単一細胞および細胞内組織におけるグリコーゲン含有量の測定は、ほとんどの細胞タイプにおいて、単一細胞が変化する生理学的状態および疾患に異なる方法で適応するため、重要である。したがって、この技術の主な利点は、透過型電子顕微鏡における非常に高い分解能である。これは、局在化した細胞下構造を有する可能性を改善し、またここでのこの技術におけるこの含有量において、グリコーゲン染色が抗体フリーであることが重要である。
だから、私たちは心配する特異性を持っていません。グリコーゲンのコントラストを良くするには、フェロシアン化カリウムの代わりにフェロシアン化カリウム1.5%を使用してください。2ミリリットルのマイクロセントリフィケーションチューブ内の0.1モルカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒドを添加することによって、1.6ミリリットルの一次固定液溶液を調製する。
摂氏5度で最大14日間保管してください。筋肉生検または筋肉全体から、任意の方向に最大直径が1ミリメートルで、断面よりも縦方向に長い小さな標本を単離する。冷一次固定液を入れたチューブに検体を入れる。
摂氏5度で24時間保管してください。次いで、検体を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で4回洗浄する。トランスファーピペットを使用して、使用済みのバッファーをチューブから取り出し、検体に触れずに、新しいバッファーを追加します。
検体を1%四酸化オスミウムと1.5%フェロシアン化カリウムを0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液中で摂氏4度で120分間固定した。室温の二重蒸留水で検体を2回すすいでください。室温で段階的な一連のエタノールに沈めることによって脱水する。
前述の体積比を使用して、室温でプロピレンオキシドおよびエポシディック樹脂グレーディング混合物で試料を浸潤させる。翌日、100%新鮮なエポシディック樹脂に試料を型に埋め込み、摂氏60度で48時間重合します。試料のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。
表面のブロックをカミソリの刃でトリミングして、組織レベルに達します。ダイヤモンドナイフをサンプルの前に取り付け、サンプル表面をナイフに平行に揃えます。ダイヤモンドナイフで厚さ1マイクロメートルの半薄切片を作り、サンプルの向きを確認します。
半薄切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察する。次に、ブロックをさらにトリミングして関心領域を縮小し、適切な超薄断面を取得します。厚さ60~70ナノメートルの極薄切片を2本目のダイヤモンドナイフで切断する。
完璧なループを使用して、1つの銅グリッド全体に1〜2つのセクションを収集します。セクションを対比するために、グリッドを酢酸ウラニル溶液に20分間浸漬し、グリッドを二重蒸留水で洗浄してから、グリッドをクエン酸鉛に15分間浸漬し、グリッドを二重蒸留水で再洗浄する。透過型電子顕微鏡コンピュータと画像記録ソフトウェアの電源を入れ、デジタルスロースキャンCCDカメラと関連するイメージングソフトウェアでデジタル画像を記録します。
顕微鏡ステージに複数の切片を持つグリッドを挿入した後、最初に低倍率でグリッドをスクリーニングして最高品質の断面を選択し、筋線維の方向を決定します。次に焦点を合わせ、断面内の周辺繊維を中心とするビームを用いて30,000を超える倍率で画像を作成し、所望の倍率で1秒の露光時間で画像を記録する。画像がランダム化されたボットの体系的な順序でファイバーの長さと幅に分散されていることを確認し、偏りのない結果を得て、6 ~ 10 本のファイバーが画像化されるまでイメージングを繰り返します。
画像Jに画像をインポートするには、ファイルをクリックしてから開きます。[分析]をクリックして、画像の元のサイズと一致するようにグローバルスケールを設定し、スケールを設定します。画像を100%クリックするには、ズームに移動してクリックします。
ツールメニューから直線ツールを使用して筋原線維空間の画像ごとに1枚のZディスクの厚さを測定し、6〜10本の繊維の平均Zディスク厚さを計算します。セグメント化された線ツールを使用して、サブサルコレム領域のすぐ下に見える最も外側の筋原線維の長さを測定します。グリッドを挿入するには、[分析]をクリックし、[ツール]を選択してから[グリッド]を選択します。
次に、ポイントあたりの面積を32,400平方ナノメートルに設定します。十字がサブサルコレンマルグリコーゲンに当たる12のサブサルコレンマル画像で利用可能な長さ内のヒット数を数えます。[解析]をクリックしてグリッドを挿入し、ツールを選択してからグリッドを挿入し、ポイントあたりの面積を160,000平方ナノメートルに設定します。
十字が筋原線維内空間に当たる第12の筋原線維画像におけるヒット数を数える。もう一度、グリッドを挿入するには、[分析]をクリックし、ツールを選択してから[グリッド]を選択します。次に、ポイントあたりの面積を3,600平方ナノメートルに設定します。
筋原線維内グリコーゲンに十字が当たる第12筋原線維画像におけるヒット数をカウントする。[解析]をクリックしてグリッドを挿入し、ツールを選択してからグリッドを選択し、ポイントあたりの面積を32,400平方ナノメートルに設定します。クロスが筋原線維間グリコーゲンに当たる第12の筋原線維画像におけるヒット数を数える。
32、400平方ナノメートルのグリッドを使用してグリコーゲン粒子をランダムに選択し、左上の正方形から始めて、必要に応じて左に移動します。直線ツールを使用して、12枚の画像のそれぞれについて各プールのランダムに選択された5つのグリコーゲン粒子の直径を測定し、繊維当たりプール当たり平均60個の粒子を得た。この図は、3つのグリコーゲンプールの正常値を示す。
筋原線維間グリコーゲン値は正常に近い分布を示すが、筋原線維内グリコーゲンおよびサブサルコレンマルグリコーゲンの両方が、繊維が時々過剰な量のグリコーゲンを有する歪んだ分布を示すことが観察され得る。すべてのステップの中で、フェロシアン化カリウムを使用することは非常に重要です。グリコーゲンの分析は、ミトコンドリアおよび脂肪滴の分析と組み合わせることができ、他の重要な代謝成分がグリコーゲンおよび筋肉の健康とどのように相関するかの理解を改善することができる。
