救命救急に不可欠な血液バリア医療機器は、血栓の形成、機能の低下、全身性血栓症のリスクの増加に直面することがよくあります。臨床用抗凝固薬は血栓症を緩和しますが、出血リスクを高めます。生体材料表面でのタンパク質の吸収は、凝固と炎症を引き起こします。
ゾウラポリマーウォッシュスルーコーティングがECMO回路タンパク質吸収に及ぼす影響を調査しました。現在、患者に影響を与えることなく医療機器の血栓症を選択的かつ効果的に阻害する市販の抗凝固剤はありません。さらに、さまざまな医療機器について、数日から数週間、さらには数か月にわたる期間にわたって、表面コーティングとエンジニアリングの有効性を最適化し、実証することが不可欠です。
私たちの新しい科学的目標には、コーティング塗布に対するさまざまな前処理アプローチの影響の評価、コーティング溶液を介した洗浄の取り扱い方法がコーティングの均一性に与える影響の評価、非特異的タンパク質の汚れに対する代替の防汚ポリマーグラフトの影響の調査、および最適化されたコーティングがin vivoで血栓症を制限する能力を決定することが含まれます。肺回路を洗浄するには、脱イオン水で30%メタノールを20分間再循環させます。.これに続いて、10%メタノールを脱イオン水に再循環させ、次に脱イオン水のみでさらに20分間再循環させます。
ろ過されたハウスエアを低流量に設定して肺回路を2時間乾燥させます。洗浄して乾燥させた肺回路を紫外線オゾン分解プラズマ発生器に入れます。発電機を閉じ、装置の電源を入れて、20分間のプラズマ曝露を開始します。
プラズマへの曝露が完了したら、直接コーティングステップに進み、表面鎖の再配列やプラズマ相互作用によって生成される反応部位の損失を防ぎます。デバイスの表面改質を受けている間に、1.2グラムの塩酸ドーパミンをガラスビーカーの600ミリリットルのトリスバッファーに溶解します。続いて、スルホベタインメタクリレートモノマーを1〜15ドーパミン塩酸塩とスルホベタインメタクリレートの比率で溶解します。
次に、5ミリモルの過ヨウ素酸ナトリウムを液滴としてコーティング溶液に加えます。マグネチックスターバーを使用し、150RPMに設定されたスタープレートを使用して、溶液を完全に混合します。次に、大きなシリンジを使用してコーティング溶液で肺デバイスをプライミングし、回路を引き出して充填します。
回路の一方の端をクランプし、もう一方の端からプライミングしながら、回路アクセスコネクタを介して気泡を導き出します。回路が完全にプライミングされたら、デバイスを紫外線光源の下に2時間置きます。プライムデバイスの端を10分ごとに上下に向きを変えて、溶液を攪拌します。
光処理後、回路を完全に排出します。すすぎ排水が透明になるまで、60立方センチメートルのシリンジを使用してプライミングと排水を繰り返して、すべてのサンプルを脱イオン水で穏やかにすすぎます。最後に、脱イオン水で満たされたデバイスを、剖検と表面分析のために摂氏4度に設定された冷蔵庫に保管します。
フィブリノーゲン吸収試験を行うには、ファイバーマットサンプルをウェルプレート内の3ミリグラム/ミリグラムのフィブリノーゲン溶液1ミリリットルに移し、プレートを摂氏37度で60RPMで90分間インキュベートします。サンプルをPBSで洗浄します。それらを新しいウェルに移し、各ウェルに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSA溶液を追加します。
さらに90分間インキュベートします。次に、サンプルをPBS溶液でさらに3回洗浄し、新しいウェルに移します。次に、PBS溶液中の1〜1000希釈分の西洋わさびペルオキシダーゼ標識フィブリノーゲン抗体を各ウェルに加えます。
サンプルを30分間インキュベートして洗浄した後、新しいウェルに移します。新しいウェルでは、0.03%過酸化水素を含むクエン酸リン酸緩衝液に500マイクロリットルのオフェニレンジアミンを添加し、pH 5.0に30秒間隔で調整します。サンプルを光から離して30分間インキュベートします。
ペルオキシダーゼとオフェニレンジアミンの反応を止めるには、各ウェルに500マイクロリットルの1つの正常塩酸を追加します。各ウェルから上清をキュベットに移します。UV可視分光光度計を使用して、492ナノメートルで上清の吸光度を測定します。
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイキットを20分間解凍します。アッセイキットが解凍されている間に、プールした成人ヒト血漿を調製して、多血小板血漿を取得します。多血小板血漿を調製するには、ヒト血漿サンプルチューブを483 Gで遠心分離融解し、血漿を2つの領域に分離します。
血小板が豊富な血漿を含む下部の 3 分の 1 と、血小板の少ない血漿を含む上部の 3 分の 2 を特定します。チューブの下部にある血小板ペレットと、血小板の乏しい血漿を含む上部の3分の2を慎重に除去します。.チューブを振って、血小板ペレットを上部血漿に穏やかに分散させます。.
試験前に、多血小板血漿に塩化カルシウムを添加して、クエン酸塩の影響を逆転させます。次に、ファイバーマットサンプルを500マイクロリットルの多血小板血漿で摂氏37度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを新しいウェルに移し、PBS溶液で3回すすぎます。
再度、サンプルを新しいウェルに移します。各ウェルに300マイクロリットルのPBS溶液と10マイクロリットルの10 X溶解バッファーを加えます。サンプルを45分間インキュベートした後、各ウェルに50マイクロリットルの反応混合物を加え、光を避けて30分間インキュベートします。
各ウェルに50マイクロリットルの塩酸を加えて、反応を停止します。吸収された血小板のライセートから乳酸デヒドロゲナーゼ活性を検出するには、開発したウェル溶液の光吸光度を490ナノメートルと680ナノメートルで測定します。コード化されたPP-PDMSファイバーでは、コーティングされていないコントロールと比較して、フィブリノーゲンファウリングが大幅に減少しました。
無流動条件下では、PP-PDMS繊維の外側と内側の束の間のフィブリノーゲンファウリングに有意差はありませんでした。24時間PBSフロー下では、外側と内側の束のフィブリノーゲンファウリングは低いままで、有意差は見られませんでした。血小板の汚れは、PP-PDMS繊維の外側の束の方が内側の束よりも高く、コーティングされていない制御でした。
血小板ファウリングは、フローエクスポージャーなしでコード化されたPP-PDMSファイバーの内側のバンドルと比較して、外側のバンドルで有意に高かった。24時間のPBSフローでは、ファウリングレベルが低い外側と内側の束の間で血小板ファウリングに大きな差は見られませんでした。
