질량분석법을 사용한 인간 뇌 오가노이드의 분자 이미징

뇌 오가노이드의 질량 분석 이미징(MSI)을 위한 고급 방법이 개발되어 이러한 모델 내에서 대사 산물 분포를 매핑할 수 있습니다. 이 기술은 초기 발달 및 질병 단계에서 뇌 대사 경로와 대사 산물 서명에 대한 통찰력을 제공하여 인간의 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해를 약속합니다.

뇌 오가노이드 모델은 인간의 뇌 발달 및 기능을 연구하기 위한 강력한 도구 역할을 합니다. 최첨단 기술인 질량 분석 이미징(MSI)을 사용하면 특정 분자 프로브 없이도 지질, 당, 아미노산, 약물 및 이러한 오가노이드 내 대사 산물과 같은 다양한 분자의 공간 분포를 매핑할 수 있습니다. 고품질 MSI 데이터는 세심한 시료 준비에 달려 있습니다. 고정제가 중추적인 역할을 하지만, 글루타르알데히드, 파라포름알데히드 및 자당과 같은 냉동 보존제와 같은 기존 옵션은 의도치 않게 조직 대사 산물에 영향을 미칠 수 있습니다. 최적의 고정은 액체 질소에서 급속 동결을 수반합니다. 그러나 소형 오가노이드의 경우 더 적합한 접근 방식은 인큐베이터에서 오가노이드를 직접 가열된 임베딩 솔루션으로 전환한 다음 드라이 아이스 냉각 에탄올에서 동결하는 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 동결 절편 전에 포딩하는 것인데, 기존 옵션은 매트릭스 증착 및 이온화를 방해할 수 있기 때문에 MSI와 호환되는 재료가 필요합니다. 여기에서는 인간 뇌 오가노이드의 고해상도-MALDI-MSI를 위한 최적화된 프로토콜이 제시되며, 여기에는 질량 분석법을 사용한 시료 준비, 절편 및 이미징이 포함됩니다. 이 방법은 아미노산과 같은 작은 대사 산물의 분자 분포를 높은 질량 정확도와 민감도로 보여줍니다. 따라서 뇌 오가노이드에 대한 보완적인 연구와 함께 초기 뇌 발달, 대사 세포 운명 궤적 및 독특한 대사 산물 서명을 제어하는 복잡한 과정을 조명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 오가노이드 내 분자의 정확한 위치에 대한 통찰력을 제공하여 3D 뇌 오가노이드 모델의 공간 조직에 대한 이해를 풍부하게 합니다. 이 분야가 계속 발전함에 따라 MSI를 활용하여 뇌 오가노이드 및 복잡한 생물학적 시스템을 탐구하는 연구가 증가할 것으로 예상되며, 이에 따라 인간 뇌 기능 및 발달의 대사 측면에 대한 이해가 심화될 것으로 예상됩니다.

일차 조직 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 오가노이드 모델^1,2,3은 장기 특이적 기능을 밀접하게 모방한 3차원 모델을 제공하여 인간 발달, 질병 메커니즘 및 약물 발견에 대한 연구를 지원함으로써 인간 생물학 연구를 발전시켰습니다 ^4,5. 이러한 맥락에서 뇌 오가노이드의 복잡성을 밝히는 것은 생리학적 및 병리학적^{뇌 발달을} 이해하는 데 매우 중요하며^6,7 질량 분석 이미징(MSI)^8,9과 같은 기술이 필요합니다. 기존의 질량 분석법과 구별되는 MSI는 단일 조직 섹션 내에서 수백에서 수천 개의 생체 분자를 직접 표지 없이 매핑할 수 있어 특정 분자 프로브 없이 지질, 펩타이드, 아미노산, 약물 및 대사 산물과 같은 분자의 공간 분포에 대한 자세한 통찰력을 제공합니다^10,11. 또한 MSI 분자 이미지를 조직학적 및 면역염색 섹션에 공동 등록하여 조직 형태, 세포 특이성 및 분자 함량에 대한 포괄적인 관점을 제공할 수 있습니다.

