Name: real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

우리는 APC 최소 / + 마우스의 유전자형에 대한 잉 유에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 INSERM에서 자금과 국립 보건원에서 보조금 (CA057621 및 AI053194)에 의해 지원되었다.

주 : 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), UCSF의 승인 절차에 따라 수행 하였다. 모든 촬상 실험 비 생존 절차이었고 동물은 화상 획득의 종료 후 즉시 안락사시켰다. 마우스의 1 세대 참고 : APC 유전자에 돌연변이를 들고 APC 최소 / + 마우스는, 자발적으로 소장에서 50 ~ 100 선종을 개발한다. <ol><li> 크로스 APC 최소 골수 세포를 감지하는 C-FMS 프로모터에서 EGFP을 표현하는 C-FMS-EGFP 라인 ACTB-ECFP의 액틴 프로모터에서 ECFP을 표현 라인, 또한과 / + 마우스. ACTB-ECFP 및 C-FMS-EGFP 이형 동물 형광을 감지하는 데 사용됩니다. </li><li> 이미지를 명확하게 검출 선종에 연령 3 ~ 4 개월에 마우스를 사용합니다. </li></ol> M의 2 준비수술 전에 aterials 참고 : 현미경 셋업의 세부 이전 된 6,7 설명했다. <ol><li> 현미경 <ol><li> 가열 담요를 켭니다. 488 nm의 여기 및 고체 405 nm의, 561 nm의 및 640 nm의 레이저에 대한 아르곤 레이저를 켭니다. 현미경의 전원을 켜고 회전 디스크 제어 장치, AOTF, 레이저 제어 장치, 카메라 컨트롤러. </li><li> LED가 빨간색으로 바뀌 현미경 셔터를 엽니 다. 컴퓨터와 카메라 소프트웨어를 켭니다. </li></ol></li><li> 이미징 플랫폼 <ol><li> 무대 인서트가 깨끗한 지 확인합니다. 그렇지 않으면, 비누와 물로 후 건조 깨끗. </li><li> 이 커버 슬립을 가지고 삽입물을 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다. 무대에서 삽입을 놓고 알코올 와이프로 청소. </li><li> 실험실 테이프를 이용하여, 상기 스테이지의 오른쪽으로 가열 블랭킷 첨부. </li><li> 코 콘에 고무 다이아 프램의 무결성을 확인하고 necessar하면 변경y를 입력합니다. 위치 및 거즈 랩 테이프를 사용하여 동물에 이소 플루 란 마취 전달을위한 코 콘을 수정합니다. </li></ol></li><li> 이소 플루 란 마취 시스템 <ol><li> 이소 플루 란 탱크를 채우십시오. </li><li> 진공 켜고 / 분 1.2 L로 조정합니다. </li><li> 분무기에 증류수를 추가하고 이소 플루 란 시스템에 분무기를 연결합니다. </li><li> 산소 분석기를 켜고 이소 플루 란 시스템에 연결합니다. 산소 탱크의 전원을 켜고 산소 분석기는 100 %가 표시되는지 확인합니다. / 분 0.2 L에 O이 흐름을 조정합니다. </li><li> 질소 탱크를 켜고 / 분 0.8 L의 흐름을 조정합니다. 산소 분석기는 21 %가 표시되는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 수술 도구 및 플랫폼의 준비 <ol><li> 비누와 물로 해부 집게와 가위의 청소 2 쌍. </li><li> 뜨거운 비드 살균기를 켜고는 250 ° C에 도달 할 수 있습니다. 30 초 동안 수술 도구를 소독. 