長期的な研究の焦点は、ダウン症の神経障害の潜在的な治療法を見つけることです。そして、現在私たちが注目しているのは、知的障害の主な原因であるダウン症の神経新生障害です。ダウン症の神経新生障害は、ダウン症の神経前駆細胞の老化のみによるものであるという一般的な信念に反して、二相性細胞周期の欠陥によって引き起こされることがわかりました。
この論文に記載されているヒトIPSCベースのプロトコルを使用した二相性細胞周期の欠陥の同定は、初期段階で増殖が減少する細胞周期状態と後期段階で細胞周期から抜け出せないことの両方を考慮した、発生可能な治療戦略を推進します。まず、10マイクロモルの岩石阻害剤を完全なヒトiPCS培地、DPBS、細胞剥離溶液、および1ミリリットルあたり25ナノグラムの塩基性線維芽細胞成長因子を添加したフィーダーコンディショニング培地に加えます。すべての試薬を摂氏37度に温めます。
フィーダーにiPS細胞の6ウェルプレートを載せます。分化したコロニーをピペットで取り出し、新鮮で完全なヒトiPS細胞培地を添加します。プレートを摂氏37度に保温し、二酸化炭素インキュベーターに2時間置きます。
インキュベーション後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSでウェルを一度洗浄します。次に、各ウェルに1ミリリットルの細胞剥離溶液を加えます。プレートを摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターに12〜14分間置きます。
倒立顕微鏡で細胞を観察します。ほとんどの細胞が剥がれているが、一部が付着している場合は、プレートを側面から軽くたたきます。カルシウムとマグネシウムを添加した3ミリリットルのDPBSを各ウェルに加え、細胞剥離溶液を希釈します。
5ミリリットルのピペットでは、気泡を避けながら、塊を壊すために2〜3回穏やかにピペッティングを行います。細胞を40マイクロメートルのストレーナに通して50ミリリットルの遠心分離機2に通します。懸濁液を室温で200Gで5分間遠心分離し、真空吸引システムを使用して培地を穏やかに吸引します。
次に、細胞を10ミリリットルのヒトiPS細胞培地に再懸濁します。懸濁液中のすべての細胞を0.1%ゼラチンでコーティングした15cmの皿に移し、二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。細胞を含む培地を遠心分離機2に集めます。
室温で200 Gで5分間遠心分離し、その後、真空吸引システムで培地を穏やかに吸引します。細胞をフィーダーコンディショニング培地1ミリリットルに再懸濁し、1ミリリットルあたり25ナノグラムのBFGFと10マイクロモルの岩石阻害剤を補充します。細胞計数後、ミリリットルあたり30, 000〜50, 000細胞の懸濁液を調製します。
懸濁液をウェルプレートに播種します。2日後、フィーダーコンディショニング培地を神経前駆細胞またはNPC培地と交換します。2日目と18日目に、与えられた通りにメディアを交換してください。
28日目に、プレート内の培地を、10マイクロモルの岩石阻害剤を補充したNPC培地と交換します。次に、プレートを37°Cで二酸化炭素インキュベーターで2時間インキュベートします。インキュベーション後、上清を吸引し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBSでウェルを一度洗浄します。
各ウェルに1ミリリットルの細胞剥離溶液を加えます。次に、倒立顕微鏡で細胞を4倍の倍率で観察します。次に、カルシウムとマグネシウムを補給したDPBSを3ミリリットルをプレートの各ウェルにピペットで入れます。
5ミリリットルのピペットで、懸濁液を優しくピペットで動かし、塊を壊します。細胞懸濁液を50ミリリットルの遠心分離機2の上に置いた40マイクロメートルのストレーナーで濾します。遠心分離機にかけ、前述のように吸引した後、ビタミンAを含むB 27を添加した1ミリリットルの所定の分化培地にペレットを再懸濁します。トリパンブルーと血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。
次に、50, 000個の細胞を適格なマトリックスコーティングされた48ウェルプレートの各ウェルに播種します。33日目に、培養ウェル内の培地を神経分化培地と交換します。ダウン症候群の培養では、同質正倍数体細胞と比較して、TUBB3陽性ニューロンの有意な減少が観察され、85日目には約2倍の減少が明らかになりました。
神経原性初期のダウン症候群培養では、同質正倍数体細胞と比較して、KI67陽性細胞の割合が有意に低く、約4分の1の減少が示されました。神経原性後期では、ほとんどの同質正倍数体細胞が最小限のKI67染色で細胞周期から退出しましたが、ダウン症候群細胞の大部分はKI67陽性のままで、5倍の増加を示しました。Sown症候群と同正正な正倍数体ヒトiPS細胞の2組目では、神経分化の終了時にダウン症培養におけるTUBB3陽性ニューロンレベルの低下とPAX6陽性神経前駆細胞の上昇が確認され、TUBB3陽性ニューロンが2倍に減少し、PAX6陽性細胞が2倍以上に増加したことが確認されました。
