배양된 뼈 세포의 지방산 산화 평가

본 프로토콜은 일차 뼈 세포 또는 관련 세포주의 배양에서 지방산 산화 능력을 평가하기 위한 분석을 설명합니다.

조골세포를 분화하여 뼈를 형성하려면 이러한 특수 세포가 뼈 조직을 구성하는 큰 세포외 기질 단백질을 합성한 다음 광물화에 필요한 이온을 농축해야 하기 때문에 상당한 에너지 입력이 필요할 것으로 예상됩니다. 뼈 형성에 필요한 대사 요건에 대한 데이터가 빠르게 등장하고 있습니다. 아직 밝혀야 할 점이 많지만, 중간 신진대사의 혼란이 골격계 질환의 원인이 될 것으로 예상됩니다. 여기에서는 ¹⁴개의 C 표지 지방산을 ¹⁴개의_CO2 및 산용해성 대사 산물로 산화하는 조골세포 세포의 능력을 평가하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 지방산은 섭식 후 또는 지방 조직 저장에서 해방된 후 순환계에서 흡수될 수 있는 풍부한 에너지 비축량을 나타냅니다. T-25 조직 배양 플라스크에서 수행된 이 분석은 지방산 이용에 대한 유전자 이득 또는 기능 상실 및 골량 유지에 필요한 성장 인자 또는 모르포겐 형태의 동화 신호의 영향에 대한 연구에 도움이 됩니다. 글루타민과 같은 아미노산 또는 포도당의 산화를 평가하기 위해 프로토콜을 조정하는 능력에 대한 세부 정보도 제공됩니다.

골수와 골막에 존재하는 전구 세포에서 유래한 조골세포(osteoblast)는 뼈 조직을 구성하는 미네랄화된 콜라겐이 풍부한 기질의 합성과 분비를 담당합니다. 이러한 에너지 비용이 많이 드는 노력을 완수하고 골격 무결성의 평생 유지에 기여하기 위해 이러한 특수 세포는 세포 외 기질 단백질 ^1,2 및 연료 기질에서 필요한 화학 에너지를 수확하기 위해 수많은 높은 막 전위 미토콘드리아를 합성하는 데 필수적인 풍부한 거친 소포체를 유지합니다 ^3,4. 이 후자의 기능의 중요성은 뼈 성장의 중단과 칼로리 제한과 같은 에너지 결핍과 관련된 골감소증 ^5,6의 발달에 의해 예시됩니다. 조골세포가 선호하는 연료원의 정체와 분화 중 또는 동화 신호에 대한 반응으로 조골세포의 대사 요구 사항에 대한 데이터가 부상하고 있습니다 ^7,8.

장쇄 지방산은 혈청에 존재하며 칼로리 섭취 감소 또는 에너지 소비 증가에 대한 반응으로 지방 조직에서 방출되는 화학 에너지의 풍부한 공급을 나타냅니다. 용해도를 높이기 위해 세포막을 통과하고 코엔자임 A와 결찰한 후, 지방 아실-CoA는 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 이중 카르니틴 팔미토일전이효소와 카르니틴-아실카르니틴 트랜스전로카제⁷에 의해 미토콘드리아 기질로 왕복됩니다. 미토콘드리아 매트릭스 내에서 β 산화 기계 사슬은 TCA 회로(트리카르복실산 회로)에 진입하고 등가물을 환원시키는 아세틸-CoA를 생성하는 4단계 공정에서 아실-CoA를 단축합니다. 동물에서 가장 흔한 지방산인 팔미테이트(C₁₆)의 이화작용은 이 경로를 통해 ~131 ATP를 산출하며, 이는 포도당 산화에 의해 생성된 ~38 ATP보다 훨씬 더 많습니다⁷.

방사선 표지된 지질을 사용한 추적 연구는 뼈가 순환 지질의 상당한 부분을 차지하는 것으로 나타났습니다 ^9,10 지질 이화작용에 중요한 효소의 유전적 절제는 조골세포 활성과 뼈 손실의 감소로 이어집니다 ^9,11. 여기에 제시된 프로토콜은 ¹⁴개의 C-표지 지방산을 사용하여 배양된 조골세포가 지방산을 산화 과정의 중간 단계를 나타내는 CO₂ 또는 산 용해성 대사 산물로 완전히 대사하는 능력을 평가합니다. 방사능의 사용이 필요하지만, 이 방법은 간단하고 투자가 제한적이며, 다른 방사성 표지 대사 산물 및 세포 유형의 이점에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 [^1-14C]-올레산을 ¹⁴CO₂ 로 변환하는 것을 지방산 산화 용량의 지표로 사용합니다. 지역 방사선 안전 사무소는 실험을 시작하기 전에 방사성 물질 사용에 대한 프로토콜을 승인했습니다. 모든 방사선 절차는 플렉시글라스 차폐 뒤에서 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되었습니다. 지역 동물 관리 및 사용 위원회(Local Animal Care and Use Committee)는 일차 세포를 사용하기 전에 프로토콜을 승인했습니다.