MSI는 오가노이드 연구에 대한 중요한 약속을 가지고 있으며, 질병의 분자 기초, 유전-표현형 관계 및 환경 자극에 대한 반응에 대한 통찰력을 제공합니다 12,13,14,15. 제약 산업에서 MSI는 전임상 모델^11,16에서 약물 흡수, 분포, 대사 및 제거에 대한 분석을 용이하게 합니다. 또한, 약리학적으로 활성화될 수 있는 생체 변형 대사 산물을 해결하는 데 도움이 됩니다¹⁷.

MSI 방법 중 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI), 탈착 전기 분무 이온화(DESI) 및 2차 이온 질량 분석법(SIMS)이 우세합니다 9,18,19,20,21. 이 중 MALDI-MSI는 다목적성, 넓은 질량 범위, 직접 분석 기능 및 다양한 조직 특이적 화합물과의 호환성이 두드러집니다²². 그러나 그 잠재력에도 불구하고 뇌 오가노이드 연구에서 MALDI-MSI의 응용 프로그램은 아직 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 간극을 해소하기 위해 뇌 오가노이드의 고분해능 MALDI-MSI(HR-MALDI-MSI) 분석을 위한 맞춤형 프로토콜이 도입되어 조직 보존, 매트릭스 선택 및 이미징 조건을 최적화하여 고품질 데이터의 신뢰할 수 있는 획득을 보장합니다¹⁵. 이 상세한 프로토콜은 HR-MALDI-MSI의 기능을 보여주며, 연구자들에게 이 기술의 힘을 활용하여 오가노이드의 대사 환경을 전례 없이 자세히 탐구할 수 있는 추가 무기고를 제공합니다.

프로토콜의 일반적인 오버플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 뇌 오가노이드 절편 준비

1. 이전에 발표된 보고서^23,24에 따라 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 뇌 오가노이드(배양 3-60일에 도달하면 2-3mm 크기)를 준비하고 넓은 보어 팁을 사용하여 원하는 시간에 수집합니다.
   1. 준비된 오가노이드를 CaCl₂ 및 MgCl₂ 가 없는 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 실온에서 3회 세척하여 배지를 헹군 다음 실온에서 증류수로 매우 빠르게 세척하여 DPBS의 염을 헹굽니다.
2. 젤라틴(DPBS 100mL에 10mg)을 교반하고 가열하여 차가운 생선 껍질에서 젤라틴 용액 10%를 70-80°C에서 2시간 동안 준비한 다음 용액을 37°C 인큐베이터로 30분 동안 이동하여 기포를 제거하고 오가노이드가 자란 인큐베이터의 온도와 평형을 이룹니다.
   참고: 각 실험에 대해 젤라틴을 신선하게 준비하는 것이 좋지만 필요한 경우 최대 1주일(4°C에서 보관) 동안 사용할 수 있습니다. 젤라틴은 실온에서 응고되며 액체가 되기 위해 포매 용액으로 사용하기 전에 예열해야 합니다.
3. 작은 피펫 팁으로 플라스틱 몰드(25mm x 20mm x 5mm)의 중앙에 오가노이드를 고정하고 오가노이드가 완전히 잠길 때까지 10% 젤라틴 임베딩 용액을 몰드에 부드럽게 붓습니다(몰드는 대략 절반 정도 채워져야 함).
   1. 차가운 100% 에탄올이 함유된 드라이아이스에 틀을 페트리 접시에 넣어 빠르게 얼립니다(1-2분). 완전히 얼었을 때, 색이 단백색으로 변하는 것으로 입증되면, 페트리 접시에서 오가노이드 젤라틴 블록을 꺼내 알루미늄 호일로 싸거나 주석 컵에 넣어 수분 농도를 방지하기 위해 밀봉하고 냉동 절편이 준비될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
4. 동결 절편을 위해 오가노이드가 포함된 플라스틱 블록을 -20°C에서 -25°C의 극저온 챔버 내에 10-15분 동안 놓고 챔버 온도와 평형을 이룹니다. MSI용 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드(ITO 슬라이드)에 냉동 및 해동 마운트를 사용하여 오가노이드를 14μm 섹션으로 절단합니다.
5. 질량 분석기에서 구조적으로 균일한 단면을 즉시 스캔하거나 용기에 밀봉하고 -80°C에서 보관하여 나중에 연구할 수 있습니다.

