식물 조직에서 Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I의 정제

이 프로토콜은 식물 조직에서 Photosystem I(PSI) - Light Harvesting Complex I(LHCI)을 분리하는 방법을 설명합니다. PSII와 함께 PSI는 산소 광독립영양생물에서 빛을 화학 에너지로 변환하는 역할을 하며 ~1의 양자 효율을 가지고 있어 빛 구동 에너지 전달을 연구하는 대상입니다.

이 방법은 기본 안테나인 LHCI(Light Harvesting Complex I)와 함께 광시스템 I(PSI)을 식물로부터 분리하는 데 사용됩니다. PSI-LHCI는 수백 가지의 광 수확 및 전자 수송 인자를 조정하는 대형 막 단백질 복합체이며 자연에서 발견되는 가장 효율적인 광 수확 시스템입니다. LHCI를 구성하는 4개의 LHCA 안테나 단백질에 의해 흡수된 광자는 흥분 상호 작용을 통해 PSI 코어 반응 센터로 전달되고 틸라코이드 막을 가로지르는 광 구동 전하 분리를 용이하게 하는 데 사용되어 광독립영양 유기체의 탄소 고정을 위한 환원력과 에너지를 제공합니다. PSI의 높은 양자 효율은 이 복합체를 빛 구동 에너지 전달을 연구하기 위한 훌륭한 모델로 만듭니다. 이 프로토콜에서 식물 조직은 기계적으로 균질화되고 엽록체는 여과 및 원심분리에 의해 벌크 세포 파편에서 분리됩니다. 그런 다음 분리된 엽록체를 삼투압으로 용해시키고 틸라코이드 막을 원심분리를 통해 회수하고 세제 n-도데실-베타-말토사이드를 사용하여 가용화합니다. 용해된 물질은 대부분의 엽록소 함유 복합체를 수집하기 위해 음이온 교환 컬럼에 적재됩니다. 더 큰 복합체는 용액에서 침전되고, 작은 부피로 재현탁되고, 주요 엽록소 함유 복합체를 분리하기 위해 자당 구배에 적재됩니다. 생성된 슈크로스 구배 분획은 PSI-LHCI를 포함하는 관심 밴드를 식별하는 것을 특성화합니다. 이 프로토콜은 플랜트 PSI-LHCI의 결정화에 사용되는 프로토콜과 매우 유사하지만 일부 단순화되었으며 Nathan Nelson의 실험실에서 수년에 걸쳐 개발된 방법에 의존합니다.

산소성 광합성은 지구상에서 가장 중요한 화학 반응 중 하나입니다. 빛을 화학 에너지로 변환하는 것은 광계 I(PSI)과 광계 II(PSII)¹의 두 광계의 반응 중심에서 발생합니다(그림 1A). PSI는 35억 년 전에 진화한 크고 보존력이 높은 다중단위체 색소-단백질 복합체입니다 ^2,3. 약 100 개의 엽록소 분자와 약 20 개의 카로티노이드를 포함하는이 복합체는 플라스토시아닌에서 광합성 전자 전달 사슬 ^1,4,5의 말단 전자 수용체 역할을하는 페레독신으로 틸 라코이드 막을 가로 질러 전자의 전달을 촉진합니다 (그림 1B, C). 식물에서 이러한 빛에 의한 전하 분리는 광 하베스팅 복합체 I(LHCI)의 PSI 코어 안테나 안료와 주변 안테나 안료 모두에서 PSI 반응 센터로 전달되는 빛 에너지의 결과입니다(그림 1D). LHCI는 4개의 엽록소 a/b 결합 LHCA 안테나 단백질 ^6,7로 구성된 틸라코이드 막 내의 PSI 특이적 안테나 복합체입니다.

