ここに記述されているプロトコルは長さの10キロバイトまでの一本鎖肯定的なRNAのウイルスのゲノムの任意に突然変異させた完全長のRNAの図書館の生成、および望ましい実験条件の下で興味の表現型の選択を可能にする。この手法では、クローニングフリーのアプローチにより、さまざまなレベルの遺伝的多様性を持つ完全長ウイルスRNAライブラリを短時間で作成できます。この技術は、安価で広く入手可能な試薬をライブラリの合成に利用します。
この手順を実演するのは、シブ・ナダール大学生命科学部ウイルス学セクションの博士課程の学生であるシャヒーン・カーン氏です。まず、本文原稿に記載されているように、pJFH1テンプレートを含まない反応成分とともに、フォワードプライマーとリバースプライマーを含む4セットの実験用のマスターミックスを調製して、ep-PCRを実施します。マスターミックスを4本のチューブに分注します。
100ナノグラム、50ナノグラム、25ナノグラム、および10ナノグラムのテンプレートを個々のチューブに追加し、反応の総容量を50マイクロリットルに調整します。サイクリング条件を適用して、97 36塩基対フラグメントを増幅します。5マイクロリットルのPCR産物をロードし、0.8%TAEベースのアガロースゲル電気泳動を実行して、既知の量の1キロベースDNAラダーと比較することによって増幅されたep-PCR産物を推定します。
カラム精製キットを使用して製品を精製します。260ナノメートルの吸光度を測定することにより、精製生成物の濃度を推定します。ep-PCR産物を真空濃縮して、1マイクロリットルあたり100ナノグラム以上の製品濃度を得る。
in vitro RNA合成反応をセットアップし、摂氏37度でインキュベーションします。次に、カラム精製キットを使用して合成生成物を精製します。メーカーの推奨に従って、約1マイクログラムのウイルスRNA、5マイクロモルのリバースプライマー、および200ユニットの逆転写酵素を添加して、20マイクロリットルのcDNA合成反応をセットアップします。
cDNAを用いて、本文原稿に記載の反応混合物を調製し、増幅サイクルを実行します。0.8%TAEベースのアガロースゲルで分析し、25個の71塩基対の製品サイズを確認してから、前述のようにカラム精製キットを使用して製品を精製します。40マイクロリットルの滅菌水に溶出する。
3 プライム A オーバーハングを追加するには、0.5 マイクロモルの DATP と 1 ユニットの低フィデリティ Taq DNA ポリメラーゼを添加し、1X PCR バッファーと 1.5 mm の塩化マグネシウムとともに、PCR 産物全体を摂氏 70 度で 30 分間インキュベートします。次に、カラム精製キットを使用して混合物を精製します。ライゲーション反応をセットアップし、室温で3時間インキュベートします。
次に、100マイクロリットルの大腸菌DH5-AlphaをライゲーションしたDNAに加え、細胞を摂氏42度で35秒間ヒートショックします。細胞懸濁液に1ミリリットルのLB培地を加え、37°Cで1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。13、800 RCFで遠心分離します。
上清を廃棄し、200マイクロリットルの新鮮なLB培地に再懸濁します。100マイクロリットルの形質転換大腸菌DH5-Alpha細胞を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのアンピシリンを含むLBプレートに播種し、摂氏37度で16時間インキュベートします。1ミリリットルあたり50マイクログラムのアンピシリンを含む5ミリリットルのLB培地に25〜30コロニーのミニプレップを設置し、摂氏37度で一晩増殖させます。
翌日、市販のキットでプラスミドを抽出し、200ナノグラムの単離プラスミド、2ユニットのEcoR1、およびすべてのコロニーの1X制限バッファーを使用して、10マイクロリットルの容量の制限酵素消化を行います。消化混合物を摂氏37度で3時間インキュベートした後、0.8%TAEベースのアガロースゲルに製品をロードして、プラスミドDNAの挿入を確認します。推奨プライマーを使用して、25 個の陽性クローンのプラスミドのサンガーシーケンシングを実行します。
トランスフェクションの1日前に、細胞を分割し、血球計算盤を使用して生細胞の数をカウントします。次に、ヒト肝細胞腫7.5細胞を35ミリメートルの皿に入れ、2ミリリットルの完全DMEMに播種し、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度で16時間インキュベートします。翌日、10マイクロリットルのトランスフェクション試薬を50マイクロリットルの最小必須培地で希釈して転写産物脂質複合体を調製し、5マイクログラムのウイルス転写物を50マイクロリットルの最小必須培地で別途希釈します。
両方の混合物を室温で10分間インキュベートします。次に、それらを単一の滅菌微量遠心チューブで混合し、室温で30分間インキュベートします。細胞インキュベーション後、培地を取り出し、予熱した1X PBSで細胞を2回洗浄し、1.5ミリリットルの最小限の必須培地を加えます。
