PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

運動ニューロンの異なるサブタイプを生成する可能性は、筋萎縮性側索硬化症などの現代の運動ニューロン疾患のモデル化に特に関連しています。この方法により、短時間で精製工程を行わずに、脊髄または頭蓋の同一性を持つ運動ニューロンに対して非常に硬直性の細胞集団を取得することができます。簡便培養条件下で誘導多能性幹細胞またはiPSCからヒト運動ニューロンを生成することは、運動ニューロン疾患の薬物スクリーニングを容易にし得る。

プログラミング転写因子の誘導発現は、iPSCリポジトリから神経細胞、骨格筋、グリア細胞などの別の細胞タイプを生成するために使用することができる。NILおよびNIP iPSCライン生成では、ヒトiPSC培養をカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSでリンスしてから、細胞解離試薬で細胞を摂氏37度で5~10分間処理します。細胞が培養容器から脱離し始めた場合、P1000ピペットを使用して細胞を3~4回軽く手動で解離します。

細胞を15ミリリットルのチューブに移し、カルシウムとマグネシウムを数えずに新鮮なPBSで最終体積を最大10ミリリットルにします。遠心分離によって6番目の細胞に10回回収し、エレクトロポレーションキットから100マイクロリットルのバッファーRでペレットを再懸濁します。トランスポーザブルベクタープラズマDNA4.5マイクログラムと、トランスフェクション用ピギーババトランスポザーゼ血漿DNA 0.5マイクログラムを加えます。

示されたパラメータを使用してメーカーの指示に従ってセルエレクトロポレーションシステムでトランスフェクト。次に、6ミリメートルマトリックスコーティング皿に10マイクロモルROCK阻害剤Y-27632を添加したヒトiPSC培地に細胞を播種します。トランスフェクションの2日後、抗生物質中の細胞を少なくとも7〜10日間保持する培養培地に、1ミリリットル当たり5マイクログラムのブラシシジンを加え、トランス遺伝子を統合していない細胞を対抗する。

インキュベーションの終了時に、異なる数の遺伝子および異なる統合部位を有する細胞で構成される混合集団として安定したトランスフェクトされた細胞を維持するか、単一クローンを単一のクローンに分離する。先に述べたように、ニューロゲニン-2のトランスジーン特異的プライマーを用いたRT-PCRによって評価されるドキシサイクリン誘導の1ミリリットル当たり1マイクログラムのトランス遺伝子の効果的な発現を可能にするために、追加の皿を準備する。この段階では、新しいNILとNIP iPSCラインの在庫も、ヒトiPSC用の凍結培地で凍結する必要があります。

運動ニューロン分化のために、DMEM/F12培地の5つの容積を含む15ミリリットル管に細胞を集めることができるように実証されるように解離試薬と安定的にトランスフェクトされた細胞培養物を解離する。遠心分離後、ヒトiPSC培地中の細胞を、カウント用のマイクロモルROCK阻害剤を補充した。マトリックスコーティングされた皿の上に細胞を6.25倍の10倍の4番目の細胞/センチメートル平方密度で播種します。

次の2日間は、上清をドキシサイクリンを補充した新鮮な分化培地に置き換えます。2日目に、ガンマ分泌酵素阻害剤、血管内皮成長因子受容体阻害剤、及びドキシシリンを添加した神経基底B27培地に培地を変更する。5日目に、示されているように細胞を解離し、DMEM/F12培地の4ミリリットルで取り離された細胞をカウントします。

ピペッティングは、細胞の完全な解離のために重要です。メーカーの指示に従って細胞凍結培地中の運動ニューロン前駆物質のアリコートを凍結し、遠心分離によって残りの細胞を収集する。10マイクロモルROCK阻害剤を添加した神経培地中のペレットを再懸濁する。

ポリオルニチンラミニンコーティングされたマイクロスライドに細胞をシードし、ポリマーカバースリップを10倍から5分の5の細胞/センチメートル平方密度でカバーします。6日目には、細胞を支持表面から切り離すことなく下流分析まで培養のための阻害剤を含まない新鮮な神経培地に慎重に交換する。多能性マーカーオクタマー結合転写因子4またはOTC4の均一な発現は、汎ニューロンマーカーニューロン特異的クラス3βチューブリンTUJ1陽性がない場合にゼロ日目に分化細胞培養で観察することができる。

3日目には、OCT4陽性細胞の数が強く減少することが明らかである。これは、区別する iPSC のサブセット内の TUJ1 の表現によってミラーリングされます。5日目には、TUJ1と後天的な神経形態の一貫した発現を示す集団ではOCT4の発現は認められていない。

運動ニューロン前駆細胞の再めっき後7日後の免疫染色分析は、TUJ1と成熟した運動ニューロンマーカーコリンアセチルトランスファーーゼの均一な発現を明らかにする。iPSC NIL由来のニューロンは、電圧依存性ナトリウム電流と電圧依存性カリウム電流の表示に成功しました。現在のクランプモダリティでクランプされたiPSC NIL由来の運動ニューロンの80%は、プラス60ピコアンプ以上の電流パルスを注入するとスパイクトレインをトリガーすることができます。

記録された細胞の50%以上で繰り返し発火するために必要な最小電流は、約マイナス38ミリボルトのスパイク閾値と約8ヘルツの40ピコアンプでの平均発火頻度を有する40ピコアンプをプラスし、iPSC NIL由来脊髄運動ニューロンが成熟ニューロンの典型的な機能的特性を示すことを示唆している。脊髄および頭蓋運動ニューロンは、病理学的突然変異を運ぶ制御されたiPSCまたはiPSCから導き出され、これらの細胞は、研究モデルまたは薬物スクリーニングのために使用することができる。この方法は、異なる運動ニューロンユニットがALSによって差し合いの影響を受ける理由を理解するのに役立ちます。