이를 식혀 보자. </li><li> 수술 벤치에 실험실 담그는 배치. </li><li> 수술 플랫폼으로 스티로폼 뚜껑을 사용합니다. 실험실 술고래의 조각으로 커버. 마우스를 면도 후 변경 실험실 술고래의 두 번째 조각을 준비한다. </li><li> 덮여 스티로폼 뚜껑에 마취 라인 코 콘을 배치하고 일부 테이프 (안 실험실 담그는)에 스티로폼 뚜껑에 부착 장소에 보관하는 코 콘의 양쪽에 두 개의 바늘을 사용합니다. </li><li> betadine, 알코올 잎사귀, 멸균 거즈, 슈퍼 접착제, 현미경 슬라이드, 전기 면도기, 및 실험실 테이프 4 개를 조립합니다. </li></ol></li></ol> 주사의 3 준비 <ol><li> 후드에서 인슐린 주사기 준비 (28 G X ½)에 2,000 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ 스톡의 AF647 - 복합 LY-6G (GR1) 항체 (1 ㎎ / ㎖)의 7 μL로 ) 복고풍 궤도 주입. 이 동물에서 개발 빈혈 꼬리 정맥 difficu를 만드는 것이므로 레트로 궤도 주사 APC 최소 / + 생쥐에서 권장지금이 피부를 통해 검색 할 수 있습니다. </li><li> 대장의 연동 운동을 저해 이미징 전에 1 ㎎ / ㎏ 피하 (SC)에 150 ㎕의 PBS에 희석 아트로핀 주사 초 인슐린 주사기를 준비합니다. </li></ol> 이미지에 대한 소장의 4 준비 <ol><li> 유도 챔버로 마취 회선이 오픈하고, 수술 테이블과 현미경에 라인이 닫혀 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 챔버에 동물을 전송합니다. 마취 챔버를 닫고 (21 % O 2) 4 %로 이소 플루 란을 켭니다. </li><li> 마우스 깊이 천천히 (5-6 분 후) 통기성이 때, 그 측면에 수술 스테이지로 전송하고 GR1 항체 용액 및 / 또는 덱스 트란 용액 레트로 궤도 상을 주사. </li><li> 수술 플랫폼에 연결된 마취 라인을 엽니 다. 마취 실에 줄을 닫고 마취 콘에서 코와의 뒷면에 마우스를 넣어. </li><li> 이소 플루 란을 줄4 %에서 2.5 %로 농도. </li><li> 마우스가 아니라 그것의 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 테스트하여 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 안과 윤활 연고를 추가합니다. </li><li> 실험실 테이프를 추가하여 수술 단계로 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여 복부 표면에서 머리를 제거합니다. 또한 인수하기 전에 산소 측정기의 위치를​​ 왼쪽 뒷다리에서 머리를 제거합니다. 수술 단계에서 실험실 담그는를 제거하고 머리의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 하나를 교체합니다. </li><li> 알코올 잎사귀와 betadine와 복부 표면을 소독. </li><li> 마우스의 한 측면에서 SC (3.2) 아트로핀 용액을 주입한다. </li><li> 피부를 통해 1cm 복부 정중선을 절개하여 가위에 의한 복막 및​​ 포셉 한 쌍을 확인합니다. 조심스럽게 소장의 3-4센티미터을 끌어와 이미지에 하나 또는 여러 개의 종양을 식별합니다. </li><li> 유리 MICR을 가지고oscope 슬라이드와 위치를 상단에 종양 그것에 소장의 루프. </li><li> 슬라이드에 부착하는 소장을 따라 몇 위치에 어떤 슈퍼 접착제를 추가합니다. 