그림 1: 광합성 전자 전달쇄 및 PSI-LHCI 복합체의 전체 구조.(A) 광합성 전자 전달쇄는 4개의 주요 막결합 광합성 복합체와 3개의 용해성 전자 운반체를 포함합니다. 수송 사슬을 통한 전자 흐름 (빨간색 화살표)과 루멘으로의 양성자 펌핑 (검은 색 화살표)은 환원력 (NADPH)을 생성하고 탄소 고정을위한 ATP를 생성하는 데 사용됩니다^{37 , 38 , 39 , 40}. Biorender.com 로 만들어졌습니다. (B) 내강 측에서 식물 PSI-LHCI의 구조. PsaA 및 PsaB는 PSI의 가장 큰 하위 단위이며 복합체의 핵심을 구성합니다. LHCI는 PSI와 관련된 광수확 안테나 복합체이며 4개의 안테나(LHCA1-4)로 구성됩니다. (C) PSI-LHCI 복합체는 150개 이상의 리간드를 조정합니다. 여기에 표시된 것은 엽록소(녹색), 카로티노이드(분홍색), 퀴논(보라색), 지질(주황색) 및 반응 센터의 FeS 클러스터(노란색/주황색)입니다. (D) PSI의 반응 중심은 반응 센터 특수 엽록소 쌍인 P700에서 시작하여 두 개의 부속 엽록소(_A-1A/B)와 다른 한 쌍의 엽록소(A_0A/B)로 나뉩니다. 이러한 엽록소 다음에는 각 분지에서 필로퀴논(일부 간행물에서는 A_{, 1A/B} 또는 Q,_A/B)이 뒤따르고, 그 다음에는 철-황 클러스터 F_x에서 함께 결합한 후 PsaC 소단위에 의해 조정된 두 개의 추가 클러스터, F_A 및 F_B가 뒤따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1966년 식물에서 PSI를 처음으로 분리한 것은 PSI와 PSII 사이의 광 수확 안료 함량의 차이를 밝혀 주었으며, PSI는 PSII에 비해 β-카로틴이 매우 풍부했으며 사이토크롬 f 및 b₆ (사이토크롬 b₆f 복합체의 일부)는 PSI에 단단히 결합되어 있지 않고 틸라코이드 막⁸ 내에서 느슨하게 결합되어 있음을 보여주었습니다. 9년 후, SDS 처리를 통해 분리된 PSI의 부분 변성으로 작은 PSI 소단위체의 해리가 PSI에 의한 NADP+ 광환원을 소멸시키는 것으로 나타났으며, P700 신호와 대부분의 엽록소는 나머지 큰 분자량 PSI 입자 내에 남아 완전한 생물학적 기능을 위한 PSI의 일부 소단위체의 필요성과 PSI 반응 센터의 위치를 확인했다⁹. PSI 코어와 LHCI 사이의 연관성에 대한 연구는 1980년대 초에 처음 발표되었는데, 엽록소 A와 P700의 서로 다른 비율을 포함하는 다양한 크기의 PSI 종의 분리가 관찰되었을 때, PSI와 엽록소 함유 주변 안테나 시스템 10,11,12,13의 연관성을 시사합니다. 그러나 2003년이 되어서야 식물 PSI의 첫 번째 결정 구조가 발표되었습니다¹⁴. 식물 PSI-LHCI의 결정 구조는 식물의 PSI 코어와 시아노박테리아 사이의 놀라운 보존을 강조하고 식물 PSI 코어와 LHCI 안테나 내의 엽록소 배열에 대한 첫 번째 그림을 제공하여 식물 PSI-LHCI 복합체¹⁴ 내의 에너지 전달 경로에 대한 이해를 심화시켰습니다. 지난 10 년 동안 더 많은 플랜트 PSI-LHCI 구조가 결정되어 초 복합체^{15,16,17,18,19}의 구조적 설명에 원자 수준 세부 정보가 추가되었습니다.

PSI는 1에 가까운 양자 효율을 가질 뿐만 아니라 자연에서 가장 음의 환원 잠재력을 자랑합니다^20,21. PSI-LHCI와 그 특성에 대한 완전한 이해는 빛 구동 에너지 전달을 이해하고 미래의 광 수확 기술에 바이오에서 영감을 받은 솔루션을 적용하는 데 필수적입니다. PSI-LHCI 및 많은 서브유닛이 어떻게 효율적인 에너지 변환을 달성할 수 있는지에 대한 이해를 심화시키려면 연구를 위해 분리된 복합체가 활성화되고 전체적이어야 합니다. 이 프로토콜은 이러한 활성 상태에서 복합체의 부드러운 정화를 허용합니다^22,23.

