エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価

エクソソームは、14〜200ナノメートルの大きさの細胞から分泌され、細胞内カーゴとコミュニケーションで分裂した小胞に反応し、細胞外小胞の最小のサブグループに到達します。エンドソームの分化の結果として形成されるエクソソームは、細胞膜に由来します。幹細胞は、骨髄や脂肪組織などのさまざまなソースから単離できます。

しかし、成体組織乾燥幹細胞は免疫原性が高く、エクソソームの大きさから、血液脳関門を通過できるため、中枢神経系疾患において重要な役割を担っていると言われています。まず、播種したウォートンゼリー間葉系幹細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、フラスコをインキュベーターに入れる前に、5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を加えます。

インキュベーション後、細胞を回収し、1, 500 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、10%FBSを含む1ミリリットルのDMEM-F12をチューブに加えます。培養細胞をPBSで洗浄します。

洗浄後、無血清DMEM-F12培地を細胞に添加し、インキュベーターに入れます。エクソソームを単離するには、無血清培地を回収し、300 G、摂氏4度、10分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、より高速で連続遠心分離して処理します。

最後の遠心分離後、上清をゆっくりと除去し、ペレットを1ミリリットルのPBSに溶解します。ボルテックスで混合し、110, 000 G で 4 °C で 70 分間超遠心分離を進めます。先ほど超遠心分離で採取したエクソソーム懸濁液に3ミリリットルのPBSを加え、希釈した懸濁液を0.22ミクロンのフィルターでろ過して滅菌します。

次に、滅菌したエキソソーム懸濁液500マイクロリットルを別のチューブに移します。次に、500マイクロリットルの0.5ミリグラム/ミリリットルのドーパミン溶液とサポニンを滅菌懸濁液に加えます。インキュベーション後、懸濁液を超遠心分離します。

このサンプルは、ドーパミンをロードしたエクソソームの特性評価のためにNTAおよびDLS分析に使用するか、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保存することができます。NTAの解析では、ウォートンゼリー由来のエクソソームの平均サイズは98ナノメートル、ドーパミンを充填したエクソソームの平均サイズは110ナノメートルと判定されました。NTA分析とDLS分析で明らかになったナノ粒子の数は、互いに一致していました。

ウォートンゼリー由来のエクソソームのゼータ電位はマイナス15.7、ドーパミンをロードしたエクソソームのゼータ電位はマイナス17.6ミリボルトと測定されました。ドーパミンをロードしたエクソソームのHPLC分析により、6.45分にドーパミンのピークが検出されました。累積薬物放出プロファイルにより、カプセル化されたドーパミンの74.8%が最初の8時間以内にエクソソームから放出されたことが明らかになりました。

線維芽細胞上のドーパミン負荷および遊離エクソソームの細胞毒性が調査されました。ドーパミンをロードしたエクソソームは細胞毒性効果を示さなかったが、サポニンは線維芽細胞の生存率を低下させた。MTTアッセイでは、線維芽細胞をドーパミンをロードしたエキソソームで処理すると、細胞生存率の向上が示されました。

結果の統計的有意性は、一元配置分散分析を実行することによって評価されました。さらに、線維芽細胞に対するさまざまな濃度の遊離エクソソームの細胞毒性効果を調査しました。線維芽細胞の生存率は、25マイクロリットル/ミリリットルの濃度の遊離エキソソームで高かった。

中枢神経系にとって本当に重要なのは、患者のサイズ、可塑性、神経反応、左右のコミュニケーション、脳内の神経新生などのプロセスにおける役割です。また、エクソソームの表面のおかげで、薬物中に送達された薬物や活性を標的細胞と相互作用させることが観察されているとのことです。本研究では初めて、幹細胞由来のエクソソームにドーパミンを内包した新薬製剤を開発しました。

彼は、この製剤がパーキンソン病の治療に非常に有望であると提案しました。