Questo approccio stabilisce in modo affidabile la perfusione retrograda del cuore neonatale ex vivo del topo in meno di tre minuti. Riducendo così l'età di studio più giovane possibile da diverse settimane a 10 giorni postnatali. Questo modello isolato retrogrado perfuso consente lo studio del cuore neonatale durante un periodo critico di sviluppo cardiaco in una specie geneticamente modificabile e a basso costo.
Mentre questo modello si presta allo studio delle risposte fisiologiche e farmacologiche all'ischemia-riperfusione nel cuore neonatale. Potrebbe anche essere utilizzato per l'isolamento dei cardiomiociti. Per fabbricare la cannula aortica del topo appena nato utilizzare forbici affilate per tagliare la punta e smussare l'estremità di un ago in acciaio inossidabile calibro 26, facendo attenzione a non crimpare o limitare il diametro del lume dell'ago.
Quindi levigare il bordo tagliato per rimuovere eventuali sbavature raschiando delicatamente l'estremità smussata sul piano di lavoro del laboratorio con un movimento avanti e indietro. Quindi, collegare la cannula fabbricata all'apparato Langendorff e valutare il flusso e la resistenza. Misurare le portate attraverso la cannula raccogliendo e misurando la quantità del buffer in un intervallo di un minuto.
Per quantificare il differenziale di pressione attraverso la cannula mentre scorre il tampone Krebs-Heneseleit, misurare la pressione nel sistema con e senza la cannula attaccata. Quindi calcolare la resistenza della cannula utilizzando la seguente formula. Quindi, rimuovere la cannula a 26 gauge dall'apparecchio Langendorff e collegare un tubo ad alta pressione al sito di cannulazione sull'apparecchio.
Quindi collegare la cannula aortica all'estremità distale del tubo e arieggiare il tubo e la cannula con tampone ossigenato, assicurandosi che tutte le bolle vengano rimosse. Per prevenire la formazione di microtrombi coronarici, somministrare un'iniezione intraperitoneale di eparina a un cucciolo di topo di 10 giorni utilizzando un ago calibro 26 su una siringa da un millilitro. Lasciare circolare diversi minuti affinché l'eparina circoli prima di procedere con l'iniezione di qualsiasi anestetico.
Quindi, posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina e fissare gli arti immediatamente dopo la perdita di coscienza. Inizia la raccolta non appena l'animale non risponde al pizzico della punta mentre l'animale respira spontaneamente durante la dissezione iniziale. Usando le forbici da dissezione diritte si crea un'incisione subssifoidea trasversale attraverso la larghezza degli animali esponendo la cavità addominale.
Chiedi a un assistente di afferrare il processo xifoideo con una pinza, quindi taglia la gabbia toracica bilateralmente lungo la linea ascellare media in direzione cefalade e rifletti lo sterno e le costole cranicamente per esporre gli organi toracici. Dopo aver identificato il diaframma in modo superiore, incidere completamente la porzione anteriore. Identificare la vena cava inferiore infradiaframmatica sopra il fegato e transettarla con una forbice dell'iride curva mantenendo un leggero interno nella tensione cefalacea sul segmento prossimale con pinza dell'iride.
Quindi, tagliare posteriormente lungo la superficie interna della colonna vertebrale usando forbici dell'iride curve mentre si tira la vena cava inferiore su e fuori dalla cavità toracica. Mentre il cuore viene mobilitato, inclina le forbici anteriormente e taglia i grandi vasi in modo superiore per rimuovere completamente il cuore e i polmoni. Immergere immediatamente l'esemplare in un tampone Krebs-Henseleit ghiacciato o in una soluzione salina.
Il cuore dovrebbe smettere di battere in pochi secondi. Posizionare un pezzo di carta assorbente sul fondo di una capsula di Petri poco profonda per fornire attrito per stabilizzare il cuore durante la cannulazione. Inumidire il tovagliolo di carta con un tampone Krebs-Henseleit ghiacciato per evitare che il cuore aderisca ad esso.
