この方法は、透明化溶液の組織浸透の制限や共焦点顕微鏡での実際の解像度など、イネの深部蛍光観察における課題に対処します。この技術の主な利点は、マクロの観点から非常に大きな組織の構造観察であり、成虫のシュートなどの硬くて厚い組織でもプロンプトが表示されます。この方法は、幅広い植物種の硬組織と厚組織の深部イメージングに適用されます。
植物生物学研究における新しい現象の発見を加速するのに役立ちます。はじめに、植物を傷つけずに根を慎重に切り、水で洗って汚れを取り除きます。次に、ピンセットを使用して古い外側の葉をはがします。
細胞を押しつぶさないようにするには、スライド運動のある片刃のかみそりを使用して、シュート、頂端分裂組織、または若い穂から根元まで組織を切り取ります。シュート頂端分裂組織または若い穂の位置が見えない場合は、それをより長くカットします。イネの断面は楕円形です。
両刃のかみそりを使用して、楕円形の片側を長軸方向に薄く剃ります。サンプル中の白っぽい色の出現によってシュート頂端分裂組織または若い穂の位置を確認し、余分な組織を切り取ります。1ミリリットルの固定液を入れた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにサンプルを入れます。
2.5平方センチメートルのパラフィンフィルムを切り取り、ボールに成形します。次に、これらのボールをサンプルの上に置き、固定液から浮き出ないようにします。サンプルを含むチューブをデシケーターに入れます。
デシケーターの蓋を閉め、真空ポンプを始動して、マイナス0.095メガパスカルの圧力に達するまでデシケーターの内部をゆっくりと減圧します。デシケーターをマイナス0.095メガパスカルで閉じた後、真空ポンプの電源を切り、室温で30分間放置します。デシケーターを少し開き、ゆっくりと大気圧に戻します。
サンプルが正しく固定されると、固定液に沈みます。沈まない場合は、もう一度圧力を下げます。パラフィンフィルムをはがします。
蓋を閉め、チューブを摂氏4度で一晩保管します。糸くずの出ないワイプを使用して、サンプルから余分な固定液を取り除き、瞬間接着剤で振動するマイクロスライサートレイにサンプルを固定します。サンプリング時に削った平坦面を下にしてトレーにサンプルを置き、固定サンプルに合わせてトリミング条件を設定します。
リバースボタンまたはフォワードボタンと上ボタンまたはダウンボタンでサンプルの位置を調整し、すべてのサンプルが浸るまでトレイに脱イオン水を入れます。トレイを満たした後、スタートボタンを押して、トリミングしたサンプルをPBSを一滴入れてスライドガラスの上に置きます。実体顕微鏡でターゲット部位を含むサンプルを確認し、トリミングしたサンプルを1ミリリットルのPBSを含むマルチウェルプレートに移します。
マルチウェルプレートからPBSを取り外します。新鮮なPBSを追加し、1分間放置します。PBS を削除し、CS を追加します。サンプルを含むマルチウェルプレートをデシケーターに入れ、蓋を閉めます。
次に、真空ポンプを始動して、デシケーターの内部をマイナス0.09メガパスカルまでゆっくりと減圧します。デシケーターをマイナス0.09メガパスカルで閉じた後、真空ポンプの電源を切り、室温で1時間放置します。デシケーターを少し開き、ゆっくりと大気圧に戻します。
CSの蒸発を防ぐためにウェル間の隙間に脱イオン水を注ぎ、マルチウェルプレートを室温で暗所に保管して透明にします。CSが緑色に変わったら、新しい溶液と交換します。トリミングされていないサンプルは緑色のままで、すべての葉を剥がした CS.In サンプルで3か月処理しても透明になりませんでした。
サンプルは4週間後に透明になりませんでした。手でトリミングしたサンプルは、CS処理の1週間後に白くなりましたが、4週間後に透明になりませんでした。厚さ130マイクロメートルにトリミングされたサンプルは、CS処理の1週間後に半透明になりました。
サンプルは2週間後にほぼ透明になりました。ノードでは、CS処理の1週間後に観察可能な深さはマイナス60マイクロメートル、2週間後にマイナス90マイクロメートルでした。蛍光シグナルは、3週間でマイナス80マイクロメートルの深さで、4週間でマイナス100マイクロメートルの深さで観察されました。
節間では、CS処理なしでマイナス60マイクロメートルの深さで蛍光シグナルが観察されました。観察可能な深さは、CS処理の1週間から3週間後にマイナス90マイクロメートル、4週間後にマイナス100マイクロメートルでした。葉ではCS処理なしでマイナス90マイクロメートルの深さで蛍光シグナルが観察されたが、明るさは他の組織よりも弱かった。
1週間後、信号はより明るくなり、マイナス120マイクロメートルの深さで観測されました。転写因子OS MASU 15 mOrangeの発現は、若い穂、葉、節、節間、およびフルレットで観察されました。重要なのは、周期と真空圧、位置、CS処理、タイミング、厚さ、速度、適切な染色液など、植物や組織に最適な条件を見つけることです。
タイミングと硬化技術の組み合わせにより、1つの切片の複数の組織における遺伝子発現パターンと細胞間コミュニケーションの空間的時間的観察が可能になります。