2. MALDI-MSI를 위한 매트릭스 준비 및 응용

1. MALDI-MSI의 경우, 슬라이드를 분사하고 조직 단면을 다양한 대사 산물을 이온화하는 데 도움이 되는 유기 화합물인 매트릭스로 코팅합니다²⁵. 다양한 종류의 분자를 이미징하기 위해 다양한 매트릭스가 사용됩니다. 따라서 먼저 연구에 가장 적합한 매트릭스를 선택해야 합니다.
   참고: 이 연구는 미토콘드리아 대사 경로와 관련된 작은 대사 산물 및 아미노산의 국소화 및 분포에 초점을 맞추었으며 그에 따라 매트릭스를 선택했습니다(지질 매핑은 Cappuccio et al.을 참조하십시오).¹⁵.
2. 먼저 -80°C에서 ITO 슬라이드를 꺼낸 후 즉시 슬라이드를 건조기에 20분 동안 넣어 표면의 대기수 결로를 최소화합니다.
3. 500 Da²⁶의 m/z 미만에서 백그라운드 신호를 방해하지 않고 관심 분석물의 강력한 신호를 제공하므로 작은 대사 산물에 적합한 매트릭스인 N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride(NEDC)를 준비합니다. 가열된 공압 분무기를 사용하여 슬라이드 건조 후 오가노이드 섹션에 70% 메탄올의 10mg/mL NEDC 용액을 분사합니다.
4. 노즐 온도 = 75 °C, 노즐 속도 = 1,250 mm/min, 펌프 유량 = 100 μL/min, 통과 횟수 = 8, 트랙 간격 = 2.5 mm, 가스 유량 3L/min, 건조 시간 = 10초 및 10psi 질소 가스 압력으로 매트릭스 분무기 매개변수를 설정합니다.

3. MALDI-MSI 계측

1. 뇌 오가노이드 대사산물을 시각화하기 위한 고분해능 MALDI-MSI 플랫폼을 달성하려면 이중 이온 깔때기 인터페이스가 있는 MALDI 이온 소스를 질량 분석기에 장착하십시오.
2. 349nm 파장, 1kHz의 반복률, 약 1.3-1.4μJ의 펄스 에너지를 가진 연결된 Q-스위치, 주파수 3배 Nd 레이저를 사용합니다.
3. 과잉 샘플링을 방지하려면 레이저를 직경이 ~15μm인 스폿 크기로 초점을 맞춥니다.
4. 샘플을 MALDI 주입기 스테이지에 부착합니다. 고압 이온 깔때기를 7.4-7.5 Torr에서 작동 및 유지하고 저압 이온 깔때기를 1.6-1.8 Torr로 유지하십시오.
5. 604kHz, 80V0-피크 및 780kHz, 191V0-피크의 무선 주파수 전압을 각각 고압 및 저압 이온 퍼널에 적용합니다.
6. 낮은 질량 범위에서 작은 대사 산물에 대한 감도를 개선하려면 MALDI-MSI 소스의 저압 및 고압 깔때기의 RF 진폭을 각각 약 20% 및 15%로 줄이십시오.
7. 질량 분해능을 70,000으로 설정합니다. MALDI 주입기 소프트웨어에서 측정할 영역과 픽셀 크기(25μm/픽셀)를 선택합니다.

