 산화 환원 센서의 산화 EBSS에 과산화수소 50 μM와 측정 중에 마이크로 유체 시스템을 통한 세포 배양 타원체. </li></ol></li><li> 실험 3 : 개시 및 회전 타원체 내에서 세포 괴사의 표시 <ol><li> 보충 된 DMEM 배지에서 96 - 웰 플레이트의 아가로 오스 겔 피복 종자 웰에 400 세포 (예, U251-MG-L106-Grx1-roGFP2의 아교 모세포종 세포) (절차 단계에서 설명 1.1.1-1.1.3) 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (150 ㎎ / ㎖). </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장. </li><li> 셀을 품어배지에서 1 μM의 농도에서 3 시간 동안 미토콘드리아 전자 수송 억제제 로테와 타원체 세포 괴사를 유도한다. 또한, 괴사 세포에 라벨을 1 ㎖의 배양 배지에서 1 μL의 농도로 3 시간 동안 녹색 세포 독성 염료와 공동 품어. </li><li> 문화 매체 또는 현미경의 이전 EBSS와 셀 회전 타원체을 씻으십시오. </li></ol></li></ol> 2 라이트 시트 조정 주 : 최상의 결과를 달성하기 위해 그것은 광 시트의 빔 허리는 대물 렌즈의 포커스 평면에 있음을 보장해야한다. 빔 허리의 위치는 단지 (- 2.8 단계 2.5 참조), 모세관에 대하여 수직 위치에서 광 시트를 관찰하여 정렬 될 수있다. <ol><li> 도립 현미경을 사용하여 참고 문헌에 설명 된 것처럼, 여기 SPIM 모듈을 탑재. (16), 위치 결정 테이블의베이스 플레이트 (도 1a 참조). </li><li> 1 현미경을 착용0X / 또는 20X 0.3 / 0.5 현미경 대물 렌즈와 현미경의 검출 경로에 적합한 긴 통과 필터 (예를 들어, λ ≥ 515 nm의). </li><li> 현미경의 검출 포트에 통합 카메라를 탑재합니다. </li><li> 우선적으로 470 나노 미터의 여기 파장으로 레이저 또는 레이저 다이오드의 빔 평행 시준을 사용 SPIM 모듈에 적용. </li><li> 빛 시트의 빔 허리의 축 조정을위한 수직 위치로 빛을 시트를 전송 90도에 의해 원통형 렌즈를 돌립니다. </li><li> 샘플 홀더에 형광 염료와 액체를 포함하는 모세관을 놓습니다. </li><li> 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고이를 중심 광 시트의 빔 허리 초점이되도록 모세관의 위치를​​ 정렬. </li><li> 원통형 렌즈 자체의 축 방향 위치의 변화에​​ 의해 빔 허리를 조정. 광고 후 렌즈를 돌려,justment. </li></ol> 3 셀 회전 타원체의 응용 프로그램 및 현미경 피드 동기화 <ol><li> 600 μm의 × 600 μm의의 내부 단면과 120 μM의 두께와 별도로 또는 직사각형 붕규산 유리 모세관 (16) 내에서 그룹 셀 회전 타원체를 놓습니다. 셀 회전 타원체의 응용 프로그램에 대한 두 가지 기술이 성공적으로 입증했다. <ol><li> 엄지 손가락과 가운데 손가락 똑바로 빈 모세관을 가지고 당신의 집게 손가락 상부 개구를 밀봉. 하부 주위의 액체 셀 타원체 주변 개구 (EBSS 또는 배양 배지)을 준비한다. 상부 개구에서 집게 손가락을 뗍니다. 그 안에있는 셀 회전 타원체와 액체는 모세관 힘에 의해 즉시에 배어됩니다. 모세관의 각각의 수직 위치에서 중력에 의해 채워진 모세관 내에서 회전 타원체의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 또한, 피펫 팅을 통해 모세관에 셀 회전 타원체를 적용합니다. 관리 그쪽을 가지고회전 타원체의 크기만큼 큰 한편이다 피펫의 선단의 개구를, T와, 다른 한편으로는, 더 적은 또는 모세관의 내경의 크기와 동일. </li></ol></li><li> 현미경을위한 특별한 샘플 홀더 그것에 회전 타원체와 모세관을 놓습니다. </li><li> 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고 중심 집중되도록 셀 타원체의 위치를​​ 정렬. </li><li> 광 시트 및 반사 미러의 위치와 원통형 렌즈를 조정함으로써, 검출 패스의 현미경 대물 렌즈의 초점면 사이의 일치를 설정 (도 1b에 조절 나사를 참조). </li><li> 마이크로 미터 나사를 조정하여 굴절률과 어항 효과를 보상하기위한 대물 렌즈의 개구 수에 따라 (도 1b 참조). NOTE : 다른 굴절률을 샘플의 인덱스 t와 주변 매체그 대물 렌즈의 이동과 초점 평면의 변화 간의 차이와 대물 렌즈 리드. 광 시트는 대물 터릿에 의해 이동되기 때문에, 광 시트 (대물 렌즈의 시프트에 대응)과 초점 평면의 시프트의 시프트 간의 불일치는 레버 아암에 의해 보상된다 (도 1b 참조). 마이크로 미터 나사가 대물 렌즈의 개구 수와 굴절률에 따른 광 시트의 이동을 조절하기 위해 상부 및 하부 핀 사이의 간격을 조정하기 위해 사용된다. </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> 단일 평면의 조명도 1 (A) 도립 현미경의 위치 결정 테이블의베이스 플레이트에 장착 된 하나의 평면 조명 모듈의 그림, (B) 설치모듈과 현미경 공급 동기화 초점 평면과 조명 평면 사이의 리프팅 불일치 (어항 효과)를 보상한다. ΔZ o를 초점면의 이동과 광 시트 F 대물 렌즈와 ΔZ의 변화를 나타냅니다. 인레이는 회전 타원체 포함하는 모세 혈관의 단면을 보여줍니다. 왼쪽 : 직사각형 모세관 600 μm의 (벽 120 μm의)의 내경. 오른쪽 : 회전에 사용되는 설치 프로그램을 실행합니다. 내부 원형 모세관 (내경 400 μM, 550 μM, 외경)은 외측 직사각형 모세관 내에서 회전된다. 이 모세 혈관 사이에 공간이 침지 액체로 채워진다. 동적 액체 환경에서의 4 측정 NOTE : 이전 프로토콜 셀 타원체 이전 단순한 중력에 의해 모세관 장소에서 배양 한 후 유지되어있는 측정 전에 정적 배양을 위해 사용된다. 상기 fixati은 필요 없다에. 그러나, 동적 배양하고, 따라서 역동적 인 환경이 흡수 반응 속도를 측정하는 것이 바람직하다 매체를 흐르는 측정을 위해, 하나는이 하위 프로토콜을 수행 할 수 있습니다. 4.5-4.9이 시료에 도달하는 공기 방울을 방지하기 위해 중요한 단계. <ol><li> 30 분 내측 유리 표면에 세포 타원체 이후 세포 접착 성을 지원하기위한 FCS와 모세관을 채운다. </li><li> 고갈 된 모세 혈관에 남아있는 FCS 코팅은 적어도 12 시간 동안 건조 보자. </li><li> 단계 3.2에 기재된 바와 같이 코팅 된 FCS 모세관 셀 타원체를 소개한다. </li><li> 회전 타원체의 세포 접착의 원인이 5 % CO 2 및 추가 2-4 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모세 혈관을 둡니다. </li><li> 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분을 설정 (도 2 참조). (: 0.89 mm 내경) 형광 염료, 약물 또는 에이전트를 포함하는 배양 배지와 함께 호스의 afflux을 채우기 위해 연동 펌프를 사용합니다. </li><li> 도없고기포 트랩 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분 CT (도 2 참조). </li><li> 제 afflux 튜브에 기포없이 모세관 클램프하고 드레인 호스에 모세관의 다른 쪽 클램프. </li><li> 튠 원하는 값 (예를 들면, 37의 C)에 수조의 액체 온도. </li><li> 원하는 펌프 속도에 연동 펌프를 조정 (예를 들면, 유량 : 10 μL / 분; 펌프 속도에서 모세관 : 25mm / 분). </li><li> ,받는 사람 (개방 루프 설정)에서 펌핑 된 액체를 수집 소스 (폐쇄 루프 설정)로 다시 공급되거나 연동 펌프 (꽉 닫힌 루프 설치)의 튜브에 직접 공급. </li></ol><img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 미세 유체 설치 (개방 루프 꽉 폐쇄 루프); 인레이 : SPH의 조명도립 현미경에 연결된 광 시트 기반 형광 현미경을 이용하여 마이크로 모세관 내의 eroid. (5) 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 레이저 파워와 화상 획득에 대한 통합 시간을 설정한다. </li><li> 단계 5.1에 정의 된 매개 변수가 빛 선량 값 원시 세포에 대해 50 ~ 100 J / cm 2 또는 형광 단백질 인코딩 플라스미드와 형광 염료와 함께 배양 또는 형질 세포에 대한 10 ~ 20 J / cm 2를 초과하지 않도록주의하십시오 (세부 사항 참조. 12 참조를 위해) 광독성을 피하십시오. </li><li> ΔZ에 Z-스택 증가 = 빛 시트 두께가 약 10 μm의 그대로 3 차원 데이터 분석을 위해 바람직하다 5 ~ 10 μm의를 설정합니다. </li><li> 셀 회전 타원체 내에서 초점면의 변화에​​ 의해 하나의 이미지 또는 z-스택의 측정을 수행합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 원고는 광 시트 또는 3 차원 전지 시스템에 최적화 된 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 장치, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)를 설명한다. 세 가지 예시적인 애플리케이션은 (1) 세포 증식 억제 약물의 흡수 및 (화학 치료 효능에 기여 여전히 평가 될 남아) 분해물과의 부분적인 전환, 유전자 부호화 글루타티온 센서 사용시에 의한 산화 환원 상태의 (2)의 측정을 포함 산화제를 첨가하고, (...

