このアプローチは、3分未満で新生児エキソビボマウス心臓の逆行性灌流を確実に確立する。したがって、研究の可能な限り若い年齢を数週間から10出生後10日に短縮する。この単離された逆行性灌流モデルは、遺伝的に改変可能で低コストの種における心臓発達の重要な期間中の新生児心臓の研究を可能にする。
このモデルは、新生児心臓における虚血再灌流に対する生理学的および薬理学的応答の研究に役立つが。また、心筋細胞単離のために利用することができる。新生児マウス大動脈カニューレを製作するには、鋭いはさみを使用して先端を切り取り、26ゲージのステンレス鋼針の端を鈍らせ、針の内腔の直径を圧着または制限しないように注意します。
次に、切断エッジを滑らかにし、実験ベンチトップの鈍い端を前後に動かして静かにこすりつけてバリを取り除きます。次に、作製したカニューレをランゲンドルフ装置に取り付け、流れと抵抗を評価します。カニューレを通る流量を測定するには、1分間隔でバッファー量を収集して測定します。
Krebs-Heneseleitバッファーが流れている間のカニューレ全体の圧力差を定量化するには、カニューレが取り付けられているかどうかにかかわらず、システム内の圧力を測定します。次に、下記式を用いてカニューレ抵抗を算出する。次に、ランゲンドルフ装置から26ゲージカニューレを取り外し、高圧チューブを装置上のカニューレ部位に取り付けます。
次に、大動脈カニューレをチューブの遠位端に取り付け、チューブとカニューレを酸素化バッファーで空気を抜き、すべての気泡が除去されるようにします。冠状動脈微小血栓の形成を防ぐために、1ミリリットルの注射器に26ゲージ針を用いて、10日齢のマウスの子犬にヘパリンの腹腔内注射を投与する。麻酔薬の注射を進める前に、ヘパリンが循環するまで数分かかります。
次に、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、意識を失ったらすぐに手足を固定します。動物が最初の解剖中に自発的に呼吸するので、動物がつま先のつまみに反応しなくなったらすぐに収穫を始めてください。まっすぐな解剖ハサミを使用して、動物の幅を横切って横の剣状下切開を行い、腹腔を露出させる。
助手に鉗子で剣状突起を把握し、胸郭を頭蓋骨方向に中央腋窩線に沿って両側に切断し、胸骨と肋骨を頭蓋に反射させて胸部器官を露出させる。横隔膜を良好に識別した後、前部を完全に切開する。肝臓の上のインフラアフグマティック下大静脈を同定し、虹彩鉗子で近位セグメントのセファラッド張力のわずかな内部を維持しながら、湾曲した虹彩はさみでそれをトランセクトする。
次に、下大静脈を胸腔から引き上げ、外に引き出しながら、湾曲した虹彩はさみを使用して脊椎の内面に沿って後部に切断する。心臓が動員されたら、はさみを前方に傾け、大きな血管を優勢に切断して心臓と肺を完全に取り除きます。直ちに標本を氷冷クレブス・ヘンゼライト緩衝液または生理食塩水に沈める。
心臓は数秒以内に鼓動を停止する必要があります。浅いペトリ皿の底にペーパータオルを置き、カニューレ中に心臓を安定させるために摩擦を与えます。ペーパータオルを氷のように冷たいクレブス・ヘンゼライトの緩衝液で湿らせて、心臓がそれに付着するのを防ぎます。
準備したシャーレを解剖顕微鏡の下に置き、焦点を調整します。次に、高圧延長チューブに取り付けられた大動脈カニューレを解剖顕微鏡の下に置き、そのハブの周りにゆるく結ばれた5-0シルク縫合糸と一緒に置きます。摘出した胸部器官をペトリ皿に入れた後、その白い光沢と2つの葉で胸腺を特定し、胸腺が前部で優れているように標本を向けます。
次に、鉗子を使用して胸腺の葉を鈍く分離し、大きな血管を露出させる。次に、大動脈弓の際立った分岐特徴を見つけて大動脈を識別し、細かい鋭いはさみを使用して鎖骨下動脈の離陸のすぐ近くをトランセクトします。ジュエラースタイルの細かく湾曲した鉗子を使用して、トランセクトされた大動脈を優しくつかみ、大動脈弁を傷つけないように注意しながら、26ゲージの鈍い針で大動脈を慎重にカニューレツします。
微細に湾曲した鉗子を使用して、カニューレの周りの大動脈をつかみ、虚血時間を制限するために逆行性灌流を開始する。助手にゆるく縛られた縫合糸の端をつかみ、カニューレの周りの大動脈を慎重に包み込むように頼みます。細かく湾曲した鉗子の上または下に縫合糸を締め付け、縫合糸を締め付け、冠状動脈流の妥当性を確認します。
高圧チューブをランゲンドルフ装置から取り外し、カニューレのハブをつかみ、鈍い針を高圧延長チューブから外します。次に、カニューレのハブを装置に迅速に取り付けます。心臓が通常の位置でランゲンドルフ装置に吊るされると、適切な灌流が確認される。
肺、胸腺、余分な組織を慎重にトリミングします。次に、冠状動脈洞流出液が自由に滴下できるように右心房を切開します。5-0シルク縫合糸の端に小さな結び目を作り、針でパラフィンフィルムの小さな部分を突き刺し、パラフィンを結び目の端にスライドさせます。
心室の頂点に針を慎重に通し、パラフィン膜が心室の側壁にぴったりとくっつくまで、心臓を通して縫合糸を引っ張る。心臓を包み込んで温めることができるように、ランゲンドルフ装置の水で満たされた温めジャケットの開口部に針を通します。次に、針を力変換器に取り付けて、冠状動脈洞の点滴を避けます。
拡張期緊張または天底意図追跡によって示されるように、1〜2グラムの基礎張力を適用するように縫合糸を調整する。次に、心臓の上側と下側の極に表面電極を配置して、心電図を記録します。最後に、24ゲージ静脈内カテーテルを用いて分析のために冠状動脈洞廃液をサンプリングする。
表面電極を使用して連続心電図を記録し、固有の速度とリズムを決定することができました。適切に灌流されたすべての心臓は、洞調律で自発的に鼓動します。この灌流戦略は、ごくわずかな乳酸産生および低いパーセント酸素抽出およびグルコース消費を考えると、新生児マウス心臓の代謝ニーズを満たした。
生理学的変数手段は、平均脱神経内因性心拍数および平均観察された大動脈灌流圧と同様に、また記録および計算した。新生児製剤の一貫性を確保するために、再灌流を開始するのに必要な時間、不整脈持続時間および大動脈灌流圧などのいくつかの除外基準を考慮しなければならない。灌流の確立後、薬物送達、虚血再灌流傷害の誘導、代謝産物の変化または心筋細胞単離のための酵素剤の送達などの介入が起こり得る。