1. 배양된 조골세포의 지방산 산화

1. 1차 calvarial osteoblasts¹² 또는 Mc3t3-E1과 같은 osteoblastic cell line을 Subculture하고 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 0.1 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM의 T-25 플라스크(5 x 10⁵ cells/flask)에 플레이트를 배양합니다.
   1. 실험에 사용하기 위해 각 처리 그룹(즉, 대조군 및 유전자 녹아웃 또는 비히클 및 약리학적 치료)에 대해 3-4개의 플라스크를 파종합니다. 각 처리 그룹에 대해 추가로 1-2개의 플라스크를 파종하여 세포 수 또는 단백질 농도로 정규화합니다. 37°C의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 5%_CO2로 배양 플라스크를 배양합니다.
2. 플라스크가 합류할 때까지 2-3일 동안 세포를 배양합니다. 배양 배지에 50μg/mL의 아스코르브산과 10mM의 β-글리세롤 포스페이트( 재료 표 참조)를 첨가하여 융합 배양이 분화되도록 유도하고 최대 14일 동안 추가로 배양을 계속합니다.
   참고: 성장 인자 치료가 계획되어 있는 경우 하룻밤 사이에 혈청 결핍(0.5%-1% FBS 추가)이 필요합니다. FBS의 비율을 낮추면 배양물에서 방사성 표지되지 않은 지질의 양이 제한되고 외인성 성장 인자의 최대 효과를 얻을 수 있습니다. 호르몬의 효과를 검사해야 하는 경우 숯을 제거한 FBS를 사용합니다.
3. 실험 전날 여과지, 15mm x 30mm 고무 슬리브 마개 및 폴리프로필렌 중앙 웰( 재료 표 참조)을 준비합니다.
   1. 1cm x 10cm 크기의 여과지 스트립을 팬 모양으로 접어 폴리프로필렌 중앙 우물의 양동이에 넣습니다. 고무 슬리브 스토퍼의 중앙을 통해 폴리프로필렌 중앙의 암을 잘 누르고 폴리프로필렌 중앙을 T-25 플라스크로 잘 내립니다. 그런 다음 슬리브 스토퍼로 플라스크를 밀봉합니다(그림 1).
      알림: 폴리프로필렌 중심이 배양 매체와 접촉하지 않도록 폴리프로필렌 중심의 위치를 잘 조정해야 할 수도 있습니다. 실험하는 동안 폴리 프로필렌 중앙 웰은 여과지가 라벨링 매체에 닿지 않도록하고 ¹⁴CO₂를 수집 할 수 있습니다.
4. 실험 당일, 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 인산염 완충 식염수(플라스크당 5μL)에 20% 소 혈청 알부민을 0.1μCi/mL의 [^1-14C]-올레산(0.6μL/플라스크)과 혼합하여 [^1-14C]-올레산을 소 혈청 알부민(BSA)에 접합합니다.
   1. 그런 다음 튜브를 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 37°C에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 oleic Acid-BSA conjugate에 대해 1-2개의 추가 플라스크를 준비합니다.
5. 조직 배양 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 1.5mL의 새로운 혈청 결핍 배지로 교체합니다(1.2단계).
6. 각 플라스크에 대해 5.6μL의 올레산-BSA 용액(1.4단계)을 2μL의 100mM 카르니틴 용액 및 1mL의 배양 배지와 결합하여 라벨링 용액을 생성합니다. 배양 플라스크에 라벨링 용액을 추가합니다. 초과 용액을 유지하여 분석에 추가된 총 활성 계수를 읽습니다.
   참고: 라벨링 용액은 세포 수 또는 단백질 농도를 정량화하기 위한 추가 플라스크에 첨가되지 않습니다.
7. 플라스크에 여과지가 들어 있는 폴리프로필렌 중앙 웰을 내린 다음 고무 마개로 캡을 씌웁니다.
   알림: 폴리프로필렌 중앙 웰이 배양 배지와 접촉하지 않는 것이 중요합니다. 이것은 CO₂ 대신 방사성 표지된 지방산으로 여과지의 교차 오염으로 이어질 것입니다.
8. 세포 배양을 37°C에서 5%_CO2로 3시간 동안 배양합니다.
9. ¹⁴CO₂ 를 수집하려면 150 μL의 1 N NaOH를 폴리 프로필렌 중앙 웰에 주입하여 여과지를 적시고 200 μL의 1 M 과염소산을 배양 매체에 주입한다. 고무 마개를 통해 바늘을 밀어 NaOH와 과염소산을 주입합니다.
   알림: 플라스크에서 고무 마개를 제거해서는 안 됩니다. 이로 인해 ¹⁴CO₂ 가 누출될 수 있습니다. 주입의 용이성을 위해 플라스크를 똑바로 세운 다음 주입이 완료된 후 배양 위치로 돌아갑니다.
10. 플라스크를 55°C에서 1시간 동안 배양합니다.
11. 세포 배양 후드에서 플라스크를 식힌 후 엽니다. 핀셋으로 폴리프로필렌 중앙 웰에서 여과지를 제거하고 섬광 바이알에 3-4mL의 섬광 액체( 재료 표 참조)에 넣습니다.
    참고: 100μL의 초과 라벨링 용액을 섬광 액체 3-4mL에 첨가하여 총 활성 수를 측정합니다. 100μL의 기저 배양 배지([^1-14C]-올레산 제외)를 3-4mL의 섬광 액체에 첨가하여 백그라운드 활성을 측정합니다.
12. 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 배양한 후 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 분당 카운트(cpm)로 측정합니다( 재료 표 참조).
13. cpm 결과를 정규화하려면 각 배양 조건에 대해 표지되지 않은 T-25 플라스크에서 단백질 추출물을 분리합니다. 5mL의 인산염 완충 식염수로 세척하고, 각 플라스크에 1mL의 RIPA 세포 용해 완충액을 첨가하고, 세포 스크레이퍼로 세포 표면을 긁어냅니다.
    1. 피펫과 원심분리를 사용하여 19,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 RIPA 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 BCA 분석 프로토콜에 따라 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
    2. 섬광 계수기에서 판독된 원시 cpm을 단백질 농도로 나누어 생성된 ¹⁴CO₂ 의 정규화된 cpm을 얻습니다(표 1).
14. 섬광 바이알, 세포 배양 물질, 배지, 주사기 등을 폐기하기 위한 현지 요구 사항을 따르십시오. 작업 표면의 오염을 제거하고 현지 요구 사항에 따라 방사능 닦기 테스트를 수행합니다.

