高度に多重化された振動イメージングは、細胞内分解能で組織内の複数のタンパク質マーカーを調査するためのワンショット光学的アプローチを提供します。このプラットフォームは、生物学的システムのタンパク質相互作用の包括的な画像を提供します。この技術の主な利点は、サイクルフリーの多重性です。
この技術は、厚い組織切片など、サイクリング戦略がうまく機能しない用途に特に適しています。この方法は、組織アトラスの構築、腫瘍微小環境の表現型決定、脳回路のプロファイリングなど、複雑なシステムの構造を理解するために、その場で個々の細胞特性評価を可能にします。開始するには、コンジュゲーション緩衝液として使用するPHA 0.3のPBS緩衝液中に約0.1モルの炭酸水素ナトリウムを調製し、それを摂氏4度で保存する。
次いで、無水ジメチルスルホキシド中の3ミリモルのn−ヒドロキシスクシンイミドエステル官能MARSプローブ溶液を調製する。抗体固形物をコンジュゲーションバッファーに溶解させて、1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度にする。他の緩衝液に溶解した抗体の場合は、遠心フィルターで濃縮してから、コンジュゲーションバッファーに1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムの濃度で加えます。
二次抗体のコンジュゲーション反応を行うには、ガラスバイアル瓶の抗体溶液に15倍モル過剰の色素溶液を攪拌しながらゆっくりと加え、攪拌しながら反応混合物を室温で1時間インキュベートする。精製を行うには、50ミリリットルのチューブ内の40ミリリットルのPBS緩衝液に10ミリリットルのゲル濾過用樹脂粉末を加えてスラリーを調製する。溶液を摂氏90度の水浴に1時間保管する。
次に、上清をデカントし、PBSを最大40ミリリットルまで加え、スラリーを摂氏4度で保存する。サイズ排除カラムにスラリー溶液を10〜15センチメートルの高さまで充填し、次いで約10ミリリットルのPBSでカラムをすすぎ洗いし、さらに樹脂を充填する。続いて、コンジュゲーション反応混合物をカラムにピペットで通す。
反応混合物を装填した後、直ちに溶出緩衝液として1ミリリットルのPBSを加える。その後、カラム上の色を見るか、280ナノメートルでの吸光度を測定することによって、コンジュゲート溶液の溶離液を回収する。遠心フィルターを使用して、回収した溶液を1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムに濃縮する。
疎水性ペンを使用して、スライド上の組織切片の周囲に境界を描きます。次いで、組織を0.3〜0.5%PBSTで10分間、ブロッキングバッファーで30分間インキュベートする。一次染色溶液を調製するために、すべての一次抗体を所望の濃度で200〜500マイクロリットルの染色緩衝液に添加する。
一次染色液を13,000倍Gで5分間遠心分離し、沈殿物が現れた場合は上清を使用する。次いで、一次抗体溶液中の組織を摂氏4度で1〜2日間インキュベートする。スライドを0.3~0.5%PBSTで3回、スライドスタンディングジャーで室温で5分間洗浄し、組織が溶液に浸されていることを確認します。
その後、組織を200〜500マイクロリットルのブロッキングバッファー中で30分間インキュベートする。二次染色溶液を調製するために、所望の濃度の200〜500ミリリットルの染色緩衝液にすべての二次抗体を加える。その後、二次染色液を13,000倍Gで5分間遠心分離し、沈殿物が現れた場合は上清を使用する。
次に、200〜500マイクロリットルの二次抗体溶液中で組織を摂氏4度で1〜2日間インキュベートする。その後、スライドを室温で0.3~0.5%PBSTでそれぞれ5分間2回洗浄します。さらに、200〜500マイクロリットルのDAPI溶液と共に30分間インキュベートする。
再度、スライドを室温でPBSで3回ずつ5分間洗浄し、浮遊組織切片をガラス滴下ピペットでスライドガラスに移した。ティッシュブラシでティッシュを広げ、必要に応じてワイプで周囲をきれいにします。その後、ガラスカバースリップで退色防止試薬の滴に組織をマウントし、マニキュアで固定します。
マルチチャンネルeprSRSイメージングを実行するには、レーザーコントロールパネルでポンプビームのレーザー出力を10~40ミリワット、ストークスビームのレーザー出力を40~80ミリワットに設定します。次に、ピクセルの滞留時間を2~4マイクロ秒に設定し、顕微鏡ソフトウェアで平均10~20フレームの複数フレームを使用します。また、ロックインアンプの時定数を画素滞留時間の半分に設定する。
パラホルムアルデヒド固定マウス脳皮質および湿潤腎臓FFPE組織の別個のタンパク質マーカーおよびHeLa細胞のラマン色素イメージングは、免疫標識を介して行った。α-チューブリンを用いたHeLa細胞の免疫-eprSRSイメージングにより、微小管などの微細な細胞下構造が明らかになった。マウス脳組織中のMARS 2145染色されたアストロサイトおよびMARS 2228染色された小脳顆粒ニューロンのeprSRSイメージングは、細胞内分解能を有する3次元パターンを実証した。
凍結マウス膵島組織上のホルモンおよび転写因子の7色SRS蛍光タンデムイメージングを行った。得られた画像は、良好なコントラストおよび正しいパターンを明らかにした。パラホルムアルデヒド固定マウス小脳組織上の細胞型マーカーの8色SRS蛍光タンデムイメージングを行った。
小脳顆粒ニューロン、プルキンエニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞、およびGABA作動性ニューロンなど、さまざまな種類の細胞が同定された。この手順は、組織透明化とさらに組み合わせて、厚い無傷の組織において高度に多重化されたタンパク質イメージングを実行することができる。私たちのグループは、そのためのラマン色素に合わせた組織透明化プロトコルを開発しました。
