そのため、前駆細胞は環境と相互作用して組織の恒常性を維持します。そして、このプロトコルを使用して、線維芽細胞が食道前駆細胞の挙動にどのように影響するかを理解し始めることができます。共培養システムは、正常な食道前駆細胞ニッチを模倣する最初に単離された細胞を使用する。
イメージング前にオルガノイドをクリアすることで、細胞相互作用とオルガノイド形態の両方の解析が可能になります。この方法は、ヒト食道オルガノイドに適用できます。例えば、健康な患者や癌患者からの材料を使用する。
そうすることで、がん関連線維芽細胞の特異的な機能に関する知見を得ることができます。上皮細胞と間質細胞の解離は、生存可能なオルガノイドを得るために重要です。消化不足では細胞収率が低くなり、過剰消化では細胞生存率とオルガノイド形成能力が低下します。
はじめに、解剖顕微鏡と鉗子を使用して食道の筋筋を機械的に除去します。1対の鉗子を使用して解剖された食道の遠位端を保持し、もう一方の鉗子を使用して、食道の遠位端から近位端まで筋肉をつかんで引っ張ります。筋肉層を取り除いて捨てます。
食道を縦方向に開くには、食道の一端を持ち、微小解剖スプリングハサミのボールを内腔に挿入して組織の損傷を防ぎます。端をつかんだまま食道を切り開き、1.5ミリリットルの微量遠心チューブまたは24ウェルプレートに入れます。開いた食道をHBSSの1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのサーモリシンに浸し、ロッカーシェーカーで摂氏37度で15分間インキュベートします。
サーモリシン溶液から食道を除去した後、食道上皮を間質から慎重に分離する。上皮層と間質層をHBSS中の200マイクロリットルの解離溶液を含む2つの別々の1.5ミリリットルの微量遠心管に移し、それらを氷上に置きます。鋭利なメスを使用して食道上皮を細切りにし、200マイクロリットルの解離溶液でペトリ皿から細切組織を収集します。
1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。800マイクロリットルの新鮮な解離溶液を加え、ミンチの上皮層を含むチューブを摂氏37度のロッカーシェーカーに60分間置きます。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、溶液を約20回上下に15分ごとにピペットで送ります。
解剖ハサミを使用して200マイクロリットルの解離溶液を含む1.5ミリリットルのチューブで間質層を細かく切り、800マイクロリットルの新鮮な解離溶液を加える。チューブを摂氏37度のロッカーシェーカーに30分間置きます。間質溶液の場合は30分間、上皮溶液の場合は60分間インキュベーションした後、溶液をさらに20回上下にピペットで行います。
間質溶液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通し、上皮溶液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通して新しい1.5ミリメートルのマイクロ遠心チューブに入れます。摂氏4度で300Gで10分間遠心分離し、1ミリリットルのピペットで余分な液体を除去して上清を廃棄します。ペレットを200マイクロリットルの抗体ミックスに再懸濁します。
混合物をフローサイトメトリーチューブに移した後、細胞を摂氏4度で30分間インキュベートします。3ミリリットルの1%FBSを加え、再び5分間遠心分離します。次に、細胞を最低200マイクロリットルの1%FBSに再懸濁します。
ファックスソーティングの5分前に、1〜10, 000希釈した死細胞染色マーカーを追加して、生細胞を分離します。選別された上皮細胞と線維芽細胞をチューブ内で1対2の比率で混合します。300Gで5分間遠心分離した後、上清を200マイクロリットルのピペットで慎重に取り出して廃棄します。
ペレットを冷たい塩基性オルガノイド培地に再懸濁して細胞を1回洗浄し、再度5分間遠心分離します。細胞を氷の上に置き、200マイクロリットルのピペットで慎重に上清を取り除いて上清を捨てます。ドームあたり10マイクロリットルのマトリックスミックスに細胞を再懸濁し、チューブを氷上に戻します。