2. 산 녹는 대사 산물 수집

알림: 위의 1.8단계에서 사용된 3시간의 배양 기간은 세포가 흡수한 모든 [^1-14C] 완전 올레산을 CO₂로 산화시키기에 충분한 시간이 아닐 수 있습니다. 지방산 산화 경로의 플럭스는 산 용해성 분획의 방사능을 측정하여 평가할 수도 있습니다.

1. 처리된 각 T-25 플라스크에서 산성화된 매체 1mL를 수집하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. 60μL의 20% BSA와 100μL의 16M 과염소산을 추가합니다.
3. 소용돌이치고 4 °C에서 밤새 부화합니다.
4. 다음으로, 20,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 와류 및 원심분리기를 합니다.
5. 섬광 액체에 상등액 200μL를 첨가하고 활성을 측정합니다(단계 1.12).
6. 단백질 농도 또는 DNA 측정에 대한 판독을 정규화합니다(단계 1.13.1).

3. 포도당 산화 또는 아미노산 산화의 측정

1. ¹⁴개의 C 표지 올레산을 ¹⁴개의 C 표지 포도당 또는 ¹⁴개의 C 표지 아미노산으로 대체하여 이러한 연료 분자의 산화를 측정합니다.
2. 1.1-1.2 단계에 따라 조골세포 배양을 준비합니다.
3. 실험을 시작하려면 조직 배양 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 1.5mL의 새로운 혈청 결핍 배지로 교체합니다.
4. 1mL의 기아 배지에 0.6μCi의 ¹⁴C 표지 포도당 또는 ¹⁴C 표지 아미노산의 라벨링 용액을 준비하고 플라스크에 추가합니다.
5. 1.6-1.13단계를 수행합니다.