잘 확립 방법 (공 초점 또는 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 1-4, 구조화 된 조명 현미경 5,6) 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 이외에 3D 촬상 7,8의 방법에 유용한 것으로 입증했다 9. 특히 관심 신약 개발 연구 10,11 위해 점점 사용 3 차원 세포 배양, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)에의 응용이다. 또한, SPIM 심지어 장기간 노출 또는 반복적 인 측정에 저조도 투여는이 평면이 광에 노출되는 샘플의 각면의 측정하므로, 시료의 생존을 유지하는 데 필요한 특수한 방법이다. 이것은 각각의 초점면의 검출 샘플 전체가 켜져 다른 현미경 기법과 대조적이며, 광 도즈 합까지 다양한 평면의 기록시되도록 시료 (12)를 손상시킬 수있다. </p&gt; 광 시트 현미경 또는 SPIM는 원통형 렌즈의 사용에 의해 또는 (리뷰 참조 참조. 08) 흥미로운 레이저 빔을 스캔하여 어느 관측 경로에 수직 한 방향으로 샘플의 조명에 기초한다. 이것은 종종 특별한 샘플 챔버 13,14 또는 매트릭스를 필요로 예를 들면, 아가 로스 7,15 특별한 고가 현미경으로 구현. 이러한 시스템에 대한 대안으로서 SPIM위한 비교적 단순한 조명 장치가 개발되고 있으며, 종래의 도립 현미경 (16) (도 1 참조)에 적응. 약 100 μM의 필드의 깊이에 걸쳐 6-10 μm의 두께의 광 시트에이 원통형 렌즈 (0.08 : 50mm, 개구 초점 길이)로 8mm의 직경을 확대하고 초점 레이저 빔 이루어져 . 샘플은 현미경 대물 LEN 앞에 배치 600-900 μm의 내경의 직사각형 모세관에있는형광 검출을위한 발. 이러한 주요 기능은 현재 완성 유지하기위한 형광 검출 (동일한 광로에 사용 (축 방향) 샘플 조명광 시트의 동기 조정하고, 대물 렌즈를 회전시키기위한 진보 된 마이크로 모세관 접근법을 사용함으로써 최적화된다 변위의 길이, 따라서 필요한 양과 비용을 최소화 기계적 피드 보정)하고, 형광 염료, 약제 또는 약물의 응용을위한 마이크로 유체 시스템의 적응을 필요로한다.