접착제가 마를 때까지 한 분을 기다립니다. 공 초점과의 현지화를 촉진하기 위해 종양을 가리키는 슬라이드에 선을 그릴 수있는 마커를 사용합니다. </li></ol> (5) 위치 결정 스테이지에서 마우스 및 준비 이미지 획득을위한 <ol><li> 사지에서 랩 테이프를 제거합니다. </li><li> 현미경 단계에 마취 라인을 열고 수술 플랫폼을 닫습니다. </li><li> 아래로 복부 측면과 코 콘에서 코와 현미경 단계로 조심스럽게 마우스를 전송합니다. 일부 실험실 테이프로 마취 라인을 고정합니다. </li><li> 재 위치 커버 미끄러 창 중 하나의 중앙 부위를 위하여 마우스 및 / 또는 슬라이드. 조심스럽게 실험실 테이프로 슬라이드 아래로 테이프. </li><li> 마우스의 왼쪽 사지에 산소 농도계 프로브를 연결합니다그 마음과 호흡과 산소 포화도 수준을 따릅니다. </li><li> 저체온증을 피하기 위해 가열 블랭킷와 마우스를 포함한다. </li><li> 이미징 1.5 %로 2.5 %에서 이소 플루 란 농도를 낮 춥니 다. </li></ol> μManager 소프트웨어를 사용하여 이미지의 6 취득 <ol><li> 구성 설정에 이미지 품질을 개선하기 위해 2500 rpm으로 CSUX 속도를 증가시킨다. </li><li> 10X 0.5 NA 또는 20X 0.75 NA Fluar 렌즈 목표를 선택하는 목적 드롭 다운 메뉴를 사용합니다. </li><li> 색상 드롭 다운 메뉴에서 레이저 405 nm의를 선택합니다. </li><li> 라이브 클릭하고 현미경으로 초점을 조절합니다. </li><li> 자동 화상 극단적 화소 값에 기초하여 표시 화상의 최대 및 최소 픽셀 강도를 조정하는 자동 클릭. 디스플레이 이미지의 픽셀 세기의 히스토그램은 메인 윈도우의 하단의 그래프로 표시됩니다. </li><li> 에서 파이퍼 제어판 창에서 카메라 노출을 조정시계의 수를 (하나의 시계가 33.333 밀리 초입니다) 변경. </li><li> 신호가 낮은 노출 너무 밝은 경우, 현미경 제어부를 이용하여, 레이저 강도를 감소시킨다. </li><li> 488 nm의, 561 nm에서 640 nm의 레이저 라인에 대한 신호 강도를 확인합니다. 레이저 자체의 제어 유닛 (488 nm 내지 561 nm의) 또는 현미경 제어부와 레이저 강도를 조정한다. </li><li> 멀티 D 획득 창에서, 시점 박스에 체크 및 시점의 개수 및 원하는 시간 간격을 입력하세요. </li><li> , Z-스택 상자를 선택하십시오 &quot;상대 Z&quot;를 선택하고 현재 위치에 Z 스타트 및 Z 엔드 기준을 정의합니다. 참고 : 10 배 또는 20 배 목표를 들어, 떨어져 각각 3 Z 평면, 8 μm의 4 μm의 시작합니다. </li><li> 여러 위치 이미징의 복수 위치 (XY) 상자에 체크 표시를 한 후, 편집 위치 목록을 클릭 4-6 다른 위치를 표시합니다. </li><li> 채널 상자를 선택하고 새로운에서 채널을 추가하고 레이저에게 드롭 다운 메뉴와 일반에서 라인을 선택(33.333 밀리의 배수로) 각 채널에 대한 노출에 전자. </li><li> &quot;멀티 D 획득&quot;창에서 이미지를 저장을 선택합니다. </li><li> 폴더를 선택하고 획득 된 모든 이미지는 자동으로 주어진 이름 접두사와이 폴더에 저장됩니다. 