4. MALDI-MSI 데이터 수집 및 데이터 분석

1. 음이온 및 양이온 모드 모두에서 80-900의 m/z 범위의 데이터를 수집합니다. 14μm 오가노이드 절편에 대해 픽셀당 25μm의 측면 해상도로 샘플을 스캔합니다.
2. 질량 분석기의 이온 주입 시간을 250ms로 설정하고 자동 이득 제어(AGC)가 꺼져 있는 동안 프로필 모드에서 FTMS(Fourier Transform Mass Spectra)를 획득합니다²⁶.
3. NEDC 매트릭스 피크를 내부 온라인 질량 보정으로 사용하여 ±5ppm 이상의 질량 정확도를 얻을 수 있습니다.
4. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다. MSI 스펙트럼 데이터를 소프트웨어로 직접 가져온 다음 컨볼루션 알고리즘을 사용하여 기준선 보정을 수행하고 총 이온 수(TIC)를 사용하여 데이터를 정규화합니다.
5. Δm/z = 0.01 또는 ±5ppm의 빈 너비를 사용하여 원시 데이터 파일에서 이온 이미지의 특징 목록을 생성하여 질량 결함 및 픽셀 커버리지를 기반으로 m/z 이미지를 구별합니다.
6. 개별 대사 산물 이온 종에서 가색(Jet) 또는 RGB(적색-녹색 및 청색) 이미지를 생성합니다. MALDI-MSI에서 얻은 원시 데이터 파일의 m/z 목록을 HMDB(Human Metabolome Database)(이론적 m/z 대비 질량 허용 오차 <5ppm)에 업로드하여 대사 산물을 식별합니다.
   참고: LC-MS/MS 데이터에서 얻은 대사체의 정확한 질량과 예측된 공식 및 구조는 대사체학 데이터베이스(예: HMDB, Metlin)를 쿼리하여 대사산물 비교 및 식별을 수행하는 데에도 사용됩니다.

다음은 MSI를 사용하여 분자(대사) 이미징을 최적화하는 프로토콜입니다(그림 1, Cappuccio et al.도 참조).¹⁵. 가장 신뢰할 수 있는 데이터와 조직 형태학적 보존은 연속 절편의 조직학적 염색에 의해 확인된 바와 같이 차가운 생선 껍질에서 추출한 10% 젤라틴으로 달성되었습니다. 60일 인간 뇌 오가노이드의 생선 젤라틴 임베딩을 사용하여 MSI를 사용하여 크렙스 주기 관련 대사 산물을 매핑하여 공간 분포를 입증했습니다(그림 2).

전반적으로 최적화된 프로토콜은 차가운 생선 피부에서 추출한 10% 젤라틴을 선호하는 임베딩 소재로 사용하고 NEDC 매트릭스 스프레이 설정을 미세 조정하여 이미지 해상도를 향상시키는 등 일관된 결과를 제공했습니다. 뇌 오가노이드에서 감지된 작은 대사 산물은 이 조직의 분자 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

그림 1: 인간 뇌 오가노이드 대사체 연구의 일반 파이프라인. 유도 만능 줄기세포를 통해 개인의 섬유아세포에서 유래한 오가노이드는 LC-MS 및 MSI에 사용되어 대사 산물의 공간적 분포를 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 크렙스 순환 관련 대사산물 매핑. MSI를 사용하여 건강한 대조군에서 파생된 60일 오가노이드를 사용한 크렙스 주기 관련 대사산물의 식별 및 분포. 헤마톡실린 및 에오신 염색이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인간 두뇌 오가노이드의 고해상도 MALDI-MSI를 위한 정교한 프로토콜은 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 중요한 단계를 꼼꼼하게 처리합니다. 샘플 보존이 가장 중요한 것으로 부상하고 있으며, 조직 균열 및 손상을 방지하기 위해 가온 포식 용액과 건식 얼음 냉각 에탄올을 포함하는 대체 동결 방법이 제안되고 있습니다. 이 프로토콜은 인간 뇌 오가노이드(organoids)와 같은 미세한 크기의 조직에 가장 효과적이다¹⁵. 최적 절단 온도(OCT) 화합물 및 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE)과 같은 임베딩 재료는 매트릭스 증착 및 이온화에 대한 간섭으로 인해 주의해야 합니다. 대신, 차가운 생선 껍질에서 추출한 10% 젤라틴이 최적의 임베딩 솔루션으로 강조되어 극저온 절편 중 조직 무결성을 보존하는 효능을 보여줍니다¹⁵. 또한, 매트릭스의 선택과 건식 분무와 같은 증착 기술은 낮은 m/z 작은 대사 산물의 비편재화를 최소화하고 이미지 해상도를 향상시키는 데 필수적입니다.

