פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם RNA והגדרת NMR למדידות פיזור הרפיה של פרוטון R1rho כדי לבחון חילופי אישור במולקולות RNA. מאז פרוטונים נחקרים, השיטה אינה זקוקה לתיוג איזוטופי ויכולה לגשת לתכונות מבניות כמו שיוך בסיס מוזז ישירות. הפיפטה היא מודולרית למדי במובן זה פיזור הרפיה R1rho ניתן למדוד גם אם המדגם מיוצר בשיטה אחרת.
התחל בהכנת דגימת הפלסמיד והקמת תגובת תמלול ויוחן ומחשוף כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור על התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לדלל microliter אחד של המדגם פי עשרה בתמיסת טעינה.
ולהפעיל microliter אחד על ג'ל דף denaturing. אם תגובת המחשוף מוצלחת, שנה את קנה המידה של התגובה לנפח הרצוי והפעל אותו בן לילה. לאחר מכן הפעל ג'ל PAGE דנטורינג נוסף ולהעריך אם תגובת המחשוף הושלמה.
במקרה של מחשוף לא שלם, לחמם את פתרון התגובה במיקרוגל קונבנציונאלי ב 450 וואט במשך 15 שניות. ואז לקרר את הפתרון לאט ל 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לתזנות מחדש את הרנ"א ואת מדריך המחשוף. ושימו לב להיווצרות של משקעים חדשים.
הוסף עוד pyrophosphatase אנאורגני ו RNase H.Incubate התגובה במשך שעה עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אשר את השלמת תגובת המחשוף עם דף denaturing. כאשר תגובת מחשוף RNase H הושלמה, להרוות את התגובה על ידי הוספת EDTA לריכוז סופי 50 מילימולר.
ומערבולת ביסודיות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון. ולרכז את הפתרון לאמצעי אחסון להזרקה למערכת HPLC לטיהור.
לפני הוספת המדגם המרוכז והמטוהר לצינור NMR, לנקות את הצינור על ידי שטיפה עם מים בשפע. ואז ריאגנט טיהור RNase, מים, ו 95%אתנול. לאחר השטיפה הסופית במים, להשאיר אותו לייבוש.
יש לשטוף את הבוכנה במים ולהשתמש במחיקה ללא מוך לניקוי עם טיהור RNase reagent ו-95%אתנול. לאחר ייבוש הצינור ואת הבוכנה, להוסיף 10% D2O לדגימת NMR. השתמש קצה פיפטה גדול כדי להעביר את דגימת ה- RNA לתוך צינור NMR, זורם אותו לאורך הצד של קיר הצינור.
הכנס את הבוכנה לתוך הצינור על ידי דחיפת אותו למטה עם תנועה פיתול מהירה כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן למשוך את הבוכנה למעלה לאט מבלי ליצור בועות אוויר חדשות. ולתקן את זה עם סרט שעווה פרפין. צור ערכת נתונים חדשה המבוססת על ערכת נתונים ארומטית של פחמן פרוטון HSQC המשמשת בדגימות RNA עם תוויות מלאות להקצאת RNA.
הגדר את הפרמטרים הכלליים ואת הפרמטרים הספציפיים RD. ואז להגדיר כוח נעילת ספין פרוטון ל 1.2 קילוהרץ לבדיקה. צור רשימת VD לבדיקה עם ערך אחד בלבד, אפס אלפיות שניה, הגדר את TDF1 לאחד ועדכן את D30 כדי להפעיל ספקטרום בדיקה.
לאחר הגדרת רשימת VD בדיקה, עדכן D30 ו- TDF1. ולתוות את עוצמת הפסגה לאורכים שונים של נעילת ספין. זהה את אורך נעילת הסיבוב שבו עוצמת השיא המקורי יורדת לשליש.
מהתוצאה של ריצות הבדיקה, צור את רשימת VD הסופית לשימוש בניסוי. בחר את מספר הסריקות כך שהשיא החלש ביותר ברשימה יהיה בעל יחס אות לרעש של 10 לפחות. התוצאות של מספר תגובות מחשוף של תמלילי טנדם מוצגים כאן.
RNA יעד נוקלאוטיד 20 נוצר בתגובה מוצלחת. תגובות לא מוצלחות גרמו למחשוף לא שלם ונכשל של המדגם. הזרקת HPLC של דגימת הרנ"א חשפה שיא עבור RNA מטרה טהורה ב 38 דקות.
בעוד מוצרים ארוכים וקצרים יותר הופרדו היטב משיא העניין. ניתוח סיכת הראש של הרנ"א הראה כי מספר הפרוטונים של האימינו שנצפו תאם את מספר הפרוטונים האימינו הצפויים מסימולציית מבנה משנית. ספקטרום הפחמן הפרוטוני HSQC של התהודה הארומטית של הרנ"א הראה ארבעה אותות לאחר הקיפול.
ורק שלושה אותות לפני הקיפול. בנציג על עקומות תהודה המתקבלים עבור שני אטומי H8 שונים ושני סיכות שיער RNA סינתטי שונים, G6H8 חווה חילופי אישור. בעוד A4H8 לא.
עבור G6H8, נבחרו כוחות נעילת הסיבוב הצבעוניים ונרשמו נתוני תהודה כבויים. במבנה CG שבו ההחלפה איטית, ערכי השורה R1rho לעומת חלקת היסט כבר הציגו א-סימטריה קלה של העקומה, המציינת את הסימן של הפרש השינוי הכימי דלתא אומגה. זה הופך להיות אפילו יותר ברור בעלילת R2 פלוס REX שבו תרומת R1 מוסרת.
מצד שני, מבנה GC חווה החלפה מהירה יותר וערכי R1rho לעומת חלקת היסט הציגו עקומה רחבה יותר שבה החילוץ של אומגה דלתא הופך פחות ברור אפילו בחלקת R2 פלוס REX. לאחר שהדינמיקה של הרנ"א התבהרה, ניתן לאפיין וללכד את המדינות. מצבים לכודים אלה יכולים, למשל, להיבדק בבדיקות ביולוגיות.
שיטה זו מאפשרת לנו להתבונן בשינויי זיווג בסיס פונקציונליים ורלוונטיים בקומפלקס מיקרו-רנ"א פעיל, סידורים מחדש של לולאות ברנ"א ריבוזומלי ויציבות זוג בסיס של בליטות נוקלאוטיד בודדות.