참고 : 각 연속 수집은 각 시점에서 각 색상의 각 Z 슬라이스에 대한 개별 TIFF 파일과 같은 별도의 하위 폴더에 저장됩니다. </li><li> 멀티 D 취득 창에서 설정 저장을 클릭하여 모든 설정을 저장합니다. </li><li> 획득을 시작하기 위해 다차원 취득 창에 취득 클릭합니다. </li><li> 산소 농도계 프로브를 사용하지 않는 또는 잘 작동하지 않는 경우 (맥박이 안정 또는 검색 할 하드가 아닌 경우), 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 확인하여 마취의 효율성에게 이미징 절차를 수행하는 동안 매 15 분을 확인합니다. 마우스가 이러한 자극에 반응하는 경우 마취를 조정합니다. </li><li> 인수 후, 이소 플루 란 concent를 증가시켜 마우스를 안락사5 % 배급. 더 호흡 운동이 검출 없으면, 무대에서 마우스를 제거하고 자궁 전위를 수행합니다. </li></ol> Imaris 소프트웨어를 사용하여 이미지의 7 분석 <ol><li> 변환 파일 (보충 그림 1A)를 .ims합니다 <ol><li> 카메라 소프트웨어를 열고 파일 다음 배치 변환기를 클릭합니다. </li><li> 클릭 파일을 추가하고 첫 번째 위치의 첫 번째 파일을 선택합니다. 각 위치에 대해 반복합니다. </li><li> 업로드 된 각 파일에 대해 설정을 클릭하고 Z-스택에 대한 시간 채널에 대해, &quot;C&quot;와 &quot;Z&quot;에 대한 설정 &quot;t&quot;는 그 순서대로 표시되는지 확인합니다. </li><li> 원하는 폴더에 저장합니다. 검색 및 변환으로 새 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 설정을 클릭하고 시작합니다. </li></ol></li><li> 조정 (보충 그림 1B) <ol><li> 특정 변환 된 폴더로 이동하여 첫번째 파일을 엽니 다. </li><li> 디스플레이 조정 창에서 배경을 조정필요한 경우, 각 채널에 대한 최소 수를 수정하여 신호 차단. </li><li> 필요한 경우, 최대 개수 (하부 최대 값이 클수록 신호의 강도)을 변경하여 상기 신호 강도를 조절한다. 참고 : 신호 강도 / 콘트라스트 조정이 더 좋은 시각화를하기 위해 휴대 행동이나 구획의 하이라이트 수 있습니다. 이 결과 자체를 변경하지 않습니다. </li><li> 편집 및 이미지 속성을 클릭합니다. </li><li> x, y 및 z의 값을 변경 (10X 대물, X 및 Y = 0.712, Z = 8 μM를 들어, 20X 대물 렌즈의 경우 : X 및 Y = 0.36, Z = 4 μM). </li><li> 시점을 조정하는 모든 등거리을 클릭합니다. 시작 날짜를 추가하고 인수의 시간을 시작합니다. 종료 날짜를 추가하고 수집 (보충 그림 1C)의 종료 시간. </li><li> 영화를 감상하려면 재생 버튼을 클릭합니다. </li><li> 편집을 클릭하고 흐린 이미지를 삭제하는 시점을 삭제합니다. </li><li> 두 개의 분리 된 인수의 도게에 가입하려면거기는 한 영화로, 첫 번째 영화의 마지막 시점에 가서 편집 클릭&gt; 두번째 파일을 추가하는 데 시간이 포인트를 추가합니다. </li></ol></li><li> 동영상으로 저장 (보충 그림 1D) <ol><li> 녹음을 클릭 .MOV 확장과 공의 압축 요소를 선택합니다. </li><li> 저장을 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다. 