<table><tbody><tr><td>Microtiter plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>MCF-7 cell line</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 cell line</td><td></td><td></td><td>Cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Green cytotoxicity dye</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Capillary</td><td>VitroCom&amp;nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Sample preparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision data aquisition software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Used with driver PDL800-B</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone tubes</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양에 최적화되어 설명 된 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 용 모듈 등 다세포 종양 타원체 (MCTS). SPIM 여기 모듈 모​​양 및 샘플 수직 현미경의 검출 경로 광 시트에 의해 조명되도록 광을 편향시킨다. 시스템은 조명광 시트의 동기 조정뿐만 아니라 형광 검출에 사용되는 대물 렌즈에 의해, 시료 (도 회전시키는 마이크로 모세관 접근 의해 고급 버전에서) 유지하는 직사각형 모세관의 사용을 특징으로한다 형광 염료, 소량의 약제 또는 약물의 응용 프로그램에 대한 마이크로 유체 시스템의 적응에 의해. 이 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제공하고, 몇 가지 기술적 인 세부 사항이보고됩니다. 대표적인 결과는 업 (1)의 측정치를 포함산화제의 첨가시 세포 증식 억제 약물 (독소루비신) 및 분해 생성물과의 부분적인 전환의 유전자 인코딩 글루타티온 센서를 이용하여, (2) 산화 환원 측정을 수행하고, (3) 개시 및 억제시 세포 괴사 라벨링 미토콘드리아 호흡 사슬. 기존 시스템에 비해 본 SPIM 모듈의 차이점 및 이점이 논의된다.

실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양 이전에 배양 MCF-7 세포 회전 타원체 (8 μM 독소루비신 (doxorubicin), 6 시간)의 Z-스택 스캔은 그림 3에 나와있다.이 세포 흡수 및 독소루비신 (17)의 분포와 그 분해 산물 (18, 19)에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 내측 회전 타원체 분야 분해물에 의해 방출 된 녹색 형광이 세포질 막 <s...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

9.7K 조회수.  Aalen University.  단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다. 

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

칩에 Lensless 형광 현미경

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

생화학

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

면역학 및 감염병학

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

공학

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...