프로토콜의 견고성과 신뢰성은 인간 뇌 오가노이드¹⁵에서 광범위한 분자의 성공적인 검출 및 시각화에 의해 입증되었으며, 이는 분자의 공간 분포 및 잠재적인 생물학적 중요성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이러한 발견은 뇌 오가노이드 내의 복잡한 분자 환경에 대한 이해를 크게 향상시켜 뇌 발달 및 기능을 뒷받침하는 중추적인 신호 경로와 대사 과정을 밝힙니다.

현재 데이터는 다양한 종의 국소화에 대한 새로운 통찰력을 제공하지만, 이 연구에 사용된 Spectroglyph MALDI 이미징 소스는 아직 단일 세포 수준의 해상도(현재 ~10-20μm)를 달성하지 못했습니다. Bruker의 timsTOF 및 Water의 MRT와 같은 다른 플랫폼은 5μm에서 단일 세포 분해능을 제공할 수 있으므로 실험에 사용할 기기를 염두에 두는 것이 중요합니다.

이러한 제약에도 불구하고 뇌 오가노이드의 고해상도 HR-MALDI-MSI는 상당한 가능성을 가지고 있습니다. 오가노이드 내에서 대사산물 및 지질 분포를 매핑할 수 있는 기능은 오가노이드 발달 및 성숙에 중요한 대사 세포 운명 궤적, 경로 및 뚜렷한 서명에 대한 고유한 지점을 제공합니다. 이 방법론은 기존 조직학과 분자 분석 사이의 다리 역할을 하여 게놈, 표현형 및 환경 반응 간의 상호 연결을 더 깊이 이해할 수 있도록 합니다.

요약하면, 인간 뇌 오가노이드의 HR-MALDI-MSI에 최적화된 프로토콜은 오가노이드 모델을 탐색하는 연구자들에게 귀중한 자산입니다. 이 방법은 중요한 단계를 꼼꼼하게 해결하고, 문제를 해결하고, 한계를 인정함으로써 뇌 발달 및 기능을 뒷받침하는 분자 복잡성을 추가로 설명하기 위한 토대를 마련합니다. MSI 기술이 발전하고 접근성이 높아짐에 따라 초기 인간 발달, 질병 모델링 및 신약 개발에 대한 이해를 높일 준비가 되어 있습니다.

저자는 공개할 내용이 없습니다.

이 연구에 대한 유용한 토론과 논평을 해주신 Maletic-Savatic 실험실의 구성원, 특히 대학원생인 Danielle Mendonca와 NMR 및 Drug Metabolism Core에 대한 Baylor College of Medicine Advanced Technology Core의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국립 정신 건강 연구소(National Institute of Mental Health, 1R01MH130356 - M.M.S), 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, R61/R33HD099995 to F. L.), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, P50HD103555)의 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 병리학 핵심 시설 및 인간 질병 세포 모델 핵심 시설. 또한, 이 연구는 NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A, grant RAD01013(M.M.S.), NASA를 통해 NASA의 연방 기금으로 부분적으로 자금을 지원받았으며, "MORPH: Multi-Organ Repair Post Hypoxia"(M.M.S.)라는 제목의 계약 80ARC023CA004 및 Autism Speaks(G.C), Simons Foundation Pilot Award(M.M.S.) 및 Cynthia and Antony Petrello를 통해 이루어졌습니다.
기부금(M.M.S).