염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장의 장막 측으로부터 촬상는 도전적이다. 말라가 매우 평활근 세포에 의해 표현되기 때문에 상피 세포에 초점을 맞춘 것은 특히 액틴 ECFP 기자 쥐, 일부 지역에서는 어려울 수 있습니다. 두 개의 광자 공 초점 현미경은 현미경에 비해 깊은 조직 관통하는 이점을 갖고 있지만, 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경은 장내 상피 구조의 좋은 시각화를 획득하기에 충분히 강력하다 것을 알았다. 장점 오F 회전 디스크 현미경 공 초점 해상도 저하없이 매우 빠른 수집 및 고유 감도 능력을 포함한다. 이러한 특성은 몇몇 시점 인해 움직임 아티팩트 삭제 될 경우에도 동적 프로세스의 관찰, 광 손상을 최소화하고, 비교적 약한 형광 분자 이미징 할 수 있도록. 장막 측면에서 이미징 소장은이 때문에 기관의 내생 연동 운동의 도전이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 아트로핀의 피하 주사를 촬상 전에 주어지고, 효율적 움직임이 감소된다. 그러나, 연동 운동이 대장에서 더 광범위하게, 그러나 잘 직감이 부분에서 상당히 어려운 촬상 렌더링 아트로핀 처리에 의해 억제되지 않는 것이 중요하다. 결장의 평활근 층에 소장 ompared 더욱 수축 것으로 보인다 c를 다소 두드러진다. 따라서, 그것을액틴 ECFP 기자 마우스의 상피 세포에 집중하는 것은 거의 불가능하다. 더욱이, 이들 내인성 운동 이외에, 장기 드 리프팅이 발생할 수 있지만,이 경우 후방 드리프트 보정에 카메라 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 침습적 영상 실험의 또 다른 주요 과제는 마취 살아 있고 건강한 한 가능한 마우스를 유지하는 것입니다. 부위는 복강을 개방함으로써 도달된다. 따라서 프로 인해 복막의 무결성 최대 40 시간 동안 수행 될 수 유방 종양의 영상을 위해 사용 된 것보다 더 침습적이다. 열린 복강 함께 할 최대 인수는 6 시간 이었지만, 마우스 너무도 이상 획득이 가능 할 수있다, 여전히 고통의 명백한 징후와 살아. 본 연구에서는 골수 세포 따라 동작 할 수 있고, 형광 리포터 생쥐와 같은 형광 색소 공역 t를 사용하여 소장 내 종양 분석레이서 또는 항체. 이 접근법은 또한 Tregs 같은 다른 세포 유형, 그것이 유방 종양 연구에서 사용 된 바와 같이, 각각은 Foxp3-EGFP 또는의 CD11c-DTR-EGFP 또는 Fsp1-EGFP 리포터 생쥐를 사용하여 수지상 세포 또는 섬유 아세포를 관찰에 사용할 수있는 여섯 . 또한, 호중구 이외의 세포 집단에 대해 형광 항체 또한 IV 주입 될 수 있고, 셀의 행동은 또한 저산소증과 같은 서로 다른 조건에서 분석 될 수있다. 이러한 실험은 화학 요법이나 표적 치료와 치료 후 그 기질 세포의 동작에 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 창자 암의 다른 마우스 모델에서 종양 진행의 다른 단계에서 사용될 수있다. APC 최소 / + 마우스는 마우스가 짧아 수명을 가지고 있기 때문에 악성으로 진행되지 않는 경우에만 장 선종 성 용종을 개발한다. 그것은 더 AGG과 다른 장내 암 모델에서 골수 세포의 동적을 연구하는 흥미로운 일이 될 것이다이러한 K-RAS에서 APC 돌연변이뿐만 아니라 19 ~ 21 또는 22 SMAD4 유전자를 돌연변이를 들고 마우스로 ressive 및 침습적 종양.