카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(Cpt1)과 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-2(Cpt2)의 효소 활성은 미토콘드리아 장쇄 지방산 산화에 필요합니다. Cpt1은 대사 경로의 속도 제한 효소이지만 포유류 게놈에는 세 가지 동형(Cpt-1a, Cpt-1b 및 Cpt-1c)이 암호화되어 있으며 한 동형의 유전적 파괴는 다른 동형의 보상 상향 조절로 이어질 수 있습니다¹³. 대조적으로, Cpt2는 단일 유전자에 의해 암호화됩니다. 그림 2A에 예시된 실험에서, Cpt2의 유전자 절제는 [^1-14C]-올레산이 ¹⁴CO₂로 산화되는 것을 ~60% 감소시키고, 7일 동안 분화된 1차 마우스 calvarial osteoblasts의 배양에서 대조군에 비해 산성 대사 산물의 표지를 ~27% 감소시킵니다. 돌연변이 조골세포에서 올레산을_CO2로 산화시키는 나머지 용량은 과산화솜 산화 또는 ω-산화로 인한 것으로 예상됩니다. 돌연변이 세포에서 산용해성 대사 산물 표지의 상대적 감소가 더 작은 것은 정상적이거나 증가된 지방산 흡수의 결과일 가능성이 높습니다. 실제로, 지방 아실-카르니틴의 풍부함은 Cpt2가 결핍된 조골세포에서 증가한다⁹. 그림 2B에 예시된 실험에서, Wnt1을 과발현하는 야생형 조골세포와 조골세포에서 지방산 산화를 평가하였다⁹. Wnt 신호전달의 활성화는 외인성 리간드(처리 후 잠복기가 필요함)를 사용한 처리가 아닌 유전자 조작을 통해 유도되었기 때문에 분석은 하루 만에 완료되었습니다.

그림 1: 폴리프로필렌 센터 웰과 슬리브 스토퍼의 조립. (A) Whatman 여과지 스트립은 폴리프로필렌 센터 웰의 깊이(~1cm)에 약간 짧은 너비로 절단됩니다. (B) 여과지를 부채꼴로 펴거나 압연한 다음 폴리프로필렌 센터 웰에 삽입합니다. (C) 폴리프로필렌 센터 웰의 암이 고무 슬리브 스토퍼를 통해 밀려납니다. CO₂ 가 빠져나갈 수 있는 마개에 구멍을 뚫지 마십시오. (D) 라벨링 혼합물을 첨가 한 후 폴리 프로필렌 센터 웰과 슬리브 스토퍼를 사용하여 T-25 플라스크를 밀봉합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 1차 마우스 조골세포의 지방산 산화. (A) 카르니틴 팔미토일전이효소-2(ΔCpt2)가 결핍된 대조 조골세포 또는 조골세포 배양에서 [^1-14C]-올레산을 ¹⁴CO₂ (왼쪽 패널) 또는 용해성 산 대사 산물(오른쪽 패널)로 산화. (B) Wnt1을 과발현하는 조골세포의 그래픽 표현은 [^1-14C]-올레산을 ¹⁴CO₂로 산화시키는 증가된 능력을 나타냅니다. 결과는 단백질의 mg과 평균 ± 표준 오차로 정규화된 분당 계수(cpm)로 표시됩니다. *P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 단백질 농도로 정규화된 원시 cpm 데이터. ¹⁴CO₂ 의 원시 cpm 수는 표지되지 않은 플라스크에서 추출된 단백질의 양으로 나누어 정규화됩니다.

