RGD官能化アビジン-ビオチンテザーを用いた血小板遊走を研究するためのIn vitroアッセイ

血小板は、血管損傷後の失血を防ぎ、感染症と闘い、炎症時の血管の完全性を維持するために重要です。止血プラグは血小板の集団的な活性化と凝集を必要としますが、炎症を起こした血管を保護する役割は単一細胞レベルで実行されます。これに関連して、最近の研究では、血小板が自律的に移動できることがわかっていますが、このプロセスは接着性微小環境の機械感知に依存します。

このアプローチにより、基材の接着特性を正確に制御でき、血小板移動の根底にあるメカニズムを研究するための簡単なin vitroアッセイとして機能します。この結果は、インテグリンリガンドに結合する移動する血小板が、アビジン-ビオチン結合を破壊する力を発揮できることを示しています。このアッセイは、血小板遊走を視覚化するためのシンプルで信頼性の高い方法を提供します。

生細胞イメージングと組み合わせることで、この重要な血小板機能におけるさまざまな細胞骨格成分の相互作用と調節をよりよく理解するのに役立ちます。まず、ガラスカバーを20%硝酸に1分間浸し、続いてイソプロパノール、エタノール、および水にそれぞれ1分間超音波処理します。事前に洗浄したカバースリップをプラズマクリーナーで酸素プラズマで2分間処理し、粘着性のあるスライドで組み立てます。

次に、97.5マイクロリットルのPLL-PEGで希釈した2.5マイクロリットルのPLL-PEG-ビオチンをチャネルに充填し、室温で30分間インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。次に、100マイクロリットルのニュートラアビジン-FITCを加え、室温で暗所で30分間インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。最後に、100マイクロリットルのシクロRGDビオチンを加え、室温で30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。

マウスに麻酔をかけ、胸部の皮膚を切除した後、胸骨左側の第2肋骨と第3肋骨の間に針を差し込んで心臓から採血します。血液を1ミリリットルのタイロード緩衝液と混合し、ブレーキを切って室温で70 gで20分間遠心分離し、血小板が豊富な血漿を含む上部を採取します。.3ミリリットルのタイロード緩衝液と混合し、血小板の活性化を防ぐために1ミリリットルあたり100ナノグラムのプロスタサイクリンを追加します。.

その後、1200 gで室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを500マイクロリットルのタイロード緩衝液に再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して、血小板数を測定します。

まず、ビオチン-ニュートラアビジン-ビオチンcRGDコーティングチャネルでマウス血小板を採取し、ステージインキュベーターを備えた倒立顕微鏡を使用して生きた血小板の移動を記録します。血小板の接着数または移動数をカウントするには、ツールバーのポイントツールのドロップダウンメニューを右クリックし、マルチポイントツールを選択します。ニュートラアビジン-FITCコーティングに刻印された移動経路の長さを測定することにより、固定サンプルから移動距離を抽出します。

ツールバーの直線ツールのドロップダウンメニューを右クリックし、フリーハンドラインツールを選択します。血小板の形状を定量化するには、ツールバーの「画像」、「調整」、「しきい値」を選択し、蛍光血小板をセグメント化してバイナリマスクを生成します。「解析と測定の設定」で形状記述子を選択し、「解析を使用して結果を表示」と「パーティクルを解析」を選択します。

血小板は、2.5%PLL-PEG-ビオチン濃度で最適な移動を示しました。移動は、リガンド密度が低い場合と高い場合の両方で減少しました。血小板は1%のリガンド密度で不適切に広がり、面積と周囲が低いことで示され、インテグリンの活性化が不十分であることを示唆しています。

リガンド密度が2.5%の場合、血小板は効果的に広がり、cRGDリガンドを破壊して遊走します。リガンド密度が高いと、血小板が分極せずに広がり、cRGDリガンドの切断に失敗することによる移動が減少しました。