절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다. 의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐 5의 조직 내에서 세포 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이 4 색은, 다중 영역은 마이크로 렌즈 효과 회전 디스크 촛점 시스템은 유방 종양 6 내의 간질 세포를 연구하기 위해 디자인되었다. 이 방법은 장기의 연속 영상을 구현하고 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 (a) 급 이미지 획득, (b) 장기 마취, (c) 상이한 세포 유형을 따르는 네 가지 색상 취득, (D), 형광 표지 등의 여러 장점을 포함 다른 종양 구성 요소 및 다른 종양 미세 환경의 재치 (E) 관찰같은 마우스를 힌 것은 마우스 변동성 7-9로 마우스를 방지 할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다른 세포 행동은 종양의 진보적 인 단계를 표시하는 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 중심 폴리오 중간 T 종양 유전자 (PyMT) 모델에서보고되었다. (Foxp3의 EGFP 형질 전환 유전자에 의해 시각 Tregs) 혈관에 근접 우선적으로 마이그레이션 규제 T 림프구 수지상 (의 CD11c-DTR-EGFP), 암 관련 섬유 아세포 (Fsp1 + / +-EGFP) 및 골수 세포 (C-FMS 반면, -EGFP)은 종양 덩어리 내에보다 종양 주변부에서 높은 운동성을 나타낸다. 급성 전신 저산소증의 상태에서 세포는 다른 마이그레이션 : Tregs는 6 계속 이동 골수 세포는 대조적으로 마이그레이션 중지합니다. 또한, 동일 마우스 모델에서, 종양은 단계와 그 독소루비신 감도 변화를 도시 한 약물 분포를 약물 반응, 및 독소루비신 관련된치료는 종양 세포의 골수 CCR2 의존적 채용 리드. 따라서, 라이브 영상도 현장에서 약물 반응에 대한 통찰력과 chemoresistance 10, 11의 생물학을 높일 수 있습니다. 선종 성 용종증 대장균 (APC) 유전자 돌연변이는 일반적으로 인간의 대장 선종 및 암 (12)과 대장 암 (13)에 대한 매우 높은 위험을 수여 가족 성 선종 성 용종증 (FAP)에있는 APC 유전자 결과의 단일 사본의 돌연변이에서 발생합니다. 마우스 변형 APC 최소 / +는 APC 유전자의 코돈 850의 절단 돌연변이를 수행하고 자발적으로 모든 소장 14 ~ 16에 걸쳐 여러 장 선종을 개발하고 있습니다. 복강을 여는 부위에 액세스하기위한 필요가 있기 때문에 소장의 장기의 intravital 이미징 때문에 절차의 침습성의 도전이다. 단기 라이브 영상 성udies는 이전에 건강한 장 (17, 18)에 간행되었지만, 장내 종양의 장기 직접 관찰은보고되지 않았습니다. 수술 이전 화상 유방 종양 6,10 사용의 intravital 스피닝 디스크 현미경 시스템을 사용하여 설계 및 소장의 장막면을 통해 종양 시각화 정제되었다. 이 논문에서, 프로토콜은 하나의 APC 최소 / + 마우스를 사용하여 소장 종양 내 골수 세포의 행동을 수행 할 수 있다는 설명한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline Buffer</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td><td>UCSF Monoclonal antibody core</td><td></td><td>Stock 1 mg/ml. Use at 7 &amp;mu;g/mouse</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Use at 1 mg/kg mouse</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 in. insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blanket</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Turn ON 30 min before use</td></tr><tr><td>Cotton tipped apllicators 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia system</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage insert</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox oximeter, software and sensors</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC 최소 / + 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.

