このプロトコルの全体的な目標は、再現不可能な坐骨神経クラッシュの実行に関与する手順を記述し、末梢外傷後の運動行動の評価のためのプロトコルを提供することである。強力で信頼性の高い行動テストバッテリーの選択は、行動の側面の広い範囲をカバーするために不可欠であり、使用される動物モデルと科学的研究の質問に依存します。このプロトコルは、坐骨神経クラッシュ傷害を実行する方法を詳細に説明し、オープンフィールドテスト、CatWalk歩行分析、ビームウォーキングタスク、およびラダーラングウォーキングタスクを含むラットの運動障害の評価のための行動テストバッテリーを提供する。
動物実験は、動物のケアおよび使用に関する適用可能な国家および制度的ガイドラインに従って行われた。外科手術全体で無菌環境を維持する。必要な機器を使用して手術台を設置します。
イオブルランを用いた閉じたキャビネットでラットを深く麻酔し、右後肢の広い領域を剃る。次に、ラットを麻酔マスクに入れ、イオブルランで深部麻酔を続ける。胴体とネズミの後肢をテープで固定します。
両後肢を対称的で伸長した位置に置き、各足を手術台に平らにします。剃った部分の皮膚を適切な消毒剤で消毒する。回腸の坐骨神経座のノッチを検索します。
坐骨切りからメスで足の方向に皮膚切開を行います。後肢が固定され、皮膚切開が正しく行われると、大殿筋と上腕二頭筋の間の筋膜内の空洞が白線に似ているのが分かる。閉じた超微細止血鉗子をキャビティに挿入し、鉗子を広げます。
筋膜面は筋肉組織を傷つけずに開く必要があります。皮膚切開を開いたままにするために、筋肉の下にゴムバンドレトラクターを置きます。神経が完全に露出するまで、坐骨神経から周囲の組織や血管をそっと取り除きます。
全体の手順の間に神経を伸ばしたり引っ張ったりしないことが重要です。一定かつ迅速な使用可能な圧力で非鋸歯状クランプで坐骨神経を粉砕します。このためには、クランプを開き、クランプの下顎に神経を置き、クランプを3 x 10秒間最初の位置に固定してクランプを閉じます。
クラッシュの怪我の後、クランプを慎重に開き直します。坐骨神経のクラッシュ部位は半透明に見える。ゴムバンドレトラクターを取り外します。
蘇生可能な縫合糸で魅惑的な面切開を閉じます。ボディスキンステープルで皮膚切開を閉じます。この運動活動は、ラットの行動活性と同様に、オープンフィールドテストによって分析することができる。
暗くて静かな環境に位置するオープンフィールドの設定は、自動ビデオトラッキングシステム、EthoVision XT、および傷に強く、清掃可能な黒い表面を持つアリーナで構成されています。アリーナとカメラを正しい位置に配置し、EthoVision XTソフトウェアを設定します。テストアリーナの真ん中にそっとネズミを置きます。
記録中、実験者は、ラットの気をそらさないように、オープンフィールドの設定から離れて滞在する必要があります。オープンフィールドテストのデータ分析については、左側のサイドバーの分析セクションに移動し、[結果]タブの下で[ビジュアリゼーションの追跡]を選択します。次に、必要なパラメータをXLにエクスポートします。
CatWalk XTシステムによる歩行分析は、動物モデルの足跡、スタンスおよび歩行に関する多くの異なるパラメータを評価するのに役立ちます。ガラスの歩道は緑色の光で照らされ、動物の足跡によって散乱された光は、歩道の下に位置する高速ビデオカメラでキャプチャされます。信号はCatWalk XTソフトウェアで分析することができます。
実験は暗い条件下で行われなくてはなさ。CatWalk XTシステムを設定して起動します。実験設定を選択します。
カメラを所定の位置に置き、フォーカスを調整します。検出設定を設定します。CatWalk システムのコリドーウォールを設定し、壁が歩道に平行であることを確認します。
歩道の長さを定義し、歩道を調整します。次に、背景画像をスナップします。背景画像には、清潔で空の歩道が必要です。
ネズミは中断することなく歩道を横切る必要があります。定義された実行基準に従って、データ分析にはラット当たり3つの準拠実行が必要です。実際の実験を始める前に、少なくとも8日間動物を訓練してください。
CatWalkは、タスクの継続的なパフォーマンスを確保するために、6から10の実行で、少なくとも週に1回実行する必要があります。データ分析の場合は、準拠した実行のみを評価します。CatWalk XT ソフトウェアを使用して、足のプリントを自動的に分類します。
足の印刷ラベルを手動で確認します。間違った足のプリントラベルを修正し、検出されていない足のプリントのラベルを追加し、ノイズや間違ったラベルを削除します。XL シートに表示される数値結果は、いくつかの基本パラメータを示しています。
各フットプリントの詳細については、後足のつま先を分類してください。この解析には、インタラクティブなフットプリント測定モジュールが必要です。フットプリント解析のマーカーを手動で設定します。
3 つの準拠した実行ですべての後ろ足の印刷を分析します。つま先の最初の中心から5番目のつま先の中心に線を引き、つま先の広がりを測定します。2番目のつま先の中心から4番目のつま先の中心に線を引き、中立のつま先の広がりを測定します。