위에서 설명한 절차는 측정 된 출력이 NaOH에 담근 여과지에 수집 ^{된 14}CO₂ 및 과염소산으로 배양액의 산성화 후 수집 된 산 용해성 대사 산물이므로 지방산 산화를 직접 평가할 수 있습니다. 형광 표지된 지질 분자 또는 지질 유사체를 사용하는 시판되는 분석 키트는 지질 흡수를 측정할 수 있지만 에너지 생성을 위한 이화작용은 측정하지 않습니다. ¹³C-metabolic flux¹⁴와 같은 다른 이화 작용 측정에는 특수 분석 장비가 필요합니다. 이 분석은 ¹⁴CO₂ 수준만 필요한 경우 하루 만에 완료할 수 있으므로 민감하고 상대적으로 빠릅니다(그림 2). 또는 여과지를 섬광 액체에서 하룻밤 동안 배양하고 두 결과의 결정이 필요한 경우 산성 용해성 대사 산물로 동시에 판독할 수 있습니다. 음성 대조군이 필요한 경우, 연구자는 카르니틴 팔미토일전이효소-1의 비가역적 억제제인 에토목시르(etomoxir)로 세포를 전처리할 수 있습니다. 그러나 에토목시르는 또한 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로카제(adenine nucleotide translocase)와 전자 전달 사슬(electron transport chain)의 구성 요소를 억제하기 때문에 이러한 데이터의 해석에는 주의가 필요합니다^15,16. 조골세포에서 이 분석법은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-2 및 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질-5 기능 상실이 지방산 이용에 미치는 영향 ^9,17 및 외인성 Wnt 리간드 및 인슐린^18,19의 영향을 평가하는 데 사용되었습니다.

방사성 수치의 정상화는 유전자 조작, 성장 인자 치료 또는 약리학적 제제의 추가로 인해 발생할 수 있는 세포 수의 변화를 설명하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 BCA 분석 키트를 유지 관리하거나 단백질을 정량화하기 위한 다른 방법을 보유하고 있기 때문에 단백질 농도에 대한 정규화를 요구합니다. 단백질 정규화를 위해서는 BCA 분석 또는 추가 단백질 정량화를 수행하기 전에 용해물에서 불용성 단백질(콜라겐 및 기타 세포 외 기질)을 제거하는 것이 중요합니다. 이 단계가 없으면 조골세포 분화 중에 생성되는 풍부한 세포외 기질로 인해 결과가 왜곡될 수 있습니다. DNA 함량에 대한 정규화도 가능하지만 추가 시약을 구매해야 할 수 있습니다. 두 경우 모두 [^1-14C]-올레산으로 표지되지 않은 세포 배양 플라스크의 단백질 또는 DNA 함량을 정량화하면 분석의 이 부분에서 방사능 작업에 대한 예방 조치를 제거할 수 있습니다. 여러 실험의 결과를 결합해야 하는 경우 총 활성을 계산하는 것이 중요합니다. 이는 연구 간 cpm 측정값의 차이를 설명할 수 있습니다. 이와 관련하여, 대조군 처리군에 대한 CO₂ 생산 또는 산용해성 대사 산물 수준의 변화 %로 데이터를 표현하는 것은 실험 간의 변동성을 조정하는 편리한 방법입니다.

올레산의 사용은 용해도가 더 높기 때문에 이 프로토콜에 설명되어 있지만 ¹⁴C 표지 팔미테이트도 사용할 수 있습니다. 위에서 지적한 바와 같이, 방사성 표지된 지방산은 ¹⁴C-글루코스 또는 ¹⁴C-글루타민으로 대체될 수도 있습니다. 이 경우 ¹⁴CO₂ 수준 만 평가됩니다. 유사하게, 원발성 갈바리 조골세포는 골수 유래 조골세포, Mc3t3-E1과 같은 조골세포 세포주 또는 파골세포의 배양으로 대체될 수 있습니다.

이 프로토콜의 한계는, 적어도 우리 손에서는, 골격 조직 이식에서 지방산 산화를 평가하는 것이 실현 가능하지 않다는 것입니다(미발표 데이터). 이 시점에서, 이것이 표지된 올레산이 석회화된 매트릭스를 관통하여 충분한 수의 뼈 세포에 의해 흡수되지 못하기 때문인지 아니면 다른 문제 때문인지는 명확하지 않습니다. 그러나, 프로토콜은 지방, 간 및 근육과 같은 연조직의 조직 이식에 사용하기에 적합합니다^20,21. 또한, 이 분석은 실험적 치료가 지방산 이화작용에 영향을 미치는 대사 경로의 단계에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 유형의 분석은 이 분석 결과를 기반으로 합리화할 수 있는 더 비싼 ¹³C-대사 플럭스 실험을 사용해야 합니다.

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

이 연구는 재향 군인 사무국 연구 개발국(BX003724)의 생물의학 실험실 연구 개발 서비스(Biomedical Laboratory Research and Development Service)의 Merit Review Award와 미국 국립 당뇨병, 소화기 및 신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, DK099134)의 보조금으로 지원되었습니다.