Posizionare la capsula di Petri preparata sotto il microscopio di dissezione e regolare la messa a fuoco. Ora, posiziona la cannula aortica attaccata al tubo di estensione ad alta pressione sotto il microscopio di dissezione, insieme a una sutura di seta 5-0 liberamente legata attorno al suo mozzo. Dopo aver posizionato gli organi toracici asportati nella capsula di Petri, identificare il timo dalla sua lucentezza bianca e due lobi e orientare l'esemplare in modo tale che il timo sia anteriore e superiore.
Successivamente, usando una pinza separa senza mezzi termini i lobi del timo esponendo i grandi vasi. Quindi identificare l'aorta individuando le caratteristiche distintive di ramificazione dell'arco aortico e transettarla appena prossimale al decollo dell'arteria succlavia usando forbici affilate e fini. Ora afferra delicatamente l'aorta transettata usando una pinza curva fine stile gioielliere e cannulare con cura l'aorta con un ago smussato calibro 26, facendo attenzione a non danneggiare la valvola aortica.
Usando una pinza curva fine, afferrare l'aorta attorno alla cannula e iniziare la perfusione retrograda per limitare il tempo ischemico. Chiedi all'assistente di afferrare le estremità della sutura legata liberamente e di intrappolare con cura l'aorta attorno alla cannula. Stringere la sutura sopra o sotto la pinza curva fine, quindi stringere la sutura e confermare l'adeguatezza del flusso coronarico.
Scollegare il tubo ad alta pressione dall'apparecchio Langendorff, afferrare il mozzo della cannula e scollegare l'ago smussato dal tubo di estensione ad alta pressione. Quindi collegare rapidamente il mozzo della cannula all'apparecchio. Una volta che il cuore è appeso all'apparato di Langendorff nella posizione abituale, viene confermata un'adeguata perfusione.
Tagliare con cura il polmone, il timo e il tessuto in eccesso. Quindi incidere l'atrio destro per consentire all'effluente del seno coronarico di gocciolare liberamente. Fai un piccolo nodo alla fine di una sutura di seta 5-0, quindi fora un piccolo pezzo di pellicola di paraffina con l'ago e fai scorrere la paraffina fino all'estremità annodata.
Passare con attenzione l'ago attraverso l'apice del ventricolo e tirare la sutura attraverso il cuore fino a quando il film di paraffina è aderente alla parete laterale del ventricolo. Passare l'ago attraverso l'apertura della camicia riscaldante riempita d'acqua dell'apparato Langendorff in modo che il cuore possa essere racchiuso e riscaldato. Quindi collegare l'ago al trasduttore di forza evitando la flebo del seno coronarico.
Regolare la sutura per applicare da uno a due grammi di tensione basale come indicato dalla tensione diastolica o dal tracciamento dell'intenzione del nadir. Quindi posizionare gli elettrodi di superficie sui poli superiore e inferiore del cuore per registrare l'elettrocardiogramma. Infine, campionare l'effluente del seno coronarico per l'analisi utilizzando un catetere endovenoso a 24 gauge.
Gli elettrodi di superficie sono stati utilizzati per registrare un elettrocardiogramma continuo, che ha permesso di determinare la velocità e il ritmo intrinseci. Tutti i cuori adeguatamente perfusi battono spontaneamente a ritmo sinusale. Questa strategia di perfusione ha soddisfatto le esigenze metaboliche del cuore di topo appena nato, data la produzione trascurabile di lattato e la bassa percentuale di estrazione di ossigeno e consumo di glucosio.
Sono state registrate e calcolate anche le medie variabili fisiologiche, come la frequenza cardiaca intrinseca media denervata e le pressioni medie di perfusione aortica osservate. Alcuni criteri di esclusione come il tempo necessario per iniziare la riperfusione, la durata dell'aritmia e la pressione di perfusione aortica devono essere considerati per garantire la coerenza della preparazione neonatale. Dopo l'instaurazione della perfusione, possono verificarsi interventi come la somministrazione di farmaci, l'induzione di danno da ischemia-riperfusione, alterazioni dei metaboliti o la somministrazione di agenti enzimatici per l'isolamento dei cardiomiociti.