摂氏37度のインキュベーターから予熱した48ウェルプレートを取り出し、ウェルごとに1つのマトリックスドームを作成します。20マイクロリットルのピペットを用いて、オルガノイド共培養を含むマトリックスドームに200マイクロリットルの予め温めたER低培地を加え、上皮オルガノイドのみを含む各マトリックスドームにENR培地を加える。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。
そして最初の2日間は、培地に10マイクロモルの岩石阻害剤を補給します。オルガノイド培地を除去し、200マイクロリットルの氷冷PBSをマトリックスドームに加えます。プレートを氷上に5〜10分間置いた後、ピペットを上下に動かし、溶液を0.6ミリリットルの非付着チューブに移します。
100Gで30〜60秒間遠心分離して、オルガノイドを底に沈降させます。余分な液体を取り除いた後、氷冷PBSをチューブに加え、再び30〜60秒間遠心分離します。前に示したように余分な液体を取り除き、オルガノイドを200マイクロリットルの冷たい4%ホルムアルデヒドでPBS溶液中で氷上で30分間固定します。
チューブを直立させてオルガノイドを沈め、ホルムアルデヒドを取り除きます。500マイクロリットルの冷たいPBSを加えて、残りのホルムアルデヒドを洗い流します。余分なPBSを除去した後、500マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。
チューブをロッカーシェーカーに室温で60分間置きます。ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体を含む200マイクロリットルのブロッキングバッファーにオルガノイドを再懸濁します。オルガノイドをロッカーシェーカーに再び置き、摂氏4度で一晩置きます。
一次抗体ミックスを除去し、500マイクロリットルの0.02%Triton X 100をPBS中で室温で60分間使用してオルガノイドを洗浄します。これを3回繰り返します。同様に、洗浄バッファーを除去し、200マイクロリットルの蛍光標識二次抗体をブロッキングバッファーに摂氏4度で一晩加えます。
PBS中の0.02%Triton X 100を使用してオルガノイドを再洗浄し、続いて500マイクロリットルのPBSを使用します。余分な液体をすべて除去した後、10マイクロリットルの透明化溶液をオルガノイドに加え、室温で15分間インキュベートします。0.05ミリメートルの両面粘着性のある4ウェルスペーサーを顕微鏡スライド上に置きます。
1つのウェルにオルガノイドを含む10マイクロリットルの透明化溶液を加え、スペーサーの上にカバースリップを置きます。共焦点顕微鏡システムを使用して画像を取得します。食道前駆細胞は、それらの高集積ベータ4およびe-カドヘリン発現に基づいてソートされる。
上皮細胞単離の代表的なフローサイトメトリープロットは、すべての単一細胞からの生細胞の割合を示しています。全ての生細胞から単離されたインテグリンベータ4細胞およびe−カドヘリン前駆細胞の割合をここに示す。ここに示すフローサイトメトリープロットは、単離されたDPP4+およびPdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞の割合を表しています。
Pdgf受容体αH2 BEGFP陽性線維芽細胞と共培養したオルガノイドを用いた明視野画像は、核EGFPシグナルを示す。6日目のマトリックスドーム全体の明視野画像を以下に示します。オルガノイド形成効率は、このグラフィック画像によって示されます。
各ドットはマトリックスドームを表し、バーは条件ごとのすべてのドットの平均を表します。Pdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞との共培養6日目の明視野および蛍光画像をここに示します。共培養オルガノイドのマウント画像全体は、ビメンチン陽性の線維芽細胞がオルガノイドに巻き付けられ、オルガノイドと密接に接触しているオルガノイドの3D表面を示しています。
単培養オルガノイドと共培養オルガノイドとPdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞の全体マウント染色により、明確な基底細胞集団と基底上細胞集団が明らかになります。オルガノイド形成効率とオルガノイドサイズは、共培養に含まれる線維芽細胞の影響を受けます。異なる線維芽細胞亜集団を使用する場合、変動と結果が期待されます。
同じ戦略を使用して、マウスとヒトの両方における腫瘍関連線維芽細胞を特徴付けることができます。