ACTB-ECFP; APC 최소 / +의 소장에서 회전 디스크 초점 현미경, 비 종양 및 종양 조직을 이용하여 C-FMS-ECFP 마우스는 장막 표면에서 시각화 될 수있다. 촬영 후, 카메라 소프트웨어 분석 및 수집 (보충 그림 1)을 조정하는 데 사용됩니다. 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다의 정맥 주입 및 LY-6G 항체 컨쥬 게이트 647, 후 혈관과 백혈구가 각각 (도 1)을 검출 할 수있다. 림프 조직의 집계하고 골수 세포의 전체를 쉽게 볼 수 있습니다 Peyer의 패치 (그림 1A). 소장의 지하실은 혈관 및 골수 세포 (도 1A 및 1B)에 의해 둘러싸여있다. 종양 조직 혈관 종종 더 많은 골수 세포 침투 및 소낭의 구조 w 이하엘 종양의 크기에 따라 (도 1a 및도 1b) 조직. 676 (취득 10 배 0.5 NA (그림 1A) 및 20 배 0.75 NA Fluar 렌즈 (그림 1B)를 사용하여 수행 할 수 있지만, 우리는 큰 지역의 인수를 허용 밝습니다 10X 0.5 NA Fluar 렌즈로 최상의 성능을 얻을 X 676 μm의)와 조직에 최대 70 μm의 이미지를 제공 할 수있다. 평활근 액틴 발현 층 ECFP 때로는 어려운 장 상피 (도 1B, 우측 판넬)에 포커스를 렌더링 할 수있다. 애니메이션 / 비디오도 2에 도시 된 바와 같이 종양에서 골수 세포 역학은 몇 시간 동안 실시간에 따라 될 수있다. 호중구 (GR1 + 세포) 소낭을 둘러싸고, 혈관 순환시키고 조직 기타 골수 세포, 주로 대 식세포 순찰 반면 및 (애니메이션 / 비디오 그림 2) 덜 운동성이다. APC 최소 / + 생쥐에서 비 종양 및 종양 조직의 회전 디스크 공 초점 얻어 1 대표 사진을 그림. (A) APC 최소 / +의 장막 표면에서 소장 상피 세포의 4 색 사진 (10 배 Fluar, 0.5 NA 렌즈) ACTB-ECFP, 정맥 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다 민을 받았다 CFMS-EGFP 마우스 (적색) 및 LY-6G 647 복합 항체 (흰색). 왼쪽 패널은 비 종양 상피 세포를 표시하고 오른쪽 패널은 동일한 APC 최소 / +에서 종양 보여줍니다 ACTB-ECFP을, CFMS-EGFP 마우스. 골수 세포는 녹색과 상피 세포는 파란색으로 표시됩니다. C-FMS + 세포의 클러스터는 Peyer의 패치 (흰색 화살표), 스케일 바 = 100 μm의. (B) 4 색 사진 (20X Fluar, 0.5 NA의 비 종양 장 조직에서 볼 수있다ACTB-ECFP; APC 최소 / +의 장막 표면에서 소장 상피 세포의 렌즈) CFMS-EGFP의 종양. 왼쪽 패널에서 여러 번 긍정적 인 GR1 +의 C-FMS + 세포는 종양 조직에서 검출된다. 오른쪽 패널은 어려운 장 상피, 스케일 바 = 50 μM에 초점을 렌더링 할 수 액틴-ECFP를 발현하는 평활근 층의 사진을 보여준다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51916/Animated-Video_Figure_2.mov" target="_blank">애니메이션 / 비디오 그림 2</a> . APC 최소 / + 마우스에서 3mm 선종에서 골수 세포 역학.의 장막 표면에서 소장 상피 (10 배 Fluar, 0.5 NA 렌즈)의 4 색 경과 APC 최소 / + ; ACTB-ECFP, CFMS-EGFP 마우스 공동 주입 2,000 형광 kDa의 덱스 트란 - 로다 민 (적색) 및 LY-6G 647 복합 항체 (흰색)와 함께. 골수 세포가 녹색과상피 세포는 파란색으로 표시됩니다. 지하실 주변의 골수 세포가 이동되지 않습니다. 일부 호중구 (흰색 GR1 + 세포) 조직에서 순찰된다. 이 2 시간 수집하고 영화는 295 시간을 가속화하고있다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51916/Supplementary Figure 1.tif" target="_blank">보충도 1</a> . 취득 분석 카메라 소프트웨어의 스크린 샷. (A) 우선, 파일 .ims 확장자로 변환 할 필요가있다. (B) 다음에, 표시 이미지가 이러한 특정 신호로서, 조정될 수는 증가 될 수 있고, 배경이 저하 . (C)의 날짜 및 시간이 필요. 실시간 동영상을 얻기 위해 조정할 수 (D)를 취득 동영상으로서 저장 될 수있다.

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K 조회수.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

비디오: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

연구

암 연구학

Implanted Stabilized Window를 사용한 쥐 췌장 영상

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

저자 스포트라이트: 첨단 생체 내 이미징을 통한 췌장 질환 이해의 혁명 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

면역학 및 감염병학

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

생체공학

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

의학

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

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