이 방법에서는 식물 조직이 기계적으로 파괴되고 광합성 전자 전달 사슬을 포함하는 엽록체가 원심분리에 의해 분리됩니다. 틸라코이드 막은 하이토닉 엽록체 용해 후 분리된 다음 세제 n-도데실-베타-말토시드(β-DDM)를 사용하여 가용화됩니다. 멤브레인 복합체를 포함하는 가용화된 엽록소는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리하고 PSI-LHCI는 자당 구배 원심분리를 사용하여 추가로 분리합니다. 그래디언트에서 제거하고 분광법으로 특성화하고 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용한 후 복합체를 추가 실험을 위해 준비할 수 있습니다. 이 절차는 친화성 태그를 사용하지 않고 식물에서 PSI-LHCI 복합체를 정제하는 데 사용됩니다. 약간의 변형으로 다른 유기체로부터 복합체를 준비하고, 대체 PSI 복합체 또는 광합성 전자 전달 사슬의 다른 복합체를 안정화 할 수 있습니다. 고해상도 구조 분석에 적합한 PSI 복합체를 얻기 위해 유사한 프로토콜이 사용되었습니다 23,24,25,26,27,28,29,30.

1. 시금치 잎에서 틸라코이드 막의 준비

1. 얼음 위에서 작업하고 이 준비에서 가능한 한 빛에 노출되지 않도록 하십시오. 높은 엽록소 농도가 유지되는 경우 저조도 환경으로 충분하며 가능한 한 많이 샘플을 덮을 수 있도록 주의를 기울입니다. 달리 명시되지 않는 한 4°C에서 모든 원심분리 단계를 수행합니다.
2. 가위를 사용하여 시금치 잎(500g)에서 줄기를 제거하고 잎을 믹서기에 부드럽게 눌러 얼음처럼 차가운 자당, 트리신, NaCl(STN) 완충액으로 완전히 덮습니다(표 1). STN 버퍼의 식물 조직을 10초 동안 두 번(총 20초) 균질화하고 펄스 설정을 사용하여 과열을 방지하기 위해 펄스 사이에 10초를 남겨둡니다.
   참고: 잎에 대한 완충액의 일반적인 비율은 시금치 잎 500g에 대해 1L의 STN 완충액입니다.
3. 차갑게 식힌 큰 비커 또는 기타 용기 위에 무명천 층을 고정하고 혼합된 혼합물을 천에 부어 8겹의 무명천을 통해 세포 파편을 걸러냅니다. 유리 막대나 숟가락을 사용하여 필터의 세포 파편을 저어 용해물이 통과할 수 있도록 합니다.
4. 펠렛 엽록체는 1000 x g 에서 9분 동안 원심분리에 의해 세포 용해물에서 추출됩니다. 엽록체를 1L의 저장성 완충액에 재현탁시킵니다(표 1). 엽록체를 재현탁시키려면 피펫을 사용하거나 엽록체 펠릿을 소용돌이쳐 완충액에 넣고 티슈 그라인더 또는 적절한 크기의 유사한 균질기로 옮깁니다.
   참고: 저장성 용액에 노출되고 조직 분쇄기에서 재현탁액이 재부유되면 엽록체가 용해됩니다.
5. 전분(백색 펠릿으로 수집됨)을 제거하기 위해 500 x g 에서 2분 동안 원심분리기를 사용합니다. 전분 재현탁을 최대한 피하면서 피펫이나 작은 페인트 브러시를 사용하여 상등액으로 다시 펠릿화된 녹색 물질을 부드럽게 재현탁합니다. 용액을 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 틸라코이드 멤브레인을 펠릿화합니다.
6. 피펫 또는 작은 페인트 브러시를 사용하여 멤브레인을 재부유할 만큼만 고염 재현탁 완충액(표 1)의 최소량으로 펠릿화된 멤브레인을 재현탁하고 1.4단계와 같이 균질화기를 사용하여 균질화합니다. 8000 x g 에서 10분 동안 원심분리기
7. 최소량의 STN2 완충액(표 1)에서 이전과 같이 재현탁하며, UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 멤브레인을 재현탁하고 엽록소 함량을 측정하기에 충분합니다. 시료를 1/1000을 80% 아세톤 용액에 희석하고 Porra et ^al.31의 방법을 사용하여 엽록소 농도를 측정합니다.
8. STN2 완충액을 첨가하여 원하는 엽록소 농도(일반적으로 3mg/mL)로 조정하고 2개 또는 3개의 원심분리 튜브에 균등하게 분취합니다. 500g의 잎에서 예상되는 수확량은 약 200mg의 엽록소이지만 출발 물질의 상태에 따라 변동이 예상됩니다. 멤브레인 가용화가 준비될 때까지 -80 °C에서 동결합니다. 이 단계에서 동결된 멤브레인은 최소 6개월 동안 안정적입니다.