複合体をゆっくりと加え、皿を静かに渦巻かせて均一に分配します。細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で10時間インキュベートします。次に、培地を取り除きます。
トランスフェクションした細胞を1ミリリットルの予熱した1X PBSで2回洗浄し、2ミリリットルの完全DMEMを加えます。ウイルス RNA 分離キットを使用して、140 マイクロリットルの培養上清からウイルス RNA を単離します。市販のqRT-PCRキットを使用して、10マイクロリットルのqRT-PCR反応をセットアップします。
フォワードプライマーとリバースプライマーを使用し、HCV RNAの定量にプローブします。反応サイクルを48°Cで20分、95°Cで10°C、95°Cで15秒、60°Cで1分間の45サイクルに設定します。反応を実行し、ネガティブコントロールを設定します。
並行して、10 倍に段階希釈した既知のコピー数の HCV 転写物を使用して検量線を作成し、ウイルス RNA を定量します。三重に演奏する。ヒト肝細胞腫7.5細胞を96ウェルプレートに播種し、ウイルスを添加する約16時間前に5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で細胞をインキュベートします。
バイオセーフティークラスIIキャビネットで、ウイルスを10倍段階希釈します。ウェルあたり100マイクロリットルの希釈ウイルスを加えて細胞に感染させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。3日後、感染細胞を0.1ミリリットルのPBSで3回洗浄し、0.1ミリリットルの氷冷メタノールでマイナス20°Cで20分間細胞を固定および透過処理します。
ウェルを1X PBSで3回洗浄し、次にPBSTで1X洗浄します。PBSTを除去した後、PBSTに0.2%スキムミルクを含む0.1ミリリットルの1%BSAで細胞を室温で30分間ブロックします。ブロッキング溶液を除去し、1X PBSで調製した0.1ミリリットルの3%過酸化水素で細胞を5分間処理します。
再度、細胞を1X PBSで2回洗浄し、PBSTで1X洗浄します。ウェルあたり50マイクロリットルの抗NS5A 9E10モノクローナル抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。ウェルを1X PBSで3回、PBSTで1回洗浄します。
ウェルあたり50マイクロリットルのHRP標識ヤギ抗マウス二次IgGを添加し、室温で30分間インキュベートした後、0.1ミリリットルの1X PBSでウェルを洗浄して非結合抗体を除去します。30マイクロリットルのDABを加え、室温で10分間穏やかに揺動しながらプレートをインキュベートします。DAB溶液を除去し、ウェルを1X PBSで2回、蒸留水で1回洗浄します。
0.03%アジ化ナトリウムを含むPBSを100マイクロリットル添加します。10倍対物レンズを使用して、倒立光学顕微鏡で各ウェルを調べます。正の井戸の数を数えます。
リードとミュンチの計算機を使用して、ウェルの 50% に感染するエンドポイント希釈を推定します。NS5A阻害剤であるピブレンタスビルを100%DMSOに1ミリモルの濃度に溶解し、さらに完全DMEMで10ナノモルの濃度に希釈します。次に、ナイーブHuh-7.5細胞にML50ウイルス用量を70%コンフルエンスで感染させて、細胞の50%を12時間感染させ、感染後24時間で感染した細胞を6ウェルプレートに移します。
16時間の細胞分裂後、感染細胞に1X EC50 PIBを添加します。これは、すべての細胞が6回連続して継代で分裂した後、その後3回の薬物を使わない継代サイクルの後に行い、焦点形成アッセイを使用してウイルスの拡散を監視します。各継代でウイルス上清を採取し、マイナス80°Cで保存します。
18日目に上清からウイルスRNAを抽出し、合成したcDNAを抽出します。5マイクロリットルの希釈cDNAを使用してNS5A遺伝子を増幅します。次に、NS5Aシーケンシングプライマーを使用して、6〜8個の陽性細菌プラスミドにおけるNS5A薬剤耐性変異を決定します。
全ゲノム変異体ライブラリーは、クローンpJFH1を用いて、100ナノグラムから10ナノグラムに減少量で合成した。ep-PCR産物の平均収量は、マイクロリットルあたり3.8〜12.5ナノグラムの範囲であった。変異体ライブラリーにおける変異の割合は、ep-PCR反応におけるpJFH1のインプットの減少に伴って増加した。
50ナノグラムの鋳型を用いて合成されたML50は、コピーされた10, 000塩基対あたり4つの置換を有したが、25ナノグラムの鋳型を用いて合成されたML25は、9つの置換を有していた。配列決定されたヌクレオチド数内の置換は、クローンpJFH1では見つかりませんでした。ML50ウイルス変異体は、クローン型JFH1ウイルスと比較してピブレンタスビルに対する感受性が低かった。
8つのNS5Aクローンのうち、4つはD7V+F28Cの組み合わせを持ち、V8A+F28CとF36Lはそれぞれ1つのクローンで発生しました。これらの変異はNS5AのN末端領域にあり、臨床的に重要なNS5A耐性変異を有することが知られている。ep-PCRの各成分の最終濃度、特にテンプレート量は重要です。
KBエクステンダーが不足すると、ep-PCR産物の収量が大幅に低下します。