3番目のつま先の中心から後ろ足のかかとまで線を引き、手動印刷の長さを測定します。別のシートに表示されるインタラクティブフットプリント測定の数値結果を確認します。歩行の赤字はビーム歩行作業によって決定することができる。
この特定の研究トピックにおけるビーム歩行作業の焦点は、モータバランスの評価ではなく、運動協調の分析です。ビーム歩行作業には、ビーム、スペーサー、テーブル、均一な背景、およびビデオカメラが必要です。木製の梁は、長さ90センチ、幅1.7センチメートル、高さ2センチメートルの木製の梁を使用してください。
動物を7日間訓練する。梁のスタートプラットフォームにラットを置きます。ラットは、任意の中断することなく、ビームを3回横断する必要があります。
ラットが最初の 3 回の実行内で 3 つの準拠の実行に達した場合でも、継続的なタスクパフォーマンスのために、最低 6 から 10 の実行を実行する必要があります。録画から3つの準拠ランのビデオシーケンスを選択します。選択した 3 つの準拠した実行の開始時間ポイントと終了時間を定義します。
ここでは、開始タイム ポイントは梁の黒い線でラベル付けされ、黒い線の後ろの最初の後ろ肢の配置は、実行の開始時点として定義されます。梁の終点のプラットフォーム上の最初の後肢の配置は、終了タイムポイントを定義します。次に、ラットがビームを横切るのに必要な時間を計算します。
ソフトウェアのズームとスローモーション機能を使用して、両方の後肢の3つの準拠した実行からステップ数とエラー数を個別にスコアリングします。エラーには、合計フットスリップとハーフフットスリップが含まれます。総足のスリップは、深いスリップが続く足の配置として定義され、影響を受けた足とビームとの接触が失われます。
半分のスリップは完全な接触を失うことなくビームの側壁から滑り落ちる足として定義される。ビームを交差するステップ数に対する足のスリップの割合を計算します。ラダーラング歩行作業は、運動機能、前肢と後肢の両方の配置、および四肢間の調整を評価することができます。
この動作テストには、ラダーラン装置、スペーサ、テーブル、均一な背景、ビデオカメラが必要です。水平文字ラング装置は、金属ラングと透明なポリカーボネートのサイドウォールで構成されています。8日間動物を訓練します。
ラダーランオペレータの開始ゾーンにラットを配置します。ラットは、準拠の走行として資格を得るために、はしごラン装置の100センチメートルの歩道を中断することなく3回横断する必要があります。録画から3つの準拠ランのビデオシーケンスを選択します。
選択した 3 つの準拠した実行の開始時間ポイントと終了時間を定義します。装置の側壁の最初の黒い線の後ろに後肢の配置は、走行の開始時点を定義する。装置の側壁の第2の黒い線の後ろに第1の前肢の配置は、走行の終点を定義する。
次に、歩道を横切る走行時間を計算します。ソフトウェアのスローモーションまたはフレームごとの機能を使用して、Metsと同僚の7カテゴリスケールで3つの準拠したランをスコア付けします。各四肢のスケールのカテゴリに応じて、ステップ数とエラー数を個別に決定します。
スケールは、次のカテゴリを区別します。合計ミス。深いスリップ。
わずかなスリップ。置換.修正.部分的な配置。そして正しい配置。
次に、ステップごとのエラーを計算します。5分間のオープンフィールドテストの代表的な結果は、手術後5週間の神経クラッシュ傷害が運動活動に影響を及ぼさないことを示している。CatWalk XTシステムを用いた歩行解析では、多くの異なるパラメータが生成されます。
走り平均速度、ストライド長、および神経損傷の右後足の印刷領域に対して有意な変化を検出することができた。神経損傷を受けた野生型ラットは、損傷後5週間の野生型ナイーブラットと比較して、ビームを横切る待ち時間が有意に増加した。ビーム歩行作業の追加の読み出しとして、神経損傷した後肢の完全なスリップと半分のスリップがカウントされ、統計分析のエラーとして考慮された。
神経損傷を受けた右後肢のステップあたりの誤差の割合は、野生型のナイーブラットと比較して、神経損傷を受けた野生型ラットで有意に増加した。ラダーラング歩行タスクの代表的なデータは、ラダーラン装置の歩道を横断する待ち時間、または神経損傷した右後肢のステップあたりの誤差の割合に有意な変化を示さない。神経損傷した後肢のステップあたりの誤差率の分析は、メッツと同僚からの7カテゴリスケールの0から2までのスコアのみを考慮した。
このビデオを見た後、坐骨神経クラッシュ傷害を行う方法と、一方的な坐骨神経クラッシュ後のラットの運動行動の多因子評価を実装する方法をよく理解する必要があります。坐骨神経クラッシュ傷害後に一貫した再現性と同等の結果を達成するためには、神経クラッシュを誘導するための標準化された方法が不可欠であり、標準化された表現型特性化も欠かせません。特定の行動テストに適したトレーニングを行うことにより、実験評価の時間を節約し、より良い結果を得ることができます。
