がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

ATAC-seqは、ゲノム内のオープンクロマチン領域の状態を特定することを可能にし、これは通常状態と比較して疾患状態でしばしば変化する。より少ない細胞投入、Tn5消化の簡素化されたプロトコル、それに続くPCR増幅による断片化されたDNAおよびライブラリー調製の単離およびより短い実験時間は、それをより有利な技術にする。ATAC-seqによるエピジェネティックなランドスケープの変化を正常状態と疾患状態との比較は、疾患に関連するクロマチン調節要素に光を当て、新しい治療戦略の設計に役立ちます。

この手法は、重要な実験ステップが含まれていないため、簡単に実行できます。ATAC-seqの結果を得るには、いくつかの標準化ステップのみが必要です。まず、PBSに1ミリリットルあたり100万個の細胞を含む細胞懸濁液から25マイクロリットルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移し、500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を注意深く廃棄し、25マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。500gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。

直ちにペレットを25マイクロリットルのTn5反応混合物に再懸濁し、摂氏37度で30分間インキュベートする。10分ごとに溶液を混合します。5マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと125マイクロリットルのバッファーPBをTn5タグ付きDNA溶液に加えます。

よく混ぜる。次に、スピンカラムを2ミリリットルの捕集チューブに入れ、サンプルをスピンカラムに塗布します。室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、フロースルーを廃棄する。

PE バッファーを列に追加し、列をスピンします。スピンカラムを同じ収集チューブに戻し、5分間遠心分離してメンブレンを完全に乾燥させます。フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。

DNA断片を10マイクロリットルのバッファーEBで溶出し、カラムを室温で1分間静置します。その後、室温で1分間17, 900Gで遠心分離し、DNAを溶出させた。200マイクロリットルのPCRチューブでPCR反応をセットアップし、PCR増幅プログラムパート1を実行します。

リアルタイムQPCRの場合、5マイクロリットルのPCR産物、0.75マイクロリットルの1, 000倍希釈SYBRゴールド、5マイクロリットルの2X PCRマスターミックス、および3.75マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてPCR反応混合物を調製します。実行パラメーターを使用して、必要な追加の PCR サイクル数を決定します。サイクル番号が決定されたら、前に計算された追加のサイクルを使用してPCRを設定します。

増幅されたPCR産物に150マイクロリットルのビーズを加え、室温で15分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに5分間置き、上清を注意深く取り除きます。ビーズを200マイクロリットルの80%エタノールで洗浄し、上清を取り除きます。

エタノールを完全に除去し、サンプルを室温で10分間風乾します。最後に、50マイクロリットルの溶出バッファーで再懸濁します。チューブを磁気スタンドに置き、溶出液を新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

トリパンブルーを用いた細胞溶解効率の比較を以下に示す。NMuMG細胞を低張緩衝液およびCSK緩衝液で処理し、トリパンブルーで染色した。より高い細胞溶解効率は、CSK処理細胞において観察された。

ATAC-seqライブラリーは、MDA-MB-231乳癌細胞から調製した。PCR増幅後、ビーズ精製の前後に0.5X TBE、1.5%アガロースゲルでPCR産物を分析しました。プライマーは、最初のビーズ精製によってほとんど除去されます。

1X TAE 1%アガロースゲル電気泳動および自動電気泳動からのDNAバンドパターンも示されています。SYBR Goldは、ここに示されているDNA断片を視覚化するために使用されました。ERS1遺伝子座を示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。

T47D細胞におけるATAC-seqデータのゲノムカバレッジをこの画像に示します。以前の出版物のプライマーが使用され、それらのターゲット領域は黄色で強調表示されています。ATAC-seqライブラリにおけるプライマーアンプリコン濃縮を示す棒グラフをここに示します。

ATAC-seqライブラリは、低張緩衝液またはCSK緩衝液により調製した。代表的な画像は、ATAC-seq最適化のためのゲノムブラウザの可視化を示しています。25, 000細胞インプット条件からのATAC-seqデータは、ヌクレオソームフリーフラグメントの最も高い濃縮を示し、一方、100, 000セルインプット条件は最も高いモノヌクレオソームDNAを示した。

異なる細胞番号からのATAC-seqデータを示すゲノムブラウザトラックがここに提示されています。HOMERピークアノテーション分析は、この代表的な画像に描かれています。HOMERは、各ピークを近位または遠位ピークのプロモーターとして分類した。

細胞溶解バッファーの細胞投入量の選択数と細胞型に依存するTn5酵素の濃度は、標準化しなければならない最も重要なパラメータです。カットアンドタック法でプロテインAと融合したTn5は、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて目的のタンパク質のDNA結合部位を特定するために広く使用されています。