私たちのプロトコルにより、研究者は完全に設計された埋め込み型フラップ内に階層的な血管ネットワークを生成することができ、インビボでの統合下での血管挙動に関する新しい研究への道が開かれました。この技術は、2つの3D印刷技術の汎用性を組み合わせて、マイクロサージャリーを使用して宿主血管と直接吻合することができるマイクロおよびメソスケール上の血管を作成および組み立てる。完全に設計された血管新生フラップは、大きな組織欠損を治療し、組織の発展と統合を研究するためのプラットフォームを提供するために使用できます。
提案された方法は、組織特異的細胞の取り込みを研究し、ならびに異なるバイオインクおよびサポート材料の使用を評価するために拡張することができる。まず、BVOHモールドに30マイクロリットルのポリマー溶液を充填します。金型を100倍gで2分間遠心分離し、さらに20マイクロリットルのポリマー溶液で金型を補充して、完全な充填を確実にします。
充填された金型をマイナス80°Cで少なくとも30分間凍結し、すべてのポリマー溶液が凍結することを確認します。金型から溶媒を一晩凍結乾燥することによって除去する。犠牲型材料を除去するために、凍結乾燥処理後の型を穏やかに攪拌しながら5リットルの脱イオン水浴に移す。
お風呂の水が曇ったら交換してください。すべてのBVOHが溶解したら、足場を風乾し、使用時まで真空チャンバーに保管してください。調製し、圧縮した担体材料の約4ミリリットルを、正の変位ピペットを用いて12ウェルプレートの各ウェルに移す。
硬い表面のウェルプレートをタップして、サポート材料がウェル内に均等に広がるように強制します。10ミリリットルの内皮細胞培地に200万個のHAMEC−ZsGreenおよび600万個の歯髄幹細胞を含む懸濁液を調製する。細胞懸濁液を200倍gで4分間遠心分離して細胞ペレットを得、次いで上清培地を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルのrhCollMAバイオインクに再懸濁して、バイオインク1ミリリットル当たり総細胞濃度800万細胞のバイオインクを得た。
内径 0.22 mm の針を 3 ミリリットルのオレンジ色の印刷カートリッジに合わせ、カートリッジを 50 ミリリットルの円錐形のチューブに入れます。気泡を低減するために、正の変位ピペットを使用して上から充填することによって、細胞 - バイオインク混合物の1ミリリットルを印刷カートリッジに移す。印刷カートリッジをバイオプリンターの適切なツールに取り付けます。
中央に直径 2 ミリメートルの円形のチャンネルを含む 4 mm 四角の 2D パターンをスケッチします。スケッチを 4 mm 押し出して、中央のチャンネルがある 4 mm の立方体を取得します。このオブジェクトを STL ファイルとしてエクスポートします。
12ウェルプレートSTLテンプレートをバイオプリンタースライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートし、仮想プリントベッドの指定された領域に配置します。立方体形状のSTLファイルをバイオプリンタスライスソフトウェアのソリッドモデリングタブにインポートします。[外部スライサーを使用する] チェックボックスをオンにしてから、[オブジェクト] プロパティ セクションの下にある [スライサーの構成] をクリックします。
ポップアップウィンドウで、塗りつぶしパターンの直線パターンを選択し、塗りつぶし密度に「30%」と入力して、[承諾] をクリックします。立方体をクリックし、マウスを使用して移動し、立方体形状のコピーを目的の各仮想井戸に配置します。バイオプリンタースライスソフトウェアの材料タブにある材料の追加ボタンをクリックして、rhCollMAバイオインクの新しい材料設定を作成します。
印刷する材料設定を選択します。圧力の場合は 2 psi と入力し、速度の場合は対応するボックスに 20 mm/秒と入力します。線幅と線の高さの値を 0.24 ミリメートルに割り当て、加速度の値を 400 ミリメートル/平方秒に割り当てます。
ソリッドモデリングタブで、立方体オブジェクトをクリックし、材料セクションからrhCollMA材料をクリックして立方体形状に割り当てます。バイオアセンブリタブで、[印刷ジョブの送信]ボタンをクリックして、印刷ジョブをバイオプリンタに送信します。セルラーバイオインクを装填した印刷カートリッジを、3D押出ベースのバイオプリンタの3ミリリットルの周囲空気圧ディスペンスツールにロードします。
バイオプリンターのインターフェース画面の[加熱または冷却の制御]タブの下にある[冷却]ボタンをクリックして、プリントベッドの温度を摂氏4度に設定します。サポートバスの入ったプレートをプリンタベッドに積み込みます。バイオプリンターインターフェース画面の「印刷」タブで、印刷ジョブをクリックし、「開始」をクリックし、続いて「GO」をクリックして印刷ジョブを開始します。
印刷後、ウェルプレートを405ナノメートルの光源に30秒間1平方センチメートルあたり3ミリワットの強度で露光し、rhCollMAバイオインクの架橋を開始します。架橋後、ウェルプレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で、すべての支持浴が溶けるまで少なくとも20分間インキュベートする。液化した支持浴を穏やかに吸引し、内皮細胞培地と交換する。
構築物を摂氏37度および二酸化炭素5%でインキュベートする。バイオプリントされた微小血管網の担体材料除去の直後に、バイオプリント構造の隣にフィブロネクチンコーティングされたPLLA:PLGA血管足場を置く。血管足場をバイオプリント構造のメインチャネルに挿入する。
組み立てた構築物を摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間インキュベートする。tdTomato発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞の細胞懸濁液を1ミリリットル当たり1000万細胞の濃度で調製した。この細胞懸濁液の20マイクロリットルの液滴を疎水性表面上に置く。
一端の足場の内腔が細胞液滴と接触するように、血管足場を液滴の上に静かに置く。足場の反対側の端から液滴を吸引し、その内腔を細胞懸濁液で満たす。座った足場を微小遠心チューブに入れ、加湿インキュベーター内の回転子に60分間入れます。
最後に、足場を12ウェルプレートに移し、2ミリリットルの内皮細胞培地を加える。血管足場の内皮内皮ライニングの4日後に画像化された代表的な操作されたフラップの側面図がここに示されている。バイオプリントされた微小血管系は緑色で示され、内皮内層は赤色で示されている。
代表的な画像は、バイオプリントされた血管系と内皮内層との間の吻合を示す。インキュベーションの7日後の平滑筋アクチン、核、および内皮細胞についての免疫染色がここに示されている。代表的な画像は、クランプ除去前およびクランプ除去後にラットの大腿動脈を有する操作されたフラップの完了した吻合を示す。
この技術は、インビボでの3Dプリント血管系の成熟と統合を研究し、後肢のインプラントの灌流を監視して、組織欠損を治療するための使用の可能性と安全性を確立するために使用することができる。