2. 멤브레인 가용화

1. 틸라코이드 멤브레인을 β-DDM으로 용해합니다. 10% β-DDM 스톡에서 충분한 세제를 추가하여 6:1 β-DDM 대 엽록소 비율을 달성합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 튜브를 천천히 여러 번 뒤집어 5-10분마다 부드럽게 섞습니다.
2. 120,000 x g 에서 초원심분리기를 사용하여 30분 동안 원심분리기를 사용하여 불용성 물질을 제거합니다. 펠릿을 버리고 후속 단계를 위해 상등액을 보관하십시오.

3. 디에틸아미노에틸(DEAE) 컬럼을 이용한 용출

1. 가용화된 샘플에서 총 엽록소 1mg에 대해 1.5mL 베드 부피를 사용하여 음이온 교환 컬럼을 준비합니다. 컬럼을 준비하고 4°C에서 실행합니다. 링 스탠드에 고정된 기둥에 수지를 붓습니다. 물이나 컬럼 저염 완충액을 추가하는 동안 수지가 가라앉도록 하여 컬럼이 건조되는 것을 방지합니다. 기둥에 기포가 없고 상단이 평평하고 평평한지 확인하십시오.
2. 저염 컬럼 버퍼(표 1)의 두 컬럼 부피(CV)를 사용하여 컬럼을 세척하고 2.2단계의 상층액을 컬럼에 로드합니다. 계속 진행하기 전에 상등액이 컬럼 안으로 완전히 들어가도록 합니다.
3. 컬럼 저염 버퍼의 한 CV에서 컬럼을 세척합니다.
4. 저염 및 고염 컬럼 완충액(5-250mM NaCl; 표 1) 총 6개의 CV 부피로 만들어집니다(즉, 컬럼 베드 부피가 30mL인 경우 90mL의 저염 버퍼와 90mL의 고염 완충액 사용).
   1. 두 개의 비커에 저염 및 고염 완충액을 채웁니다. 저염 완충액을 컬럼에 떨어뜨리면서 물을 채운 튜브를 사용하여 고염 완충액과 저염 완충액 사이에 염교를 만들어 서서히 혼합합니다. 저염 막대를 사용하여 저염 완충액으로 이동하는 고염 완충액이 컬럼에 떨어지기 전에 혼합되고 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 NaCl 그래디언트가 선형이 됩니다. 분수 수집을 시작합니다.
5. 4mL 분획을 수집하고(약 35mg의 엽록소로 시작하는 일반적인 실험의 경우) 그래디언트의 마지막 1/3 주위를 용리하는 짙은 녹색 분획을 결합합니다(그림 2A).

4. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 석출

1. 결합된 엽록소 분획에 PEG6000 천천히 첨가하여 최종 농도 8%가 되도록 합니다. PEG 농도는 약간 다를 수 있습니다. 8%에 도달한 후에도 강수량이 보이지 않으면 강수량이 보일 때까지 PEG 농도를 2% 단위로 증가시킵니다(용액이 흐려짐).
2. 3,214 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상등액을 완전히 버리십시오. 모든 잔류 PEG를 완전히 제거하는 것은 다음 단계에서 우수한 용해를 달성하는 데 필수적입니다. 녹색 침전물을 2-5mL의 컬럼 후 재현탁액에 재현탁합니다(표 1).
3. 틸라코이드가 PEG로 완전히 세척되었는지 확인하려면 4°C에서 18,407 x g 의 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 재현탁 물질의 작은 부분 표본을 회전시켜 물질이 용해되는지 확인합니다. 이 단계에서는 작은 녹색 침전물이 허용되지만 전부는 아니더라도 대부분의 엽록소는 용액에 남아 있어야 합니다. 용해성 부분을 유지하십시오.

5. 자당 그라디언트의 제조

1. 자당 그래디언트 버퍼를 사용하여 5개 레이어(10%, 15%, 20%, 25% 및 30% 레이어)에서 10%-30% 불연속 슈크로스 그래디언트를 준비합니다(표 1). 폴리알로머 원심분리 튜브에 30% 층에서 시작하여 10% 층으로 끝나는 자당 분획을 조심스럽게 층을 이루어 자당 그래디언트를 조립합니다. 원하는 양의 샘플을 적재할 수 있도록 튜브 상단에 충분한 헤드스페이스가 있도록 모든 레이어의 부피를 조정합니다.
2. 4.2단계의 용해성 물질에서 샘플을 자당 그래디언트로 로드합니다. 한 튜브에 170μg의 엽록소와 같을 만큼 충분한 샘플을 로드하고 다른 튜브에 420μg의 엽록소를 로드하여 각 밴드의 균질성을 평가하기 위한 다양한 농도의 그래디언트를 얻습니다(그림 3A).
   참고: 추가되는 샘플의 양은 임의적이지만 일반적으로 약 150-500μg의 엽록소 범위가 적절합니다.
3. 16시간 동안 100,000 x g 에서 그래디언트를 원심분리하여 시료 내의 서로 다른 복합체를 분리합니다.

