この方法は、哺乳類の形成に沿ったガストルレーションを理解するための基本となるでしょう。長い間母体の子宮内に隠されてきた胚期に生きている胚の実験を可能にすることによって。それは、最大6日間の長期間にわたって子宮外のマウス胚の効率的かつ適切な成長を可能にし、継続する。
迅速かつ適切な胚解剖およびガス濃度および圧力の胃前投与は、胚の成長を成功させるための最も重要なステップである。7.5日齢以上の進行マウス胚の培養を開始するには、胚解剖の前に少なくとも1時間、ローラー培養インキュベーターシステムの回転子および加熱ユニットをオンにする。また、ガス導入管および出口試験管にオートクレーブ水を加える。
次に、メインスイッチを押してガスレギュレータモジュールの電源を入れ、各コントローラを使用して酸素と二酸化炭素の値を5%に設定し、ガスレギュレータを開き、圧力トランスミッタの電圧スイッチを動かしてガス圧力を約6.5〜7ポンド/平方インチに設定します。デジタル圧力計を使用してガス圧力値を確認します。精密インキュベーター内部に割り当てられた出口水充填試験管内に生じた気泡の速度をチェックして、ガスの流れを監視します。
ウォーターボトルの蓋のガスフローバルブを開閉して、適切な気泡率を設定します。ガス流が毎秒2〜4個の気泡の割合で気泡の形成を可能にすることを確認するか、バブリングが水で満たされた出口チューブに出てくる最初の点に気泡流を設定する。次に、培養瓶に2ミリリットルの培養液を充填する。
くり抜いたシリコンバンを使用してボトルを密封し、くり抜いた回転ドラムに差し込んで1時間の事前平衡化を行います。回転ドラム内の空きスペースは、固体バンズを使用して密閉してください。次に、安楽死させた妊婦マウスから胚を解剖する。
70%エタノールで腹部をきれいにし、はさみを使って皮膚と腹壁をカットします。子宮の一端を見つけて、卵巣と子宮の交点で切断します。反対側まで子宮に沿って切断を続け、DPBSで満たされた100ミリメートルのペトリ皿に移します。
DPBSの概念をすばやく洗い流し、胚の取り扱いを容易にするためにペアで切断します。概念のすべてのペアを60ミリメートルのペトリ皿で事前に平衡化された解剖媒体に移動し、個々の概念に切り込みます。次に、一対の肉眼的鉗子を用いて、子宮組織を引き裂くことによって概念の子宮壁を除去し、次いで、微細な顕微手術用鉗子を用いて、洋ナシ状の脱落膜の先端を切断する。
胚の横の鉗子をその長軸に平行に挿入し、鉗子を開いて脱落膜を半分に分割する。最後に、細かい鉗子を使用して、胚を脱落膜から把持し、頭頂卵黄袋を胚から剥がし、無傷の外胎盤錐体を卵筒に付着させたままにする。神経プレートまたは初期の頭部折り畳み段階において、エピブラストに損傷を示さない胚を選択する。
ボトルごとに5〜6個の選択された胚を予め平衡化されたガラス培養ボトルに移し、5%酸素および5%二酸化炭素の雰囲気下で、37°Cの回転培養システムにボトルを置く。胃前胚および初期胃形成胚および静的プレートを培養するために、新たに調製した250マイクロリットルの子宮外胚培養培地を8ウェルプレートの各ウェルに加える。プレートを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーター内に置き、事前平衡化を行います。
前述のように子宮から胚を解剖した後、マイクロピペットを使用して個々の胚を8ウェルプレートの各ウェルに移し、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベーター内に置きます。胚を実体顕微鏡で画像化し、明らかな損傷がなく、ライヒャートの膜のない、よく形成された羊膜を有するもののみを培養用に選択する。このプロトコールに記載されている7.5日齢の胚に対するローラー培養条件は、4培養日後に75%に近い平均効率で一定かつ正常な胚増殖を支持する。
胚発生の効率は、多様なマウスの遺伝的背景によって異なるが、一貫して堅牢である。HCSの代わりにHBSを補充すると、培養の4日後に約68%の効率が得られる。6.5個の胚および静的プレートの発生は、HCSおよびHBSの両方を有する子宮外胚培養培地を使用して、90%以上の効率で正しく反復される。
前胃胚から始まる培養は、初期のソマイト段階までの適切な発達の46%の効率を示し、胚のほぼ17%は培養の6日後に適切な発達を完了する。形態形成および組織発達は、42個のソマイトまで適切に進行する。胚発生日目7.5、6.5、および5.5から開始された培養物について胚において観察された代表的な発生欠陥をここに示す。
エピブラストに軽微な損傷を有する胚またはライヒェルトの膜を保持する胚は廃棄されるべきである。初期胚は適切に成長せず、または重度の発達遅延を示すが、プレートの表面に胚エピブラストが付着すると、さらなる胚発生の失敗を引き起こす。欠陥のある胚で観察される主な異常は、卵黄袋の外側の後領域の発達または神経ひだの成長における欠陥である。
5.5日齢の胚から発達した培養物では、発生欠陥が頻繁に観察され、小さな未発達のエピブラストの存在である。この方法を使用して、研究者は移植後の胚を開発する際に様々な物理的または化学的操作を実行することができる。例えば、操作、細胞移植、または系統追跡。
この方法は、マウスの着床後発達を非常に詳細に研究するだけでなく、ヒトなどの他の種の胚にも同様の培養方法を実装するための道を開く。