6. 자당 분획 및 PEG 침전의 제거

1. 원심분리 후 로터에서 기울기를 제거하고 디지털 카메라나 휴대폰을 사용하여 튜브 사진을 찍습니다. 바늘로 바닥의 튜브를 뚫고 내용물을 천천히 배수하여 분획을 분리합니다. 원심분리 튜브에서 다양한 엽록소 함유 분획을 수집합니다.
   참고: 원하는 경우 후속 분석을 위해 샘플을 분주하고 동결할 수 있습니다.
2. 일부 응용 분야의 경우 슈크로스를 제거하는 것이 바람직합니다. 자당을 제거하려면 PEG 침전(또는 겔 여과)의 두 번째 단계를 사용하십시오. PSI-LHCI 분획의 NaCl 농도를 120mM로 조정하고 최종 농도 10%에 PEG6000 추가합니다.
3. 18,407 x g 의 탁상용 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 녹색 펠릿을 30mM Tricine-NaOH pH 8.0, 50mM NaCl 및 0.05% β-DDM에 재현탁합니다.
4. 4°C에서 18,407 x g 의 탁상형 원심분리기에서 5분 동안 시료를 원심분리하여 모든 물질이 용액에 남아 있는지 확인합니다.

7. PSI의 P700 함량 측정

참고: 이 방법은 PSI를 빠르게 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 샘플을 1-1.5의 OD₆₈₀ 으로 희석하고 10mM 아스코르브산으로 어둠 속에서 1시간 동안 배양하여 P700을 완전히 감소시킵니다.
2. UV-Vis 분광계를 사용하여 샘플의 흡수 스펙트럼을 측정합니다. P700 함량 분석을 위해 0.50nm의 데이터 간격과 60nm/분의 스캔 속도로 650nm에서 750nm에 이르는 흡광도를 측정합니다.
3. 샘플을 밝은 빛(350μmols photons/m²/s)에 노출시키고 노출하는 동안 스펙트럼을 다시 측정합니다.
4. 빛 스펙트럼에서 어두운 스펙트럼을 빼면 식물에서 약 702nm에서 P700 백화를 관찰할 수 있습니다.
5. Hiyama 및 Ke ^32,33,34에 설명된 대로 700nm에서의 흡수와 64/mM/cm의 흡광 계수를 사용하여 P700 함량을 측정합니다.
6. Porra et ^al.31에 설명된 방법을 사용하여 총 엽록소 양(엽록소 A 및 엽록소 B)을 측정합니다. 이 농도를 사용하여 엽록소 대 P700 비율을 결정합니다.

이 프로토콜은 3일 동안 식물 조직에서 활성 PSI-LHCI를 분리하고 특성화하는 데 사용됩니다. PSI-LHCI는 먼저 식물 틸라코이드 막을 분리한 다음 β-DDM으로 가용화하여 정제합니다. 멤브레인 준비 단계의 일반적인 수율은 500g의 잎에서 200mg의 엽록소입니다. 이는 사용된 초기 재료에 따라 달라질 수 있습니다.

실험의 2일차와 3일차에서는 음이온 교환 크로?...

이 프로토콜을 사용하여 식물 조직의 PSI-LHCI 복합체를 활성 상태로 정제할 수 있습니다. 시금치 잎이 여기에 사용되었지만, 이러한 방법은 다양한 식물의 제제에 적용 할 수 있습니다^{23, 40}. 모든 경우에 이 프로토콜을 수행하는 동안 복합체를 손상으로부터 보호하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이 준비는 어두운 곳이나 녹색 ...

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Y.M.은 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 상 번호 2034021호와 미국 에너지부(U.S. Department of Energy), 과학국(Office of Science), 기초 에너지 과학실(Office of Basic Energy Sciences), 화학 과학부(Division of Chemical Sciences, Geosciences, and Biosciences)의 지원에 감사를 표합니다. DE-SC0022956. C.G.는 National Science Foundation의 Award No. 00036806의 지원을 받고 있습니다.